Summary
Det nuvarande protokollet beskriver ett kirurgiskt ingrepp för att ta bort stigande aortabanding i en råttmodell av lunghypertension på grund av vänster hjärtsjukdom. Denna teknik studerar endogena mekanismer för omvänd ombyggnad i lungcirkulationen och höger hjärta, vilket informerar strategier för att vända pulmonell hypertension och / eller höger ventrikulär dysfunktion.
Abstract
Pulmonell hypertension på grund av vänster hjärtsjukdom (PH-LHD) är den vanligaste formen av PH, men dess patofysiologi är dåligt karakteriserad än pulmonell arteriell hypertension (PAH). Som ett resultat saknas godkända terapeutiska ingrepp för behandling eller förebyggande av PH-LHD. Läkemedel som används för att behandla PH hos PAH-patienter rekommenderas inte för behandling av PH-LHD, eftersom minskad lungkärlsresistens (PVR) och ökat lungblodflöde i närvaro av ökat vänstersidigt fyllningstryck kan orsaka vänster hjärtkompensation och lungödem. Nya strategier behöver utvecklas för att vända PH hos LHD-patienter. I motsats till PAH utvecklas PH-LHD på grund av ökad mekanisk belastning orsakad av trängsel av blod i lungcirkulationen under vänster hjärtsvikt. Kliniskt normaliserar mekanisk lossning av vänster kammare (LV) genom aortaklaffbyte hos aortastenospatienter eller genom implantation av LV-hjälpmedel i patienter med hjärtsvikt i slutstadiet inte bara lungartär- och högerkammartryck (RV) utan även PVR, vilket ger indirekta bevis för omvänd ombyggnad i lungkärlen. Med hjälp av en etablerad råttmodell av PH-LHD på grund av vänster hjärtsvikt utlöst av trycköverbelastning med efterföljande utveckling av PH, utvecklas en modell för att studera de molekylära och cellulära mekanismerna för denna fysiologiska omvända ombyggnadsprocess. Specifikt utfördes en aortaupplösande operation, vilket resulterade i omvänd ombyggnad av LV-myokardiet och dess lossning. Parallellt var fullständig normalisering av RV systoliskt tryck och signifikant men ofullständig vändning av RV-hypertrofi detekterbar. Denna modell kan utgöra ett värdefullt verktyg för att studera mekanismerna för fysiologisk omvänd ombyggnad i lungcirkulationen och RV, i syfte att utveckla terapeutiska strategier för behandling av PH-LHD och andra former av PH.
Introduction
Hjärtsvikt är den vanligaste dödsorsaken i utvecklade länder och förväntas öka med 25% under det kommande decenniet. Pulmonell hypertoni (PH) - en patologisk ökning av blodtrycket i lungcirkulationen - påverkar cirka 70% av patienterna med hjärtsvikt i slutstadiet; Världshälsoorganisationen klassificerar PH som pulmonell hypertension på grund av vänster hjärtsjukdom (PH-LHD)1. PH-LHD initieras av nedsatt systolisk och/eller diastolisk vänsterkammarfunktion (LV) som resulterar i förhöjt fyllnadstryck och passiv trängsel av blod i lungcirkulationen2. Om än initialt reversibel blir PH-LHD gradvis fixerad på grund av aktiv lungkärlsombyggnad i alla fack i lungcirkulationen, dvs artärer, kapillärer och vener 3,4. Både reversibel och fast PH ökar RV-efterbelastningen, vilket initialt driver anpassningsbar myokardiell hypertrofi men i slutändan orsakar RV-dilatation, hypokinesi, fibros och dekompensation som gradvis leder till RV-misslyckande 1,2,5,6. Som sådan accelererar PH sjukdomsprogressionen hos hjärtsviktspatienter och ökar dödligheten, särskilt hos patienter som genomgår kirurgisk behandling genom implantation av vänster ventrikulära hjälpmedel (LVAD) och / eller hjärttransplantation 7,8,9. För närvarande finns inga botande terapier som kan vända processen för lungkärlombyggnad, så grundläggande mekanistisk forskning i lämpliga modellsystem behövs.
Viktigt är att kliniska studier visar att PH-LHD som en frekvent komplikation hos patienter med aortastenos kan förbättras snabbt under den tidiga postoperativa perioden efter aortaklaffbyte10. Analogt normaliserades hög (>3 Wood Units) preoperativ lungkärlsresistens (PVR) som dock var reversibel på nitroprussid hållbart efter hjärttransplantation i en 5-årig uppföljningsstudie11. På samma sätt kan en adekvat minskning av både reversibel och fast PVR och förbättring av RV-funktionen hos LHD-patienter realiseras inom flera månader genom att lossa vänster kammare med hjälp av implanterbara pulserande och icke-pulserande ventrikulära hjälpmedel 12,13,14. För närvarande är de cellulära och molekylära mekanismerna som driver omvänd ombyggnad i lungcirkulationen och RV-myokardiet oklara. Ändå kan deras förståelse ge viktig insikt i fysiologiska vägar som kan utnyttjas terapeutiskt för att vända lungkärl och RV-ombyggnad i PH-LHD och andra former av PH.
