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设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振

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DOI：

10.3791/63541

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2022年6月14日

1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具，以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD 值。

摘要

表面等离子体共振（SPR）用于测量血凝素（HA）与结构域交换的蓝藻病毒素-N（CV-N）二聚体的结合，并监测甘露糖化肽与CV-N高亲和力结合位点之间的相互作用。已有报道指出，病毒包膜刺突蛋白gp120、HA和埃博拉糖蛋白（GP）1,2可结合于二聚体CVN2上的高亲和力和低亲和力结合位点。双甘露糖基化HA肽也被证实可结合至一种工程化CVN2分子的两个低亲和力结合位点，该分子含有针对相应配体的高亲和力结合位点，并通过突变将碳水化合物结合口袋中的稳定二硫键替换为极性残基对（谷氨酸与精氨酸），从而验证了多价结合的存在。HA与伪抗体CVN2的一个高亲和力结合位点结合，其解离常数（KD为275 nM，该结合可通过寡聚化进一步中和1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）。在结构域交换的CVN2中，通过将半胱氨酸替换为谷氨酸和精氨酸的极性残基对，二硫键数量从4个减少至2个，导致其对血凝素（HA）的结合亲和力降低。在已知最强的相互作用中，CVN2利用不含跨膜结构域的包膜糖蛋白，在低纳摩尔范围内通过两个高亲和力结合位点结合埃博拉病毒GP1,2。在本研究中，多特异性单体CV-N与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）糖蛋白的结合亲和力测得KD = 18.6 µM，与纳摩尔级的 KD 与其他病毒刺突蛋白相比，以及 通过 其受体结合域，处于中等微摩尔浓度范围µ微摩尔范围

引言

干扰素可诱导与tetherin相关的抗病毒活性α，且包含基于蛋白质的锚定结构，可导致完整病毒颗粒滞留在感染细胞表面1. 束素蛋白糖基化在抑制病毒释放中的必要性仍不明确，提示糖基化模式对重组表达的糖链功能具有重要意义 体外 研究1,2，这取决于流感病毒表面表达的血凝素HA的构象3,4已发现，对N-连接糖基化位点上连接的寡糖进行修饰，足以实现 tetherin 介导的对1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）释放的限制2，而二聚化在阻止病毒释放过程中起着关键作用，因此涉及跨膜区或糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构，以锚定出芽的病毒颗粒5. 分别描述了人和小鼠tetherin的独特特征，其可抑制多种包膜病毒、逆转录病毒和丝状病毒。BST-2/tetherin 是一种先天免疫相关的干扰素诱导型抗病毒蛋白1,6，具有广谱抗病毒活性，且可被包膜糖蛋白拮抗5 转运tetherin或破坏tetherin的结构6例如，甲型流感病毒表面表达的包膜糖蛋白HA和神经氨酸酶以病毒株特异性的方式拮抗tetherin的作用广为人知7，有助于识别宿主受体结合位点8. 以HA上快速定制化的糖链保护层为靶标的抗体，其与流感病毒A型H3N2和H1N1亚型的结合亲和力，可通过研究其与糖链相互作用的化学计量关系进行分析4.

为阐明抗病毒药物与病毒包膜刺突（即糖类配体）之间的结合机制，采用化学方法合成单、二和三甘露糖基团，并结合免疫学与光谱学方法，制备甘露糖化肽。 通过 β-乙酰氧基糖基叠氮化物的叠氮糖基化反应转化为1,2-反式糖基叠氮化物9，模拟危及生命的病毒表面常见的 N-乙酰葡萄糖胺和高甘露糖型寡糖。采用三唑类生物等排体来模拟形成血凝素肽甘露糖基化残基的连接结构。10 并促进抗病毒CV-N衍生物在HA头部结构域第二个N-连接糖基化位点周围（HA顶端，含4个N-连接糖链N54、N97、N181、N301）的位点特异性相互作用8,11,12谷氨酸（Glu）与精氨酸（Arg）之间的相互作用及其所导致的螺旋偶极效应在两种模型多肽和蛋白质中均表现出良好的稳定性，但通过表面等离子共振（SPR）技术进行可视化。若与识别HA上单个化学合成的糖基化位点相比较10 通过直接抑制糖链部分上的受体结合，一种四点突变的Fc结构对其受体表现出更高的亲和力，从而激发效应功能 体内，揭示了与Fc突变体相连的N-连接聚糖的非相关组成是由机制决定的13.

