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方法文章

使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

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DOI：

10.3791/63459

⸱

2022年4月6日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 3Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 4Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一组用于表征蛋白质与细胞或微囊泡膜相互作用的方法。

摘要

在人体内，大多数与免疫反应和血液凝固相关的重要生理反应均发生在细胞膜上。任何依赖膜的反应的重要第一步是蛋白质与磷脂膜的结合。目前已有采用荧光标记蛋白质和流式细胞术来研究蛋白质与脂质膜相互作用的方法。该方法可用于研究活细胞以及天然或人工磷脂囊泡中的蛋白质-膜相互作用。此方法的优势在于试剂和设备简单且易于获取。在该方法中，蛋白质通过荧光染料进行标记，但也可使用自制或商业化的荧光标记蛋白质。蛋白质与荧光染料偶联后，与磷脂膜来源（微囊泡或细胞）共同孵育，随后通过流式细胞术分析样品。所获得的数据可用于计算动力学常数和平衡解离常数 Kd。此外，还可利用特殊的校准微球估算磷脂膜上蛋白质结合位点的大致数量。

引言

生物膜将动物细胞的内部成分与细胞外空间分隔开来。需要注意的是，细胞生命周期中形成的微囊泡以及细胞器也均由膜结构包裹。细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。膜蛋白具有信号传导、结构支持、物质运输和黏附等多种功能。然而，脂质双分子层对于动物细胞与细胞外空间之间的相互作用同样至关重要。本文提出一种研究外源性蛋白质与脂质膜外周相互作用的方法。

动物细胞外膜层上发生的反应最显著的例子是血液凝固反应。血液凝固的一个重要特征是，所有主要反应均发生在细胞及其衍生的微囊泡的磷脂膜上，而非血浆中1,2,3。依赖膜的反应包括凝血启动过程（在内皮下层细胞、炎症内皮细胞或活化的免疫细胞的细胞膜上，由组织因子参与）；凝血级联反应中因子IX、X和凝血酶原的主要激活反应；凝血酶在活化的血小板、红细胞、脂蛋白和微囊泡膜上对因子XI的激活；蛋白C通路的反应；凝血酶在内皮细胞膜上被灭活的过程（由血栓调节蛋白辅因子、内皮蛋白C受体和硫酸乙酰肝素参与）；以及接触激活通路的反应（在血小板和某些微囊泡膜上，由未知辅因子参与）。因此，若不研究各种血浆蛋白与血细胞膜之间的相互作用，就无法深入研究血液凝固过程。

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于表征蛋白质与细胞或微囊泡脂质膜之间的相互作用。该方法最初被提出用于研究血浆与血小板及人工磷脂囊泡之间的相互作用。此外，大多数被研究的蛋白质可直接与带负电荷的膜磷脂相互作用，特别是与磷脂酰丝氨酸4,5。同时，也存在一些蛋白质，其与膜的相互作用是通过特异性受体介导的6。

流式细胞术的一个重要能力是在无需额外分离步骤的情况下区分游离配体与结合配体。细胞术的这一特性使得研究人员能够在终点研究配体的平衡结合状态，并有助于进行连续的动力学测量。该技术操作简便，不需要复杂的样品制备过程。流式细胞术已被广泛用于定量研究荧光肽、受体和G蛋白在完整或去污剂通透性中性粒细胞中相互作用的动力学过程7。该方法还可用于实时探索蛋白质-DNA相互作用以及核酸内切酶活性的动力学8。随着时间的发展，该技术已被用于定量研究高亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用，例如与纯化的脂质囊泡之间的相互作用9，或更广泛地，与在高效Sf9细胞表达系统中表达的膜蛋白之间的相互作用10。此外，已有定量方法被报道用于利用流式细胞术表征跨膜蛋白与脂质体之间的蛋白质-脂质体相互作用11。