En lämplig preklinisk modell som på ett adekvat sätt replikerar de patofysiologiska och molekylära egenskaperna hos PH-LHD kan användas för translationella studier vid trycköverbelastningsinducerad hjärtsvikt på grund av kirurgisk aortabanding (AoB) hos råttor 4,15,16. I jämförelse med liknande hjärtsvikt på grund av trycköverbelastning i den murina modellen av tvärgående aortaförträngning (TAC)17, ger bandning av den stigande aortan ovanför aorta roten hos AoB-råttor inte högt blodtryck i vänster halspulsåder eftersom bandingstället är proximalt av utflödet av vänster halspulsåder från aortan. Som ett resultat orsakar AoB inte vänstersidig neuronskada i cortex som är karakteristisk för TAC18, och som kan påverka studieresultatet. Jämfört med andra gnagarmodeller av kirurgiskt inducerad PH-LHD visar sig råttmodeller i allmänhet och AoB i synnerhet vara mer robusta, reproducerbara och replikera ombyggnaden av lungcirkulationskarakteristiken för PH-LHD-patienter. Samtidigt är perioperativ dödlighet låg19. Ökat LV-tryck och LV-dysfunktion hos AoB-råttor inducerar PH-LHD-utveckling, vilket resulterar i förhöjt RV-tryck och RV-ombyggnad. Som sådan har AoB-råttmodellen visat sig vara extremt användbar i en serie tidigare studier av oberoende grupper, inklusive oss själva, för att identifiera patomekanismer av lungkärlsombyggnad och testa potentiella behandlingsstrategier för PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.
I den aktuella studien användes AoB-råttmodellen för att etablera ett kirurgiskt ingrepp av aortaupplösande för att studera mekanismer för omvänd ombyggnad i lungkärlenoch husbilen. återhämtning. Dessutom har ett begränsat antal tidigare studier undersökt effekterna av aortaupplösande på PH-LHD hos råttor och visat att aortaavbandning kan vända medial hypertrofi i lungartärer, normalisera uttrycket av pre-pro-endotelin 1 och förbättra lunghemodynamiken27,28, vilket ger bevis för reversibiliteten av PH hos råttor med hjärtsvikt. Här optimeras och standardiseras de tekniska procedurerna för debanding-operationen, t.ex. genom att applicera en trakeotomi istället för endotrakeal intubation eller genom att använda titanklämmor med en definierad innerdiameter för aortaband istället för polypropensuturer med en trubbig nål26,27, vilket ger bättre kontroll av de kirurgiska ingreppen, ökad reproducerbarhet av modellen och en förbättrad överlevnadshastighet.
Ur ett vetenskapligt perspektiv ligger betydelsen av PH-LHD-upplösningsmodellen inte enbart i att visa reversibiliteten hos den kardiovaskulära och lungfenotypen vid hjärtsvikt, utan ännu viktigare, i identifieringen av molekylära drivkrafter som utlöser och / eller upprätthåller omvänd ombyggnad i lungartärer som lovande kandidater för framtida terapeutisk inriktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes enligt "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Institute of Laboratory Animal Resources, 8: e upplagan 2011) och godkändes av den lokala statliga djurvårds- och användningskommittén för det tyska statliga kontoret för hälsa och sociala frågor (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin; protokoll nr. G0030/18). Först inducerades hjärtsvikt kirurgiskt hos juvenila Sprague-Dawley-råttor ~ 100 g kroppsvikt (bw) (se materialtabell) genom att placera en titanklämma med en innerdiameter på den stigande aortan (aortabanding, AoB) som beskrivits tidigare29,30. Vid vecka 3 efter AoB (figur 1) utfördes debanding (Deb) operation för att ta bort klippet från aortan. De kirurgiska ingreppen och valideringen av PH-reversering hos utförda AoB-råttor avbildas schematiskt i figur 1.
1. Kirurgiska preparat
- Sterilisera de nödvändiga kirurgiska instrumenten (figur 2) genom autoklavering.
- Injicera råtta med karprofen (5 mg/kg kroppsvikt) (se materialtabell) intraperitonealt (i.p.) för smärtlindring 30 minuter före operationen.
- Bedöva råtta genom i.p. injektion av ketamin (87 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (13 mg/kg kroppsvikt).
- Ta bort håret från djurets halsringning och bröstkorg med en elektrisk rakapparat.
- Applicera en droppe ögonsalva för att skydda ögonen under operationen.