CV-N 对 HIV14,15、流感病毒16 和埃博拉病毒具有抗病毒活性，该活性由其在包膜刺突蛋白上的高甘露糖寡糖修饰位点以纳摩尔级亲和力结合所介导12,17,18,19。流感病毒血凝素（HA）与 CV-N 中一个高亲和力碳水化合物结合位点（H）或共价连接的二聚体 CVN2 中的两个 H 位点的结合，其平衡解离常数（KD）分别为 5.7 nM（图 1A）和 KD = 2.7 nM。CV-N 和 CVN2 均含有一个或两个低亲和力碳水化合物结合位点（L）12,17,20,21。埃博拉病毒 GP1,2 与 CVN2 的 2H 位点结合，亲和力处于较低的纳摩尔范围（KD = 26 nM）。CV-N 野生型与埃博拉病毒 GP1,2 和 HA 的结合亲和力范围为 KD = 34 nM 至 KD = 5.7 nM（A/New York/55/04）12。凝集素（如 CV-N）可特异性靶向病毒包膜上的高甘露糖聚糖，进一步抑制丙型肝炎病毒、SARS-CoV、疱疹病毒、马尔堡病毒和麻疹病毒的复制22。

小分子CV-N已被深入研究超过20年，因其具有结合多种病毒以抑制病毒入侵的功能。16,18结构分析和结合亲和力测定表明，两个L链通过二价结合在微摩尔范围内交联形成结构域交换的CVN2二聚体，从而增强其对病毒包膜糖蛋白的结合力10,19. 甘露糖的选择性结合α1-2人α 在Man(8) D1D3臂和Man(9)上包含两个位于相反蛋白原体上的、亲和力不同的结合位点20，从而达到纳摩尔级的结合亲和力（图1B因此，CVN2 被视为一种拟抗体，可用于结合 HIV gp120 上的表位，作用类似于病毒中和抗体。17在此，作者旨在研究CVN2与SARS-CoV-2刺突蛋白潜在结合的可能性 通过 其受体结合域（RBD）。固定化的人血管紧张素转换酶（ACE）-2与SARS-CoV-2 RBD结合曲线得到的KD = 4.7 nM，针对这一具有生物学意义的结合相互作用23.

相比之下，某些免疫球蛋白类别可识别特定且一致的结构蛋白模式，这些模式为膜锚定的HA区域中的亲和力成熟提供了底物24。CV-N在几乎所有甲型和乙型流感病毒中均表现出强效活性16，是一种广谱中和性抗病毒剂。目前对于HA1和HA2茎部区域上靶向表位的具体位置仍了解不足，这些区域可能包含高效中和抗体识别的糖链靶向表位结构，并可与凝集素结合方式进行比较25。

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图1：凝集素CV-N与病毒包膜刺突蛋白结合的表面等离子共振（SPR）检测示意图。 （A）CV-N与配体HA全长蛋白（90 kDa）结合的SPR检测：动力学数据集（5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 nM），显示CV-N与固定化的流感病毒HA A/New-York/55/04（H3N2）实时双参考结合曲线。（B）CVN2L0变体V2在500 nM至16 µM浓度范围内与固定化配体DM的结合情况。序列中：L残基以黄色高亮显示，H残基以灰色高亮显示。E58和R73取代了野生型蛋白中的半胱氨酸，使V2形成具有三个而非四个二硫键的稳定蛋白构象。请点击此处查看该图的放大版本。

膜远端HA顶部区域的糖链屏障可诱导CV-N的高亲和力结合12，而CVN2与HA顶部区域二硫键邻近部位的结合则已在低亲和力位点中被观察到10,12。在CV-N介导的碳水化合物结合过程中，已鉴定出多种极性相互作用及结合位点。这些相互作用通过在结合位点构建敲除突变体，并将其结合亲和力与in silico预测的糖基化模式进行关联分析而得以验证12。因此，本项目旨在比较先前测试的化学甘露糖基化HA肽段与SARS相关2019-nCoV刺突蛋白及SARS-CoV-2中天然修饰的短肽序列在结合亲和力和特异性方面的差异，这些短肽仅含有少量不同的N-连接糖基化位点和O-连接糖基化位点。Pinto及其同事利用冷冻电子显微镜和结合实验报道了一种单克隆抗体S309，该抗体可能识别Sarbecovirus亚属中SARS-CoV-2刺突蛋白上包含保守糖链的一个表位，且不干扰受体结合26。本研究的实验方案描述了设计、表达和表征CV-N突变体的方法，这对于利用表面等离子共振（SPR）技术研究CV-N和CVN2如何结合糖基化蛋白及合成甘露糖基化肽段具有重要意义10,12。