该技术使用自制的校准微球，以避免使用 commercially available 微球7。先前使用的校准微球7专为荧光素设计，这在实质上限制了可用于蛋白质的荧光配体种类。此外，本文提供了一种新的方法，可用于获取和分析具有合理时间分辨率的动力学数据。尽管本方法以人工磷脂囊泡为例进行描述，但其在应用于细胞、天然囊泡或具有不同脂质组成的人工磷脂囊泡时，并无明显限制。本文所述方法可估算相互作用参数（kon、koff）和平衡参数（Kd），并有助于对膜上蛋白质结合位点数量进行定量表征。需注意，该技术仅能对结合位点数量提供近似估计。该方法的优点在于其相对简单、易于实施，并可适用于天然细胞以及天然和人工微囊泡。

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方案

1. 荧光蛋白标记

  1. 材料准备
    1. 制备 1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 9.0，于 4 °C，并在一周内使用。
    2. 使用前立即配制1.5 M盐酸羟胺缓冲液，pH 8.5。
    3. 配制10 mg/mL的荧光染料溶液（参见 材料表) 于二甲基亚砜中。
      注意：该溶液可在 -20 °C 保存一个月20 °C 在暗处。
    4. 将纯化的抗体或其他蛋白质配制成 1-10 mg/mL 的溶液。
      注意：避免使用含有铵离子或伯胺的缓冲液。通过透析将含有Tris或甘油的缓冲液置换为磷酸盐缓冲液（PBS）。叠氮化钠（≤3 mM）或硫柳汞（≤1 mM）不会显著影响偶联反应。
    5. 孵育凝胶过滤介质（参见 材料表）用于在室温下于PBS中过夜或在2小时内进行蛋白质纯化 60 °C将凝胶过滤介质加入离心柱中 0.2 µm 膜
  2. 根据待标记蛋白质的浓度，使用公式 (Eq) 计算每种反应所需的活性染料用量1).
    生化实验中染料标记的体积计算公式，使用浓度与摩尔浓度。
    其中 V染料 是染料储备液的体积；Cpr，Vpr 以及分子量（MW）pr 是蛋白质的浓度、体积和摩尔质量；MW染料 是染料的摩尔质量；100 是单位转换系数；MR 是反应体系中染料与蛋白质的摩尔比。
    注意：以下推荐的摩尔比（MR）适用于IgG标记反应：当抗体浓度为1-3 mg/mL时，MR = 40；当抗体浓度为4-10 mg/mL时，MR = 30。对于凝血因子，通常使用MR = 5。
  3. 偶联反应
    1. 在反应管中，将蛋白质溶液与体积为其1/10的1 M碳酸氢盐溶液混合。
    2. 加入所需量的荧光染料（见步骤1.2），并持续搅拌。
    3. 将反应混合物在室温下避光孵育约1小时，并持续搅拌。
    4. 对于每一个 200 µL 蛋白质溶液，加入 5 µL 1.5 M 盐酸羟胺
    5. 将反应混合物在室温下孵育约30分钟，避光并持续搅拌。
  4. 准备离心柱。
    1. 添加 500 µL 将用于蛋白质纯化的凝胶过滤介质装入层析柱。将层析柱在1,000 × g下离心3分钟。 g.
    2. 弃去收集管中的缓冲液。如果柱子未填满，请添加更多的凝胶过滤介质，并以1,000 × g离心柱子3分钟。 g重复此步骤直至柱子装满。
  5. 纯化
    1. 将反应混合物（来自步骤 1.3.5）在 17,000 × g 条件下离心 5 分钟 g 并去除沉淀物。
    2. 将上清液转移至含有凝胶过滤介质的离心柱中。让溶液充分渗入凝胶床。
    3. 使用一个空的收集管放置离心柱，于1,000 × g离心5分钟 g离心后，从收集管中收集标记的蛋白。
  6. 标记程度的测定
    1. 校正染料在吸光度测定时的贡献 A280 通过测量游离染料在280 nm处的吸光度（A280）以及 λ最大值 染料A最大）（见公式（2)).
      CF = A280 游离染料 / Amax 游离染料；公式；吸收分析；光谱学；染料浓度    (2)
    2. 在280 nm处测定蛋白-染料偶联物的吸光度（A280）以及 λ最大值 染料A最大）并使用公式（3).
      蛋白质浓度计算公式，\(C_{\text{protein}} = \frac{A_{280} - A_{\text{max}} \times CF}{\varepsilon_M} \times d\)，方程。    (3)
      其中 εM 是该蛋白质在280 nm处的摩尔消光系数； d 是测量吸光度时的光程长度； CF 染料在A处对吸光度的贡献280 （步骤 1.6.1）
    3. 使用公式（Eq）计算标记程度（DOL）4).
      蛋白质-染料偶联的标记程度计算公式；吸收度、浓度参数    (4)
      其中 εM 染料 是染料在 λ 处的摩尔消光系数最大 nm；d 为测定吸光度时的光程长度；C蛋白 是蛋白质的浓度（步骤 1.6.2）。