- Placera råttan i en bakre position på ett steriliserat kirurgiskt bord. Fixa försiktigt djurets buk och lemmar med tejp.
OBS: För att bibehålla kroppstemperaturen, placera en värmematta på 37 °C under operationsbordet. Undvik uppvärmning av huvudregionen för att förhindra torkning av ögonen. - Desinficera djurhud med povidon-jod/jodofyrlösning. Notera ärr och suturer från den primära AoB-operationen och drapera det kirurgiska fältet.
- Se till att anestesidjupet är tillräckligt genom att klämma på tån.
OBS: Anestesidjupet måste kontrolleras regelbundet under operationen.
2. Trakeotomi och mekanisk ventilation
OBS: Under hela operationen, byt handskar efter hantering av icke-steril utrustning.
- Med fin sax (figur 2A), gör ett 7-10 mm långt livmoderhalssnitt i mittlinjen (figur 3A).
- Med hjälp av ett par trubbiga tångar (figur 2B '), dissekera den livmoderhalsiga mjukvävnaden för att exponera infrahyoidmusklerna. Dela muskler i mittlinjen för att visualisera luftstrupen. Klipp och ta bort suturen från den primära AoB-operationen.
- Gör ~ 2 mm luftrörssnitt mellan två broskringar med vinklad Noyes fjädersax (figur 2C,3B). Sätt in luftrörskabulen med ytterdiametern 2 mm (figur 2D) i luftstrupen och säkra den med en 4-0 silkesutur (figur 2E,3C).
- Anslut trakealkanylen till en mekanisk ventilator (se materialtabell) samtidigt som dödutrymmet hålls till ett minimum (figur 3D-E). Håll perioperativ lungventilation i en andningsfrekvens på 90 andetag/min vid en tidvattenvolym (Vt) på 8,5 ml/kg kroppsvikt.
3. Aorta upplöses
- Gör ett ~ 20 mm långt hudsnitt mellan andra och tredje revbenet med en fin sax (figur 3F).
- Med hjälp av mindre kirurgiska saxar (figur 2F) sprider du försiktigt musklerna och skär dem lager för lager (figur 3G). Gör ett 10 mm lateralt snitt längs det interkostala utrymmet mellan den andra och tredje ribben.
OBS: Mellanlinjen måste närmar sig noggrant för att undvika blödning. - Använd en revbensspridare (figur 2G) för att expandera det interkostala utrymmet mellan det andra och tredje revbenet för att skapa ett kirurgiskt fönster (figur 3H).
- Med hjälp av trubbiga tångar (figur 2B,B'), separera försiktigt tymus från hjärtat och ledningsartärerna för att visualisera aortan med klämman (figur 4A).
- Håll klämman med hjälp av tången och ta försiktigt bort bindväven runt klämman för att exponera den.
OBS: Undvik att hålla eller lyfta aortan med tången, eftersom det kan skada aortan vilket resulterar i blödning och ett dödligt utfall. - Med hjälp av en nålhållare (figur 2H), öppna klämman (figur 4B) och ta bort den från brösthålan.
- Innan du stänger bröstet, öppna upp lungatelektas, säkerställ tillräcklig lungrekrytering utan överdistension, fortsätt mekanisk ventilation med en Vt på 9,5 ml / kg kroppsvikt i ytterligare 10 minuter och återgå till en Vt på 8,5 ml / kg kroppsvikt för att rekrytera lungorna och lösa en eventuell pneumotorax.
- Stäng de djupa musklerna med en enkel avbruten sutur med 4-0 siden. Anslut sedan de övre musklerna och huden med en enkel kontinuerlig sutur (figur 5A,B).
4. Trakeal extubation
- Koppla bort trakealkanylen från ventilationsmaskinen. Observera noggrant råttan tills spontan andning återupprättas. Om djuret inte andas spontant vid frånkoppling, anslut ventilatorn igen och fortsätt att ventilera i ytterligare 5 minuter. Upprepa sedan proceduren.
- När spontan andning har återupprättats, ta bort kanylen från luftstrupen och rengör vätskan runt luftstrupen med svamppunkter (figur 2I) (se materialtabell).
- Stäng luftstrupen med en enkel sutur med 6-0 prolen (figur 2E' och figur 5C). Stäng sedan infrahyoidmusklerna i en enkel avbruten sutur med 4-0-siden (figur 5D) och anslut huden i en enkel kontinuerlig sutur (figur 5E). Rengör och desinficera musklerna och huden under processen med povidon-jod/jodofaslösning.
5. Postoperativ vård
- Efter avslutat kirurgiskt ingrepp, flytta försiktigt djuret till en återhämtningsbur med extra syre och en infraröd lampa för att hålla djuren varma och tillräckligt syresatta under återhämtningsfasen. Placera syrgasmasken nära råttans nos. Håll bara ett djur per återhämtningsbur när som helst.