串联连接的二聚体 CVN2L027 及其结合位点变体（V2-V5）通过重组表达获得，其中部分变体含有二硫键替换（C58E 和 C73R）（图 2A）。此外，还制备了单点突变体 E41A，因为该位点被认为是一个分子间交叉接触残基。该突变体是 SPR 结合实验中另一种有趣的分子，可用于解析凝集素与高甘露糖型寡糖之间的结合域，并可与二聚体形式进行比较。CVN2 的结构域交换型晶体结构显示其具有一个柔性连接区，长度在 49 至 54 个残基之间。两个结构域可围绕铰链区域作为刚性体自由运动，通过分子内结构域相互作用形成单体（结构域 A — 残基 1-39；90-101 — 与结构域 B — 残基 40-89 相互作用），或通过分子间结构域交换形成二聚体［第一个单体的结构域 A 与第二个单体的结构域 B 配对，第一个单体的结构域 B 与第二个单体的结构域 A 配对］。两个原体的结构域 A 与 B 之间除 Glu4128 外，无其他紧密相互作用。CV-N 基因可通过重复 PCR 方法构建，使用 40 个碱基合成的寡核苷酸片段29，随后亚克隆至 pET11a 载体的 NdeI 和 BamHI 位点，并通过电穿孔转化至电感受态细胞，具体操作如 Keeffe, J.R.27 所述。用于获得相应晶体结构（PDB ID 3S3Y）的蛋白包含一个 N 端 6×组氨酸纯化标签，其后接一个 Factor Xa 蛋白酶切割位点。采用定点突变技术引入点突变、替换密码子，或插入/删除单个或多个碱基或密码子以实现氨基酸替换。这些改造为研究蛋白质功能与结构提供了宝贵信息。重组表达并纯化的 CV-N、CVN2 和 CVN3 已在生物物理层面得到广泛研究20,21,27，且生产成本低廉，因此常用于表征固定在 SPR 传感芯片上的糖类结合实验。传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）在糖配体固定化技术方面重现性较差，且将 SPR 所能呈现的实时结合过程转化为终点检测，无法反映多种结合位点变体的动态结合行为。

结合亲和力变体 CVN2L0-V2（具有二硫键替换的完整同源二聚体 CV-N 折叠结构）10) 在带有 His 标签的情况下表达 大肠杆菌 (E. coli), 通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，并利用表面等离子体共振（SPR）技术检测其与HA（H3N2）、单甘露糖基化HA肽段及双甘露糖基化HA肽段的结合能力。化学甘露糖基化的肽段、HA蛋白及S蛋白均作为配体，通过胺偶联法固定于亲水芯片表面 通过 反应性酯类或生物素-链霉亲和素蛋白工程。对这些配体采用相同的连续运行程序，注入不同稀释浓度的CV-N及其CV-N变体（以及CVN2），以获得分子相互作用分析的动力学信息，具体如下所述30将RBD固定的SPR传感器芯片用于CV-N与S肽的结合研究，并将亲和力与SARS-CoV-2与人ACE2的结合进行比较。

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方案

在本研究中，使用了CVN-小泛素样修饰蛋白（SUMO）融合蛋白替代CV-N，用于酶联免疫吸附试验，并适用于基于细胞的检测。重组全长甲型流感病毒HA H3蛋白购自商业来源（见 材料清单）或根据标准方案在哺乳动物HEK293细胞系和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达12武汉-1刺突蛋白在哺乳动物HEK293细胞中表达。单甘露糖基化肽（MM）和双甘露糖基化肽（DM）的合成使得均一配体对CVN2及单甘露糖基化小分子的检测成为可能。10.