2. 磷脂囊泡的制备

  1. 脂质混合物的制备与保存
    1. 按适当比例混合脂质（磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱的摩尔比为20%至80%）。
    2. 通过冻干或蒸发去除溶剂，将脂质混合物干燥，并在惰性气氛下保存于玻璃安瓿瓶中。
  2. 脂质膜的制备
    1. 打开安瓿瓶，用少量氯仿（约100 µL）重新溶解脂质混合物。
      注意：氯仿用量不宜过多，因其无法完全挥发。
    2. 加入终浓度为0.2 mol%的DiIC16(3)乙醇溶液。将脂质混合物转移至圆底烧瓶中，通过旋转烧瓶使混合物均匀铺展于瓶壁。在氩气流下干燥脂质混合物30分钟。
  3. 脂质混合物的水合
    1. 向含有脂质膜的烧瓶中加入适量预热的水相缓冲液（20 mM HEPES，140 mM NaCl，pH 7.4，温度约55 °C），体积应与目标脂质浓度相对应。在55 °C下涡旋孵育30分钟，以确保充分水合。
    2. 将样品管置于冷冻设备或恒温设备中，使脂质悬浮液经历3–5次冻融循环。
  4. 通过挤出法制备脂质体
    1. 按照制造商说明组装挤出装置，并将所有组件预热至脂质混合物的相变温度。
    2. 取一支挤出器注射器，装入已水合的脂质混合物。静置5–10分钟，使脂质悬浮液温度与挤出装置温度达到平衡。
    3. 使脂质混合物至少通过膜过滤10次。最后一次挤出时，将脂质悬浮液转移至另一支注射器中，并观察溶液外观由微浊变为澄清。
    4. 将所得脂质体混合物在4 °C下保存，最好置于氩气或氮气等惰性气氛中，保存时间为3–4天。切勿冷冻。

3. 从全血中分离血小板

  1. 使用含有3.2%柠檬酸钠的采血管从健康供者采集全血。
  2. 向血液中加入前列腺素E1（PGE1）（1 µM）和腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）（0.1 U/mL），随后在室温下以100 × g 离心8分钟。
  3. 离心后，取富血小板血浆，并加入柠檬酸钠溶液（106 mM，pH 5.5），使血浆与柠檬酸钠的体积比为3:1。将血浆在室温下以400 × g 离心5分钟。
  4. 弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL不含BSA的Tyrode缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，2.7 mM KCl，1 mM MgCl2，0.4 mM NaH2PO4，2.5 mM CaCl2，5 mM葡萄糖，pH 7.4）中。通过血小板纯化用凝胶过滤介质进行凝胶层析，以去除血浆蛋白，纯化血小板（参见材料表）。