- När djuret vaknar, flytta det försiktigt till en vanlig bur som levereras med vatten och mat. Under de kommande 12 timmarna, kontrollera hälsotillståndet hos det opererade djuret med 2 timmars intervall.
- Efter avslutat kirurgiskt ingrepp, applicera analgesi dagligen genom i.p. injektion av karprofen (5 mg/kg kroppsvikt) i en vecka.
- För att undvika bakteriell infektion, administrera amoxicillin (500 mg / L) i dricksvattnet i en vecka postoperativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Först bekräftades framgångsrik aortabanding genom transtorakisk ekokardiografi utförd före och efter upplösningsproceduren hos AoB-djur (figur 6). För detta ändamål bedömdes aortabågen i parasternalt långaxel (PLAX) B-lägesvy. Klippets position på den stigande aortan hos AoB-djur och dess frånvaro efter Deb-operationen visualiserades (figur 6A,B). Därefter utvärderades aortablodflödet genom pulserad våg doppleravbildning (figur 6C-F). Maximal blodflödeshastighet hos AoB-djur uppmätt före och efter klippet var 733,24 ± 17,39 mm/s respektive 5215,08 ± 48,05 mm/s (n = 8 djur) (figur 6C,E), vilket visar en brant lutning över AoB-platsen. Efter klippborttagning var den maximala blodflödeshastigheten 1093,79 ± 28,97 mm/s respektive 2578,73 ± 42,27 mm/s vid motsvarande aortaplatser, vilket visar en markant dämpning av gradienten i linje med funktionell avbandning (figur 6D,F). För att undersöka för vändning av vänster hjärtsvikt genom aortaupplösning, användes uttrycksnivåerna för hjärnans natriuretiska peptid (BNP), en klinisk rutinparameter för bedömning av hjärtsjukdom31, i LV-myokardiet. Vid vecka 3 och 5 efter aortabandning visade AoB-djur en signifikant ökad produktion av BNP jämfört med skenstyrda kontroller. Däremot uttryckte Deb-råttor vid vecka 5 BNP på nivåer som är jämförbara med bluffdjur, vilket indikerar att LV-misslyckandet vänds genom aortaupplösning (figur 7A-C). Parallellt visade utvärdering av LV-funktionen genom transtorakisk ekokardiografi en ökad LV-utstötningsfraktion och LV-volym hos Deb-djur jämfört med AoB-råttor (figur 7D-E). Medan LV-utkastningsfraktion hos Deb-djur var jämförbar med bluffråttor, misslyckades LV-volymen hos Deb-råttor att helt normaliseras till värden som ses i bluffgruppen, vilket indikerar att återföring av LV-funktionen är ofullständig.
För att undersöka om Deb-djur kan fungera som en preklinisk modell för att studera omvänd lungkärls- och högerkammar-(RV) ombyggnad i PH-LHD, bedömdes vänster ventrikulärt systoliskt tryck (LVSP) och höger ventrikulärt systoliskt tryck (RVSP) med hjälp av en mikrotip Millar-kateter. I korthet bedövades råttor återigen med ketamin (87 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (13 mg/kg kroppsvikt), trakeotomatiserades och ventilerades enligt beskrivningen ovan. Hjärtkateterisering utfördes efter median torakotomi32 genom toppen av (första) vänster respektive (andra) höger kammare, eftersom direkt kateterisering av vänster kammare via vaskulär väg förhindras av aortabandet hos AoB-djur. Efter eutanasi genom en överdos av ketamin/xylazin skars hjärtat ut och ventrikulär hypertrofi bedömdes som vikten av vänster kammare inklusive septum (LV+S) eller höger kammare (RV) normaliserad till kroppsvikt (BW). I enlighet med AoB-råttor som en etablerad modell för PH-LHD visade AoB-djur en signifikant ökad LVSP och RVSP och LV- och RV-hypertrofi jämfört med skenopererade djur vid 3 veckor efter operationen (figur 8A-F). Debanding (Deb) kirurgi som utfördes vid vecka 3 efter AoB resulterade i en signifikant minskning av både LVSP- och LV-hypertrofi jämfört med AoB-djur utan Deb vid vecka 3 och vecka 5 efter AoB, vilket visar att normalisering av LV-hemodynamik efter borttagning av klipp från aortan omvänd LV-ombyggnad (figur 8C, D). Jämfört med AoB-råttor vid vecka 3 och vecka 5 visade Deb-djur också en signifikant minskning av RVSP och RV / BW, vilket visade framgångsrik vändning av PH-LHD (figur 8E, F). I synnerhet var RVSP hos Deb-råttor jämförbart med värden uppmätta hos bluffdjur, vilket indikerar en fullständig normalisering av RV-hemodynamiken. Däremot var RV-hypertrofi hos Deb-djur endast delvis omvänd med RV / BW, vilket fortfarande var signifikant ökat jämfört med skenkontroller (figur 8E, F).
