方法文章

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

DOI：

10.3791/63377

⸱

2022年2月18日

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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此处基于TIRF显微镜的 体外 介绍了一种重建实验方法，可同时定量并比较两种微管群体的动力学。该方法能够同时观察多种微管相关蛋白在交联的微管束和单根微管上的集体活性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管是由αβ-微管蛋白异源二聚体聚合而成的多聚体，在细胞内组装成不同的结构。基于微管的结构和网络通常包含具有不同动态特性的微管阵列亚群。例如，在分裂期细胞中，稳定的交联微管束与动态的非交联微管在空间上紧密共存。基于全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）的 体外 重组研究能够同时可视化这些不同微管阵列的动力学行为。在该实验中，构建一个成像腔室，其中表面固定的微管以单根纤维形式存在，或被交联成有序结构 束。通过引入微管蛋白、核苷酸和蛋白质调节因子，可直接观察相关蛋白以及单根和交联微管的动力学特性。此外，还可实时监测动态的单根微管组装成束过程中的变化。本文所述方法可在相同实验条件下，系统评估单个蛋白质的活性与定位，以及蛋白质调节因子对两种不同微管亚群的协同作用，从而提供其他方法无法获得的机制性见解。

引言

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微管是形成多种细胞过程所必需的结构支架的生物大分子聚合物，这些过程包括细胞内运输、细胞器定位、细胞分裂和细胞伸长。为了执行这些多样化的功能，单个微管被组织成微米尺度的阵列，例如有丝分裂纺锤体、纤毛轴丝、神经元束、间期阵列以及植物皮层阵列。在这些结构中普遍存在的一种构型特征是微管沿其长度方向通过交联形成的束状结构1。若干基于微管的结构具有一个引人注目的特点，即在空间上紧密相邻的区域内，既存在成束的微管，也存在未交联的单根微管。这些不同的微管亚群可根据其正常功能的需要，表现出显著不同的聚合动力学行为2,3,4,5。例如，在有丝分裂纺锤体中，稳定的交联微管束与动态的单根微管共存于细胞中心的微米级区域内6。因此，研究共存微管群体动态特性的调控机制，对于理解基于微管结构的组装与功能至关重要。

微管是动态的多聚体，可在聚合与解聚阶段之间循环，并通过称为“灾变”和“救援”的事件在两种状态之间转换7。细胞内微管的动态行为受到多种微管相关蛋白（MAPs）的调控，这些蛋白可调节微管聚合与解聚的速率，以....

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方案

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1. 准备试剂

  1. 按照表1和表2中的说明配制缓冲液和试剂。实验过程中，除非另有说明，所有溶液均需置于冰上保存。
溶液组分推荐储存时长备注
5X BRB80400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 用 KOH 调节 pH 至 6.8，过滤除菌最长 2 年4 °C 保存
1X BRB8080 mM K-PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EG....

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结果

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上述实验使用了647 nm荧光标记的生物素化微管、560 nm荧光标记的非生物素化微管以及560 nm荧光标记的可溶性微管蛋白混合物。微管通过交联蛋白PRC1（GFP标记）进行交联。在表面固定形成微管束和单根微管后（步骤5.11），将成像腔室安装在配备100X 1.49 NA油镜的TIRF显微镜上，并在560 nm和647 nm荧光通道下进行观察。单根微管通过其在647 nm通道中的荧光信号进行识别。在两个通道中均显示荧光信号的微管被认定为预先形成的微管束（图4）。若实验中使用的生物素化与非生物素化微管带有相同的荧光标记，则检测到的微管束荧光强度约为单根微管的两倍或更高。根据各群体的比例和密度，可优化步骤5.6和5.10中微管成核种子的浓度。

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讨论

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本文所述实验显著拓展了传统微管重建实验的范围与复杂性，传统实验通常仅在单根微管或单一类型的微管阵列上进行。当前实验方法提供了一种可同时定量并比较微管相关蛋白（MAP）对两种微管群体调控活性的手段，即单根微管和交联成束的微管。此外，该实验方法还可用于研究两种类型的微管束：一种是在动力学起始前由稳定种子预先形成的微管束，另一种是在两个生长末端相遇并发生交联时新形成的微管束（图3）。不仅如此，除了传统的实验变量（如蛋白质浓度和缓冲液条件）外，该方法还能评估微管阵列几何特征的影响，例如微管束中相邻微管之间的长度和夹角，这些几何因素正逐渐被认识到是影响微管动力学和微管相关蛋白活性的重要决定因素16。