4. 通过流式细胞术检测蛋白质-脂质相互作用

  1. 动力学结合实验
    1. 将步骤 2.4.4 中的磷脂囊泡用 Tyrode 缓冲液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、0.4 mM NaH2PO4、2.5 mM CaCl2、5 mM 葡萄糖、0.5% BSA，pH 7.4）稀释至浓度为 1 µM，总体积为 250 µL。
    2. 取步骤 1 中的荧光标记凝血因子 X（fX-fd），浓度为 500 nM，与步骤 4.1.1 中的磷脂囊泡按 1:1 混合（最终囊泡浓度为 0.5 µM，fX-fd 中 fX 的浓度为 250 nM），总体积为 500 µL。
    3. 立即将 500 µL 混合悬液（以低流速分析约需 20 分钟）注入流式细胞仪。使用低流速，并将 FL2 通道（激发波长 488 nm，发射滤光片 585/42 nm）的阈值设为 200。测量 FL4 通道（激发波长 633 nm，发射滤光片 660/20）中来自材料表中荧光染料的平均荧光强度。
      注：选择无自动进样器的流式细胞仪，可加快样品注入检测池的过程。
    4. 当结合达到饱和（5 分钟内荧光无显著增加）时，迅速用 Tyrode 缓冲液将样品稀释 20 倍，监测解离过程直至荧光恢复至基线水平（完全解离）或达到平台期（5 分钟内荧光无显著下降）。
      注：作为对照，加入 10 µM EDTA 并监测完全解离过程持续 5 分钟。
  2. 平衡结合实验
    注：利用结合动力学曲线确定达到饱和所需时间；fX-fd 与人工囊泡的饱和时间为 20 分钟。
    1. 在 Tyrode 缓冲液中，将人工磷脂囊泡（5 µM）与不同浓度的 fX-fd（0 至 1,000 nM）共同孵育 20 分钟，用于结合实验。
    2. 将步骤 4.2.1 中的每个样品用 Tyrode 缓冲液稀释 20 倍，最终体积为 200 µL。在 30 秒内立即使用流式细胞术分析稀释后的样品。采用步骤 4.1.3 中的仪器设置。
      注：为检测非特异性结合，使用含 EDTA（10 µM）的类似样品并孵育 5 分钟作为对照。

5. 流式细胞术数据分析

  1. 从流式细胞术数据采集软件中以 FSC 格式导出实验数据至流式细胞仪分析软件（参见材料表）。选择文件 | 导出 | FCS 文件。通过在计算机中选中 FSC 文件并将其拖拽至软件工作区，即可在流式细胞仪分析软件中打开文件进行数据分析。
  2. 对微囊泡进行设门时，利用亲脂性染料 DiIC16(3) 的荧光信号确定微囊泡区域。使用工作表中的菜单命令或绘图按钮，在对数坐标下创建以 FL2（染料 DilC16(3)）为横轴的 SSC 点图。点击矩形设门按钮绘制设门区域，确保不含囊泡的对照样本中的事件不落入该区域（图 1B、C）。
  3. 分析动力学实验。
    1. 创建点图，以囊泡区域的荧光（FL4）随时间变化为坐标（双击第 5.2 步中的囊泡区域）。
    2. 将荧光随时间变化的数据以 csv 格式导出。选择样本 | 右键单击 | 导出 | 选择 FL4 和 参数中的时间 | 选择保存目录 | 选择 CSV 格式 | 导出。
    3. 在任意统计分析软件中打开 CSV 文件（参见材料表）。对每 1,000 个事件计算荧光和时间的简单移动平均值。
    4. 假设呈指数依赖关系，对简单移动平均荧光值随时间变化的曲线进行拟合（分析 > 拟合 > 非线性曲线拟合），并根据公式（5）计算动力学结合常数。
      描述随时间化学浓度变化的动力学方程，表示指数衰减过程。    (5)
      其中 [XB] 表示根据第 5.3.3 步的简单移动平均计算得到的每一时刻结合因子的浓度（用户自定义单位）；[X] 表示添加因子的浓度；[X]max 表示最大结合因子浓度；k 为结合常数；t 为时间。
    5. 重复相同的操作步骤（5.3.1–5.3.4），利用公式（6）计算动力学解离常数。
      指数衰减公式，动力学方程，浓度随时间变化，化学动力学。    (6)
      其中 [XB] 表示每一时刻结合因子的浓度；[X]0 表示初始时刻结合因子的浓度；k 为解离常数；t 为时间。
  4. 平衡结合实验
    1. 测定每个选定浓度的 fX-fd 在囊泡区域内的平均荧光强度。
    2. 假设为简单的单一位点结合，拟合结合因子荧光强度随添加因子浓度变化的依赖关系。基于至少三次独立重复实验，利用公式（7）计算平均结合参数。
      配体结合平衡公式示意图；用于生化分析中描述结合亲和力。    (7)
      其中 [XB] 表示结合因子的浓度；[X] 表示添加因子的浓度；nx 表示每个囊泡上表观结合位点数；Kd 为表观解离常数。