Figur 1: Schematisk representation av de kirurgiska ingreppen och validering av PH-reversering hos AoB-råttor. Schemat visar de olika experimentella grupper som används i den aktuella studien för att testa om upplösning av kirurgi vänder PH-LHD. Sham, skenstyrda kontroller; AoB, aortabanding; Deb, upplösande. Trianglar markerar tidpunkten för kirurgiska ingrepp: primär operation (bluff eller AoB; röd) vid vecka 0 och sekundär operation (Deb; grön) vid vecka 3. Cirklar markerar de slutpunktsanalyser vid vilka PH-LHD bedömdes med LV- och RV-tryck respektive hypertrofimätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kirurgiska instrument. (B) Moria Iris tång och (B') tandade Graefe-tångar. Tångspetsarna visas förstorade. (C) Noyes fjäder sax. (D) Trakeal kanyl. (E, E') 4-0 respektive 6-0 suturer. (F) Fin sax Volframkarbid. (G) Ribbspridare. (H) Mathieu nålhållare. (I) Svamp pekar vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Trakeotomi och torakotomi. Bilder illustrerar de kirurgiska stegen för trakeotomi. (A) Cervikal mittlinje snitt. B) Snitt av luftstrupen mellan två broskringar. (C) Trakealkanyl som sätts in i luftstrupen och säkras med en sutur. (D) Trakealkanylen är ansluten till en mekanisk ventilator. (E) Bilder illustrerar de kirurgiska stegen för torakotomi. (F) Hudsnitt mellan andra och tredje revbenet. (G) Skärning av muskler. (H) Skapande av ett thoraxkirurgiskt fönster genom att sprida det andra och det tredje revbenet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Visualisering av det aorta-sammandragande klippet in vivo och ex vivo. (A) Bilden visar brösthålan hos en AoB-råtta med en titanklämma placerad på den stigande aortan. (B) Bilden visar stängt och öppnat klipp ex vivo. Asterisk markerar den del av klämman som nålhållaren komprimerar in vivo för att öppna klämman. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Sårstängning. Bilder illustrerar stängningen av de övre bröstmusklerna (A) och huden (B) med en enkel kontinuerlig sutur. Luftstrupen (C) och de infrahyoida musklerna (D) stängs av en enkel sutur och huden på nacken (E) med en enkel kontinuerlig sutur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Aortablodflöde före och efter upplösning av operation. (A-B) Visualisering av den stigande aortan hos en råtta med aortabanding (AoB, vänster) och en råtta efter upplösningskirurgi (Deb, höger) genom transtorakisk ekokardiografi. Pilen visar titanklämman på kroppspulsådern i (A) frånvarande i (B). (C,D) Pulserade våg doppler ekokardiografiska bilder visar blodflödet före klippet i en AoB-råtta (C) och blodflödet i motsvarande aortasegment i en Deb-råtta (D) som tagits en dag före respektive en dag efter aortaupplösande operationen. (E,F) Analogt visar bilder blodflödet i aortasegmentet efter klippet i en AoB-råtta (E) och i motsvarande aortasegment i en Deb-råtta (F) som tagits en dag före respektive en dag efter aortaupplösande operationen. Turquois vertikala linjer illustrerar mätningar av topp aortaflödeshastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Normalisering av vänster ventrikulär funktion genom aortabandning. (A) Representativa western blottar visar proteinnivåer av BNP och med GAPDH som belastningskontroll i vänster kammare (LV) hos AoB-råttor vid vecka 3 efter aortabanding (n = 5) och i motsvarande skenkontroller (n = 5). (B) Representativa western blottar visar BNP och GAPDH i vänster kammare (LV) hos AoB-råttor vid vecka 5 efter aortabanding (n = 4), hos Deb-råttor vid vecka 5 (n = 5) och i skenkontroller vid motsvarande tidpunkt efter primär operation (n = 4). (C) Box- och morrhårsdiagram visar kvantifiering av BNP-uttryck normaliserat till GAPDH och skenkontroll vid motsvarande tidpunkt efter primär operation. Rutorna visar median percentiler, 25 respektive 75 percentiler. whiskers anger minimi- och maximivärdena. För statistiska analyser användes Students t-test33 . *p-värde < 0,05. (D) Stapeldiagram (medelvärde ± standardavvikelsen) visar LV-utkastningsfraktion och volym i bluff (n = 4), AoB (n = 9) och Deb (n = 7) djur vid vecka 5 mätt med ekokardiografi från M- och B-lägesbilder. (E) Representativa ekokardiografiska