1. 构建CV-N表达载体

  1. 针对每种CVN2变体及CVN2L0蛋白（PDB ID 3S3Y），从商业来源获取带有N端pelB信号肽序列和His标签的pET27b(+)载体基因构建体（参见材料表，补充文件1）。
  2. 在CVN2L0模板基因背景下获得CVN2L0及其变体（V2、V3、V4和V5；图2A，C），该模板基因包含两个不同的DNA序列，分别对应每个CV-N重复单元。
  3. 将冻干的质粒DNA溶解于无菌去离子蒸馏水（ddH2O）中，终浓度为100 ng/µL。

2. 含质粒DNA转化细胞的LB琼脂平板的制备

  1. 通过将蛋白胨（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）和 NaCl（5 g/L）溶解于 ddH2O 中（参见材料表）来配制 LB-Lennox 培养基，并将 pH 调整至 7.4。采用化学法对每种变异株（V2-V5）进行转化，转入感受态 E. coli BL21 (DE3)，具体操作参照已发表的文献方法10。
  2. 将溶液分为两份（900 µL 和 100 µL），取 100 µL 转移至 LB-琼脂平板（含 50 µg/mL 卡那霉素），并用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。将琼脂平板于 37 °C 培养过夜。

3. 克隆

  1. 将CV-N基因亚克隆至pET11a的NdeI和BamHI位点（参见材料表），随后按照参考文献27的方法，通过电穿孔转化至电转感受态细胞中。

4. 定点突变

  1. 在含有两个不同DNA序列的CVN2L0模板基因背景下，生成CVN2L029及突变体CVN-E41A，这两个序列分别对应于每个CV-N重复区域27。
  2. 使用定点突变试剂盒（见材料表）和特异性突变引物5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3'与5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3'进行PCR扩增以引入突变31。
    1. 使用不同浓度的双链DNA（dsDNA）模板（范围为5–50 ng，例如5、10、20和50 ng）启动一系列样本反应，保持引物浓度恒定。
      注意：PCR反应体系和热循环程序通常按照定点突变试剂盒说明书中的描述进行32。
  3. 在矿物油覆盖层下方加入Dpn I限制性内切酶（1 µL，10 U/µL，见材料表）。轻轻充分混匀反应液，在台式微量离心机中离心1分钟，随后立即于37 °C孵育1小时，以消化亲本的超螺旋dsDNA。

5. 细菌细胞的转化

  1. 将 XL1-Blue 超感受态细胞（参见材料表）置于冰上轻轻解冻。为转化每个对照和样品反应，取 50 µL 超感受态细胞分装至预冷的聚丙烯圆底管（14 mL）中。
    1. 从每个对照和样品反应（突变的单链 DNA）中取 1 µL 经 Dpn I 处理的单链 DNA（ssDNA），分别加入不同的超感受态细胞分装管中，由细胞合成互补链。轻轻混匀转化反应液，并于冰上孵育 30 分钟。
      注意：在将 Dpn I 处理后的 DNA 加入转化反应前，建议小心地从移液枪头上去除残留的石蜡油。作为可选对照，可通过将 0.1 ng/µL 的 pUC18 对照质粒（1 µL）与 50 µL 超感受态细胞混合，检测 XL1-Blue 超感受态细胞的转化效率。
  2. 将转化反应在 42 °C 下进行 45 秒热激处理，随后立即置于冰上放置 2 分钟。
    注意：上述热激条件已针对所提及的聚丙烯圆底管（14 mL）条件优化。
  3. 加入 0.5 mL NZY+ 培养基（每升含：NZ 胺（酪蛋白水解物）10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 5 g、1 M MgCl2 12.5 mL、1 M MgSO4 12.5 mL、2 M 葡萄糖 10 mL，pH 7.5，预热至 42 °C），于 37 °C、225–250 rpm 振荡培养 1 小时。将各转化反应液适量涂布于 LB-氨苄青霉素琼脂平板上（对照质粒转化取 5 µL，样品转化取 250 µL）。
    注意：对于转化对照和诱变实验，应将细胞涂布于含有 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal，80 µg/mL）和异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷（IPTG，20 mM）的 LB-氨苄青霉素琼脂平板上（参见材料表）。从转化后的E. coli 细胞中挑取单菌落接种至 50 mL 培养液中，用于纯化突变质粒 DNA 进行分析。诱变结果通过外部机构的 DNA 测序确认。

