Method Article

通过TIRF显微镜 在体外 同时可视化交联和单微管的动力学

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

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在这里，提出了基于TIRF显微镜 的体外 重建测定，以同时量化和比较两个微管群体的动力学。描述了一种同时观察多个微管相关蛋白在交联微管束和单个微管上的集体活性的方法。

Abstract

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微管是αβ-微管蛋白异源二聚体的聚合物，在细胞中组织成不同的结构。基于微管的架构和网络通常包含动态属性不同的微管阵列子集。例如，在分裂细胞中，稳定的交联微管束与动态非交联微管紧密共存。基于TIRF显微镜 的体外 重建研究能够同时可视化这些不同微管阵列的动力学。在该测定中，成像室与表面固定的微管组装在一起，这些微管要么以单丝形式存在，要么组织成交联束。微管蛋白、核苷酸和蛋白质调节剂的引入允许直接可视化相关蛋白质以及单个和交联微管的动态特性。此外，可以实时监测动态单个微管组织成束时发生的变化。这里描述的方法允许系统地评估单个蛋白质的活性和定位，以及在相同的实验条件下蛋白质调节剂对两个不同微管子集的协同作用，从而提供其他方法无法获得的机制见解。

Introduction

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微管是生物聚合物，形成对多种细胞过程至关重要的结构支架，从细胞内转运和细胞器定位到细胞分裂和伸长。为了执行这些不同的功能，单个微管被组织成微米大小的阵列，例如有丝分裂纺锤体，睫状轴突，神经元束，相间阵列和植物皮质阵列。在这些结构中发现的无处不在的建筑图案是一束沿其长度交联的微管1。几种基于微管的结构的一个有趣的特征是捆绑的微管和非交联的单个微管在紧密的空间接近中共存。这些微管亚群可以显示出彼此截然不同的聚合动力学，这取决于其正常功能的需要2，3，4，5。例如，在有丝分裂纺锤体内，稳定的交联束和动态单个微管存在于细胞中心的微米级区域内6。因此，研究如何指定共存微管群的动态特性是理解基于微管的结构的组装和功能的核心。

微管是动态聚合物，在聚合和解聚阶段之间循环，在称为灾难和救援的事件中在两个阶段之间切换7。细胞微管的动力学由无数的微管相关蛋白（MAPs）调节，这些蛋白调节微管聚合和解聚的速率以及灾难和救援事件的频率。由于光学显微镜中空间分辨率的限制，研究MAPs在细胞空间近端阵列上的活....

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Protocol

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1. 制备试剂

  1. 制备缓冲液和试剂，如 表1 和 表2所述。在实验过程中，除非另有说明，否则请将所有溶液保持在冰上。
溶液组件建议存储持续时间笔记
5X BRB80400 mM K-PIPES， 5 mM MgCl2， 5 mM EGTA， pH 6.8， KOH， 过滤器灭菌长达 2 年储存于 4 °C
1X BRB8080 mM K-PIPES， 1 mM MgCl2， 1 mM EGTA， pH 6.8
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Results

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上述实验使用647nm荧光团标记的生物素化微管，560nm氟团标记的非生物素化微管和560nm氟团标记的可溶性微管混合物进行。微管通过交联蛋白PRC1（GFP标记）交联。在产生表面固定束和单个微管（步骤5.11）后，将成像室安装在TIRF 100X 1.49 NA油物镜上，并在560nm和647nm荧光通道中观察。通过它们在647 nm通道中的荧光信号鉴定单个微管。在两个通道中具有荧光信号的微管被鉴定为预先形成的束（图4）。如果使用具有相同荧光标记的生物素化和非生物素化微管进行实验，则检测到的束的荧光强度将约为单个微管的两倍或更高。根据每个群体的比例和密度，可以优化步骤5.6和5.10中微管种子的浓度。

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图4:在视野.......