bilder i M-läge visar förändringar i LV-fraktionerad förkortning hos bluff-, AoB- och Deb-djur vid vecka 5. För statistiska analyser användes Mann-Whitney U test33 . *p-värde < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Ventrikulär hemodynamik normaliseras och hjärthypertrofi vänds genom aortabanding. (B) Representativa bilder visar hjärthypertrofi hos en AoB-råtta 3 veckor efter aortabandning jämfört med skenkontroll. (C-F) Låd- och morrhårsdiagram visar vänster ventrikulärt systoliskt tryck (LVSP; C), LV-hypertrofi ([LV+S]/BW; D), höger ventrikulärt systoliskt tryck (RVSP; E) och RV-hypertrofi (RV / BW; F) hos bluff- och AoB-djur vid 3 och 5 veckor efter operationen och normaliserade parametrar (jämfört med 3- och 5-veckors AoB-grupper) hos Deb-råttor. Rutorna visar median percentiler, 25 respektive 75 percentiler. whiskers anger minimi- och maximivärdena. n = 9-12 djur analyserades för hemodynamiska mätningar och hjärtvikt mättes i n = 7-12 råttor per grupp. För statistiska analyser användes Mann-Whitney U-test. *p-värde < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här rapporteras en detaljerad kirurgisk teknik för aortaupplösande i en AoB-modell för råtta som kan användas för att undersöka reversibiliteten hos PH-LHD och de cellulära och molekylära mekanismerna som driver omvänd ombyggnad i lungkärlen och husbilen. Tre veckors aortaförträngning hos juvenila råttor resulterar i PH-LHD uppenbart som ökat LV-tryck, LV-hypertrofi och samtidigt ökat RV-tryck och RV-hypertrofi. Aorta som upplöstes vid vecka 3 efter AoB kunde lossa LV och helt vända LV-hypertrofi inom två veckor efter Deb. Parallellt orsakade aortaupplösning också en fullständig normalisering av RV-tryck och en partiell vändning av RV-hypertrofi.
Den nuvarande modellen efterliknar således kritiska aspekter av det kliniska scenariot där mekanisk lossning av LV med en implanterbar icke-pulserande LVAD med kontinuerliga flödesegenskaper tidigare har visat sig vända PH hos patienter med hjärtsvikt34,35. I en retrospektiv analys visades LVAD-stöd minska lungartärtrycket till liknande grad hos hjärtsviktspatienter med antingen reversibel eller fast PH, med fast PH definierat som genomsnittligt lungartärtryck >25 mm Hg, lungkärlsresistens >2,5 Träenhet och en medeltryckstranspulmonell gradient >12 mm Hg trots farmakologisk behandling35. Viktigt är att dessa fynd 34,35 ger indirekta bevis för att vänster ventrikulär lossning inte bara minskar passiv lungstockning och sekundära förändringar i lungkärltonen utan utlöser omvänd ombyggnad av lungkärlen genom "fysiologiska" mekanismer, dvs genom anpassning till förändrad hemodynamik. Djupgående, multi-omics-analyser av de cellulära och molekylära processer som driver omvänd ombyggnad i lungkärlen kan öppna nya vägar för att identifiera nya terapeutiska alternativ för behandling av PH hos hjärtsviktspatienter och potentiellt också i andra former av PH inklusive PAH. Den nuvarande modellen för upplösning hos AoB-råttor ger en unik möjlighet för sådana analyser som fullständig normalisering av RVSP bekräftar effektiv vändning av PH, vilket möjliggör mekanistiska studier för att identifiera vägar med förmågan att återställa homeostatiska processer i den sjuka lungkärlen.
Med en liknande motivering kan den nuvarande modellen vidare användas för att studera intra- och intercellulära processer som driver omvänd ombyggnad av RV. RV-funktionen har nyligen erkänts som en signifikant prediktor för prognos för sjuklighet och dödlighet i hjärt-kärlsjukdomar. Ändå har inga terapier kliniskt godkänts för att förbättra RV-funktionen36. Som sådan ger förmågan att studera omvända ombyggnadsprocesser i RV-myokardiet i en djurmodell en unik möjlighet att ta itu med en betydande kunskapslucka och ett kritiskt medicinskt behov.
Framgången för det tekniskt utmanande aortaupplösande förfarandet hos AoB-råttor beror på kirurgiska färdigheter och exakta perioperativa strategier. I det följande beskrivs kritiska kirurgiska ingreppssteg som kan orsaka perioperativ dödlighet genom överdriven blödning (1-5) eller otillräcklig andning (6) och rekommendationer för att undvika dessa komplikationer.