6. 将荧光强度转换为平均结合位点数

  1. 准备校准微球。
    1. 将凝胶过滤后的血小板（参见步骤 3.3）在室温下与 A23187（10 µM）和 CaCl2（2.5 mM）共同孵育 10 分钟。
    2. 向活化的血小板中加入不同浓度的 fX-fd（0 至 1,000 nM）。加入 2% v/v 甲醛，孵育 1 小时。随后在室温下用 3 M 甘氨酸和 5% BSA 处理血小板 30 分钟，以终止反应。
    3. 从混合物中纯化去除未反应的染料。将血小板在 400 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于含 0.5% BSA 的 Tyrode 缓冲液中。
      注：重复步骤 6.1.3 三次。
  2. 首先使用荧光分光光度计（针对材料表中所列荧光染料，激发波长 633 nm，发射波长 670 nm），然后使用流式细胞仪（FL4 通道：激发波长 633 nm，发射滤光片 660/20）测定各样本中校准微球的荧光水平。使用细胞计数器确定每个样本中微球的数量。
  3. 利用荧光分光光度计将各微球样本的荧光强度转换为可溶性荧光染料的浓度。根据公式（8）重新计算每个荧光染料分子对应的荧光染料浓度。
    化学量公式，\(N_x = C \times V \times N_A\)，用于计算物质的量。   (8)
    其中 Nx 为荧光分子数量；C 为荧光染料浓度；NA 为阿伏伽德罗常数；NA = 6.02214076×1023 mol -1。
  4. 使用任意统计软件（参见材料表），根据各样本中微球在流式细胞仪中的平均荧光强度（步骤 6.2）与其对应的荧光分子数量（参见步骤 6.3）绘制依赖关系图。通过线性比例拟合对该关系进行近似处理（分析 | 拟合 | 线性拟合）。根据公式（9）的拟合结果，计算平均荧光强度到结合位点数的转换因子。
    数学公式，MF=CF×N^x+b，用于数据建模或曲线拟合。    (9)
    其中 MF 为流式细胞术测得的微球平均荧光强度；Nx 为每个微球上的荧光分子数量；CF 表示平均荧光强度到结合位点数的转换因子。CF 和 b 由图形线性拟合结果获得。
  5. 使用公式（10）计算目标囊泡上表观结合位点数。
    指数方程图示，nx = (MF-b)/CF，用于说明化学动力学概念。    (10)
    其中 nx 为每个目标囊泡上的表观结合位点数；MF 为流式细胞术测得的目标囊泡平均荧光强度；CF 和 b 来自公式（8）中的转换因子。

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结果

本文所述的流式细胞术用于表征血浆凝血蛋白与活化血小板的结合。此外，采用磷脂囊泡PS:PC 20:80作为模型系统。本论文主要以人工磷脂囊泡为例进行说明。流式细胞仪的参数，特别是光电倍增管（PMT）电压和补偿设置，必须根据每台具体仪器、研究对象（细胞、人工或天然微囊泡）以及所用染料进行优化。图1B、C展示了对大小约为1 µm、并掺入脂溶性荧光染料DiIC16(3)的人工磷脂囊泡进行设门的示例。较大的囊泡尺寸和脂溶性荧光染料有助于通过流式细胞仪检测这些囊泡。设门依据是包含相同尺寸但不含荧光染料的人工脂质囊泡的样本（图1B）。分析中仅使用该门内事件的数据。

蛋白质与囊泡结合的动力学在第一阶段进行分析。该样品按照步骤4.1所述连续收集。典型的点状图如下所示 图1D-F使用流式细胞术软件对获得的数据进行分析。结果曲...