为了将此实验方法进一步拓展 体外 重组多种微管相关结构时，需解决以下关键问题：（i）PRC1 优先交联彼此呈反向平行排列的微管。尽管在有丝分裂过程中细胞中心存在此类反向平行的微管束，但在神经元轴突及有丝分裂纺锤体等其他微管结构中，平行排列的微管束则是常见特征。上述方案可轻.......

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披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，编号1DP2GM126894-01）的资助，以及佩韦慈善信托基金和史密斯家族基金会为R.S.提供的资金支持。作者感谢姜硕博士在方案的开发与优化过程中所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox）Sigma Aldrich238813
1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES）Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 盖玻片 Electron Microscopy Sciences63787
2-巯基乙醇（BME）Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 盖玻片Electron Microscopy Sciences63793
405/488/560/647 nm 激光四通道滤光片 ChromaTRF89901-NK
丙酮Sigma Aldrich320110
腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）Sigma AldrichA7699-5G
亲和素，NeutrAvidin® 生物素结合蛋白（Molecular Probes®）Thermo Fischer ScientificA2666
超声清洗仪：Branson 2800 CleanerBransonCPX2800H
Beckman Coulter 聚碳酸酯厚壁管，11 x 34 mmBeckman-Coulter 343778
Beckman Coulter 聚碳酸酯厚壁管，8 x 34 mmBeckman-Coulter 343776
生物素-PEG-SVA，分子量 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
牛血清白蛋白（BSA）Sigma Aldrich2905
过氧化氢酶Sigma AldrichC40
Corning LSE 小型微型离心机，AC100-240VCorning6670
精密操作擦拭纸Kimtech34120
二硫苏糖醇（DTT）GoldBioDTT10
发射滤光片ChromaET610/75m
乙醇（200 证明）Decon Labs2705
乙二醇四乙酸（EGTA）Sigma Aldrich3777
葡萄糖氧化酶Sigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物（GTP）Sigma AldrichG8877
Hellmanex III 清洗剂 Sigma AldrichZ805939
浸油，A型Fisher Scientific77010
κ-酪蛋白Sigma AldrichC0406
羊毛脂Fisher ScientificS25376
镜头清洁纸ThorLabsMC-5
氯化镁（MgCl2）Sigma AldrichM9272
甲基纤维素Sigma AldrichM0512
Microfuge 16 台式离心机Beckman-Coulter A46474
显微镜载玻片，钻石白玻璃，25 x 75 mm，90° 磨边，白色磨砂Globe Scientific1380-50W
mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，分子量 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP 台式超速离心机Beckman-Coulter 393315
石蜡Fisher ScientificP31-500
PELCO 反向（自闭合）精细镊子Ted Pella5377-NM
白凡士林Fisher Scientific18-605-050
等离子清洗仪，115VHarrick PlasmaPDC-001
氢氧化钾（KOH）Sigma Aldrich221473
碳酸氢钠Sigma AldrichS6014
蔗糖Sigma AldrichS7903
Thermal-Lok 单孔干式恒温器USA Scientific2510-1101
适用于 1.5 和 2.0 mL 管的 Thermal-Lok 模块USA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP 溶液，中性 pH；500 mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 油镜物镜NikonCFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF 显微镜NikonEclipse Ti
TLA 120.1 转子Beckman-Coulter 362224
TLA 120.2 转子Beckman-Coulter 357656
微管蛋白（>99% 纯度）：猪脑来源CytoskeletonT240
生物素标记微管蛋白：猪脑来源CytoskeletonT333P
荧光标记微管蛋白（HiLyte 647）：猪脑来源CytoskeletonTL670M
荧光标记微管蛋白（X-罗丹明）：牛脑来源CytoskeletonTL620M
VECTABOND® 试剂，组织切片粘附剂Vector BiolabsSP-1800-7
VWR® 便携式培养箱，120V，50/60Hz，0.6AVWR97025-630

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

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