(1) Under en torakotomi måste midsternallinjen närmar sig noggrant med sax för att undvika skada på den inre bröstartären. (2) För att visualisera hjärtat och ledningsartärerna bör tymus mobiliseras och försiktigt flyttas i kranialriktningen. Vid upplösningsoperationen är tymusvävnaden ofta ansluten till hjärtat och artärerna via postoperativa vidhäftningar från den ursprungliga AoB-operationen. Dessa vidhäftningar bör separeras noggrant med ett par trubbiga pincett för att undvika skador på kardiovaskulära strukturer. (3) Vid avbandningsoperationen är kroppspulsådern med klämman ofta inbäddad i bindväv. Denna bindväv måste försiktigt dissekeras med trubbiga pincett för att visualisera klippet. Här är den transtorakiska ekokardiografin som utförs före operationen ett användbart förberedelsesteg, vilket gör det möjligt att identifiera om klippet ligger nära aortaroten, mitt i den stigande aortan eller nära den brachiocephaliska artären. Denna kunskap sparar dyrbar tid för klippallokering under operationen. (4) Klippets orientering är ett kritiskt steg som måste övervägas noggrant under den första aortabandningsoperationen. För att underlätta optimal bedömning och snabb öppning av klämman under aortabandning bör den del som måste komprimeras av nålhållaren (figur 4B) orienteras ventralt. Klipp omorientering under upplösningskirurgi är möjlig, men med risk för skada på aortan. För omorientering av klippet måste klämmor hållas med pincett medan omgivande bindväv försiktigt tas bort, sedan ska klämman mobiliseras och vridas. Att hålla aortan med tången ska undvikas. (5) För urbandning ska klämman hållas av en tång med ena handen och öppnas med en nålhållare med den andra handen. Kroppspulsådern behöver inte lyftas ventralt. (6) Efter avslutad upplösning har extuberade PH-LHD-råttor stor risk för andningssvikt, med djur som vanligtvis dör inom 10-20 minuter efter operationen medan de fortfarande är under anestesi. Atelektas i vänster lunga är den vanligaste dödsorsaken under denna period, och långvarig mekanisk ventilation före bröststängning hjälper till att rekrytera lungan och motiverar tillräcklig andning efter operationen.
Vi föreslår också att jämfört med endotrakeal intubation som utförts i tidigare studier26,27, ger trakeostomi bättre kontroll av lämplig ventilation under kirurgiska ingrepp, vilket är specifikt relevant under aortaupplösning. Denna uppfattning är baserad på följande motivering: (1) Trakeostomi, rutinmässigt utförd i vårt laboratorium för perioperativ lungventilation, är en enkel och säker teknik utan perioperativa eller postoperativa komplikationer. (2) Trakeostomi eliminerar risken för esofagus intubation eller trakealskada; det möjliggör exakt positionering och fixering av trakealkanylen och konstant visuell kontroll av kanylen under alla steg i det kirurgiska ingreppet. (3) Vid tidpunkten för aortaupplösen har AoB-djur redan hjärtsvikt och är mer känsliga för ytterligare stress. Som ett resultat kan de potentiella riskerna som följer med endotrakeal intubation öka dödligheten. (4) Slutligen, när det opererade djuret avvänjs från ventilatorn men inte utvecklar spontan andning, möjliggör en trakeostomi snabb reintubation och återanslutning till ventilatorn, vilket potentiellt kan rädda liv på grund av förmågan till långvarig postoperativ ventilation.
Den aktuella studien rapporterar en aortabandningsteknik utförd 3 veckor efter initial aortabandning hos råttor. För studier som syftar till att jämföra omvänd ombyggnad av lungkärlen och husbilen i olika PH-stadier kan de beskrivna procedurerna också utföras vid senare tidpunkter efter aortabandning. Ändå är försiktighet motiverad eftersom ärr och bindväv som omger aortan sannolikt kommer att bli rikligare med tiden, vilket ytterligare komplicerar proceduren och kräver ytterligare felsökning och förfining. Samtidigt gäller de grundläggande principerna i det rapporterade protokollet fortfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera. Alla medförfattare har sett och håller med om innehållet i manuskriptet.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag från DZHK (Tyska centret för kardiovaskulär forskning) till CK och WMK, BMBF (tyska ministeriet för utbildning och forskning) till CK inom ramen för VasBio och till WMK inom ramen för VasBio, SYMPATH och PROVID, och den tyska forskningsstiftelsen (DFG) till WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 och KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
References
- Rosenkranz, S., et al. Pulmonary hypertension due to left heart disease: Updated recommendations of the cologne consensus conference 2011. International Journal of Cardiology. 154, Suppl 1 34-44 (2011).
- Rosenkranz, S., et al. Left ventricular heart failure and pulmonary hypertension. European Heart Journal. 37 (12), 942-954 (2016).
- Fayyaz, A. U., et al. Global Pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension associated with heart failure and preserved or reduced ejection fraction. Circulation. 137 (17), 1796-1810 (2018).
- Hunt, J. M., et al. Pulmonary veins in the normal lung and pulmonary hypertension due to left heart disease. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (10), 725-736 (2013).
- Bursi, F., et al. Pulmonary pressures and death in heart failure: A community study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 222-231 (2012).