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讨论

该方法可适用于对来源于不同来源和组分的蛋白质与磷脂膜相互作用进行粗略表征。本文所述的定量流式细胞术在多个参数上逊于表面等离子共振（SPR）技术，尤其表现为灵敏度较低、时间分辨率较差，且需要对蛋白质进行荧光标记。荧光标记可能导致许多蛋白质构象改变或活性丧失，因此需进行严格对照。然而，该技术相较于其他方法具有显著优势：它能够研究蛋白质与天然细胞膜之间的相互作用，而此类研究难以通过SPR实现；此外，该方法可估算膜表面蛋白质结合位点的数量，在某些分析任务中具有较高效率。

市面上有针对某些荧光染料的商用微珠可用于计数结合位点。然而，许多广泛使用的染料尚无对应的商用微珠。因此，自制微珠是解决此问题的最佳方法。制备这些微珠所用的细胞与所有其他实验中使用的细胞相同。但由于微珠在洗涤过程中需要较高的离心速度，因此不能使用磷脂囊泡。不过，细胞或囊泡可被带有氨基反应性基团的微珠替代，后者可与所选染料进行偶联。操作步骤将与第6.1步中描述的步骤类似。

该定量流式细胞术方法的局限性与所用流式细胞仪的技术性能相关。已有三种不同型号的流式细胞仪（配备不同的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者受到俄罗斯科学基金会项目 20-74-00133 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A23187Sigma AldrichC7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher ScientificA37573荧光染料
马铃薯来源的腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）Sigma AldrichA2230
BD FACSCantoIIBD Bioscience
牛血清白蛋白VWR Life Science AMRESCOAm-O332-0.1
氯化钙，无水，粉末，≥97%Sigma AldrichC4901-100G
Cary Eclipse 荧光分光光度计Agilent
D-(+)-葡萄糖Sigma AldrichG7528-1KG
DiIC16(3)（1,1'-二十六烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）Thermo Fisher ScientificD384
DMSOSigma AldrichD8418
乙二胺四乙酸二钠盐VWR Life Science AMRESCOAm-O105B-0.1
FACSDivaBD Bioscience流式细胞术数据采集软件
FlowJoTree Star用于数据分析的流式细胞仪软件
HEPESSigma AldrichH4034-500G
人凝血因子 XEnzyme researchHFX 1010
盐酸羟胺Panreac141914.1209
L-α-磷脂酰胆碱（脑组织，猪源）Avanti Polar Lipids840053P
L-α-磷脂酰丝氨酸（脑组织，猪源）（钠盐）Avanti Polar Lipids840032P
氯化镁Sigma AldrichM8266-100G
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951OriginLab Corporation统计分析软件
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，生物技术级VWR Life Science AMRESCO97062-732
氯化钾Sigma AldrichP9541-500G
前列腺素 E1Cayman Chemical13010
Sephadex G25GE HealthcareGE17-0033-01用于蛋白质纯化的凝胶过滤介质
Sepharose CL-2BSigma AldrichCL2B300-500ML用于血小板纯化的凝胶过滤介质
碳酸氢钠Corning61-065-RO
氯化钠Sigma AldrichS3014-500G
磷酸二氢钠Sigma AldrichS3139-250G
带 0.2 µm 膜的离心柱SartoriusVS0171
柠檬酸三钠二水合物Sigma AldrichS1804-1KG

参考文献

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使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用
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