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Discussion

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这里描述的实验显着扩展了常规微管重构测定的范围和复杂性，传统上在单个微管或一种类型的阵列上进行。目前的测定提供了一种同时定量和比较两个群体（即单个微管和交联束）上的调节MAP活性的方法。此外，该测定允许检查两种类型的束:那些在动力学开始之前从稳定的种子预先形成的束，以及那些在两个生长端彼此相遇并交联时新形成的束（图3）。此外，除了传统的实验变量（例如蛋白质浓度和缓冲液条件）之外，这些测定还可以评估微管阵列几何特征的影响，例如束中相邻细丝之间的长度和角度，这些正在成为微管动力学和MAP活性的重要决定因素16。

为了将这种实验方法扩展到多个基于微管的结构的体外重建，需要解决以下关键问题:（i）PRC1优先交联双向双向的微管。虽然在有丝分裂期间在细胞中心发现这种束，但平行微管束是神经元轴突和有丝分裂纺锤体内其他基于微管的结构的共同特征。上述方案可以很容易地适应于使用重组交联剂如Kinesin-1和TRIM4610，

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Disclosures

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作者声明没有竞争利益。

Acknowledgements

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这项工作得到了NIH（编号1DP2GM126894-01）的资助，以及皮尤慈善信托基金和史密斯家庭基金会对R.S.的资助。作者感谢蒋硕博士对方案开发和优化的贡献。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
（±）-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸 （Trolox）Sigma Aldrich238813
1,4-哌嗪二烷磺酸 （PIPES）Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 盖玻片 电子显微镜科学63787
2-巯基乙醇 （BME）Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 盖玻片电子显微镜科学63793
405/488/560/647 nm 激光四频带 ChromaTRF89901-NK
丙酮Sigma Aldrich320110
腺苷 5'-三磷酸二钠盐水合物 （ATP）Sigma AldrichA7699-5G
亲和素、中性亲和素®生物素结合蛋白 （Molecular Probes®）Thermo Fischer ScientificA2666
浴超声仪：Branson 2800 清洁剂BransonCPX2800H
Beckman Coulter 聚碳酸酯厚壁管，11 x 34 mmBeckman-Coulter 
Beckman Coulter 聚碳酸酯厚壁管，8 x 34 mmBeckman-Coulter 
生物素-PEG-SVA，MW 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
血清白蛋白 （BSA）Sigma Aldrich2905
过氧化氢酶Sigma AldrichC40
康宁 LSE 微型微量离心机，AC100-240V康宁6670
精密任务湿巾Kimtech34120
二硫苏糖醇 （DTT）GoldBioDTT10
发射滤光片ChromaET610/75m
乙醇（200 度）Decon Labs2705
乙二醇四乙酸 （EGTA）Sigma Aldrich3777
葡萄糖氧化酶Sigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
鸟苷 5'-三磷酸钠盐水合物 （GTP）Sigma AldrichG8877
Hellmanex III 洗涤剂 Sigma AldrichZ805939
浸油，A 型Fisher Scientific77010
Kappa-酪蛋白Sigma AldrichC0406
羊毛脂Fisher ScientificS25376
镜片清洁纸ThorLabsMC-5
氯化镁 （MgCl2）Sigma AldrichM9272
甲基纤维素Sigma AldrichM0512
微量离心机 16 台式离心机Beckman-Coulter A46474
显微镜载玻片， 钻石白玻璃， 25 x 75mm， 90°研磨边缘，白色磨砂Globe Scientific1380-50W
mPEG-琥珀酰亚胺戊酸酯，MW 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™Max-XP 台式超速离心机Beckman-Coulter 
石蜡Fisher ScientificP31-500
PELCO 反向（自闭），细镊子Ted Pella5377-NM
凡士林，白色Fisher Scientific18-605-050
等离子清洗剂，115VHarrick 等离子PDC-001
氢氧化钾 （KOH）Sigma Aldrich221473
碳酸氢钠Sigma AldrichS6014
蔗糖Sigma AldrichS7903
Thermal-Lok 1位置干热浴USA Scientific2510-1101
Thermal-Lok块，适用于1.5和2.0 mL试管USA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™穿孔&贸易;Bond-Breaker™TCEP 溶液，中性 pH 值;500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 油物镜尼康CFI Apochromat TIRF 100XC油
TIRF显微镜尼康Eclipse Ti
TLA 120.1贝克曼-库尔特 
TLA 120.2 转子Beckman-Coulter 
微管蛋白（纯度>99%）：猪脑骨架T240
微管蛋白（生物素）：猪脑细胞骨架T333P
微管蛋白（荧光 HiLyte 647）：猪脑细胞骨架TL670M
微管蛋白（X-罗丹明）：牛脑细胞骨架TL620M
VECTABOND®试剂，组织切片粘附载体 BiolabsSP-1800-7
VWR®个人型培养箱，120V，50/60Hz，0.6AVWR97025-630
343778343776 牛393315体 性转子 362224357656细胞

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

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