- Ryan, J. J., et al. Right ventricular adaptation and failure in pulmonary arterial hypertension. Canadian Journal of Cardiology. 31 (4), 391-406 (2015).
- Miller, W. L., Mahoney, D. W., Enriquez-Sarano, M. Quantitative Doppler-echocardiographic imaging and clinical outcomes with left ventricular systolic dysfunction: Independent effect of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 7 (2), 330-336 (2014).
- Kjaergaard, J., et al. Prognostic importance of pulmonary hypertension in patients with heart failure. The American Journal of Cardiology. 99 (8), 1146-1150 (2007).
- Shah, R., et al. Pulmonary hypertension after heart transplantation in patients bridged with the total artificial heart. ASAIO Journal. 62 (1), 69-73 (2016).
- Tracy, G. P., Proctor, M. S., Hizny, C. S. Reversibility of pulmonary artery hypertension in aortic stenosis after aortic valve replacement. The Annals of Thoracic Surgery. 50 (1), 89-93 (1990).
- Lindelow, B., Andersson, B., Waagstein, F., Bergh, C. H. High and low pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates. A 5-year follow-up after heart transplantation shows continuous reduction in resistance and no difference in complication rate. European Heart Journal. 20 (2), 148-156 (1999).
- Martin, J., et al. Implantable left ventricular assist device for treatment of pulmonary hypertension in candidates for orthotopic heart transplantation-a preliminary study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 25 (6), 971-977 (2004).
- Gallagher, R. C., et al. Univentricular support results in reduction of pulmonary resistance and improved right ventricular function. ASAIO Transactions. 37 (3), 287-288 (1991).
- Beyersdorf, F., Schlensak, C., Berchtold-Herz, M., Trummer, G. Regression of "fixed" pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates after unloading with ventricular assist devices. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (4), 747-749 (2010).
- Hoffmann, J., et al. Mast cells promote lung vascular remodelling in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 37 (6), 1400-1410 (2011).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91 (10), 2642-2654 (1995).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- de Montgolfier, O., et al. High Systolic blood pressure induces cerebral microvascular endothelial dysfunction, neurovascular unit damage, and cognitive decline in mice. Hypertension. 73 (1), 217-228 (2019).
- Breitling, S., Ravindran, K., Goldenberg, N. M., Kuebler, W. M. The pathophysiology of pulmonary hypertension in left heart disease. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (9), 924-941 (2015).
- Ranchoux, B., et al. Metabolic syndrome exacerbates pulmonary hypertension due to left heart disease. Circulation Research. 125 (4), 449-466 (2019).
- Zhang, H., Huang, W., Liu, H., Zheng, Y., Liao, L. Mechanical stretching of pulmonary vein stimulates matrix metalloproteinase-9 and transforming growth factor-beta1 through stretch-activated channel/MAPK pathways in pulmonary hypertension due to left heart disease model rats. PLoS One. 15, 0235824 (2020).
- Yin, J., et al. Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure. Circulation: Heart Failure. 4 (2), 198-206 (2011).
- Yin, N., et al. Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease. Critical Care Medicine. 37 (3), 980-986 (2009).
- Breitling, S., et al. The mast cell-B cell axis in lung vascular remodeling and pulmonary hypertension. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (5), 710-721 (2017).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: Role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circulation Research. 106 (6), 1103-1116 (2010).
- Goncalves-Rodrigues, P., Miranda-Silva, D., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Studying left ventricular reverse remodeling by aortic debanding in rodents. Journal of Visualized Experiments. (173), e60036 (2021).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9, 2956 (2019).
- Chou, S. H., et al. The effects of debanding on the lung expression of ET-1, eNOS, and cGMP in rats with left ventricular pressure overload. Experimental Biology and Medicine. 231 (6), 954-959 (2006).
- Hentschel, T., et al. Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure. Anesthesiology. 106 (1), 124-131 (2007).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. Journal of Visualized Experiments. (88), e50983 (2014).
- Angermann, C. E., Ertl, G. Natriuretic peptides--new diagnostic markers in heart disease. Herz. 29 (6), 609-617 (2004).
- Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. American Association for Laboratory Animal Science. 47 (5), 44-46 (2008).
- Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , 1-54 (2013).
- Etz, C. D., et al. Medically refractory pulmonary hypertension: treatment with nonpulsatile left ventricular assist devices. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (5), 1697-1705 (2007).
- Mikus, E., et al. Reversibility of fixed pulmonary hypertension in left ventricular assist device support recipients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 971-977 (2011).
- Zelt, J. G. E., Chaudhary, K. R., Cadete, V. J., Mielniczuk, L. M., Stewart, D. J. Medical therapy for heart failure associated with pulmonary hypertension. Circulation Research. 124 (11), 1551-1567 (2019).