6. 表达与蛋白纯化

  1. 对于大规模培养，取转化平板上的单个菌落接种至少量含有氨苄青霉素的 LB 培养基中。
  2. 利用过夜培养物接种表达培养基，并添加 10 mM MgCl2、10 mM MgSO4 和 20 mM 葡萄糖等添加剂，将种子培养物按 1/100 的比例稀释。
    1. 在 37 °C 下剧烈振荡培养细胞，使其在冷却至 20 °C 前生长至 600 nm 处吸光度（Abs）为 0.4–0.6（对数中期）。加入 1 mM IPTG 诱导表达，并继续培养过夜。
    2. 随后，在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟收集细胞，并用移液器弃去上清液。
  3. 将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中，在 4 °C 下以 4,000 × g 再次离心 15 分钟，然后用移液器弃去上清液。将剩余沉淀重悬于 10 mL 裂解缓冲液中，于 37 °C 孵育 1 小时。
    注意：裂解缓冲液的组成为：50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、2% Triton-X100、500 ng/mL 溶菌酶、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM 二硫苏糖醇、1 mM MgCl2，pH 8（参见 材料表）。
    1. 将混合物进行两次冻融循环（-80 °C），在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟以分离可溶性和不溶性组分，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），特别是十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE33（图 2B、C）进行分析。
      注意：细胞可通过多种方式裂解，例如冻融、超声处理、均质化、酶解裂解，或上述方法的组合。建议从包涵体中纯化以获得较高的蛋白产量26。
  4. 使用 Ni-NTA 柱层析法纯化蛋白（参见 材料表）。将可溶性组分以 1 mL/min 的流速上样至再生的 Ni-NTA 微珠柱。在开始梯度洗脱（在 60 分钟内使用含 0–100% 500 mM 咪唑的 TBS 缓冲液）前，先用 TBS 缓冲液（50 mM Tris、150 mM 氯化钠，pH 7.5）洗涤系统，并以 1 mL/min 的流速收集洗脱组分。将纯化后的蛋白在 100 mM PBS 中透析，用于生化表征（图 2C、D）。
  5. 或者，可在 14 mL 离心管中使用 His-Select Ni2+ 亲和凝胶（参见 材料表），分别用含 20 mM 和 250 mM 咪唑的缓冲液结合并重悬带有 His 标签的重组表达的 CV-N。批式孵育至少 30 分钟。
    注意：可将这些半纯化蛋白上样至一次性预装柱，用于缓冲液置换及生物样品（如碳水化合物和蛋白质）的净化处理，例如可加载 1–1.5 mL 来自固定化金属亲和层析的洗脱液。
  6. 将蛋白溶液转移至含有 10 kDa 截留分子量滤膜的离心管（参见 材料表），在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 10 分钟进行浓缩。对于 SPR 测量，将分析物溶液置换为 10 mM HEPES、150 mM 氯化钠、3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.05% Tween20，pH 7.4（HBS-EP(+)，参见 材料表）。
    1. 将 SPR 运行缓冲液按 1:10 稀释，加入后在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 10 分钟，重复四次，每次恢复至初始体积。
  7. 使用 NanoDrop 紫外-可见分光光度计（参见 材料表）在 280 nm 处测定蛋白浓度，依据主蛋白 CVN2L0 的计算消光系数（20,440 M-1 cm-1），其分子量为 23,474 Da34。以 PBS（100 mM，pH 7.0）或 SPR 缓冲液作为空白对照，测定三个稀释梯度（1:1、1:10 和 1:100）下的蛋白浓度。

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图 2：CV-N 序列与表达。（A）在 E. coli 中，使用 pET11a 载体表达 CVN2，其两个 CV-N 重复单元之间无连接肽（每个重复单元为 101 个氨基酸），并含有四条二硫键。（B）CV-N（单体）和 CVN2（二聚体）两个独立克隆的表达情况。（C）二硫键突变体经纯化后通过 SDS-PAGE 分析。使用低分子量蛋白 Marker（6 µL）作为参照。WT = CVN2L0，含有如（A）中标注的四条二硫键；V2 是在第 58 和 73 位以极性残基取代二硫键的突变体；V3–V5 是保留两条 S-S 键的突变体，分别以极性（C58E-C73R）或非极性（C58W-C73M）氨基酸取代，或二者残基对取代的组合形式。（D）纯化的 CVN2L0 的 HPLC 色谱图，流动相流速为 1 mL/min，缓冲液 B 在缓冲液 A 中以 5%–65% 的线性梯度在 30 分钟内洗脱。缓冲液 A 为：ddH2O 中含 0.1%（v/v）三氟乙酸；缓冲液 B 为：乙腈中含 0.08%（v/v）三氟乙酸。蛋白在高效硅胶 300-5-C4（150 x 4.6 mm）柱上于 214 nm 和 280 nm 处检测。 请点击此处查看此图的放大版本。

7. 表面等离子体共振光谱法

  1. 使用双通道 SPR 系统（参见材料表），以 HBS-EP(+) 为运行缓冲液，10 mM 盐酸甘氨酸（pH 1.5–1.6）作为再生缓冲液。开启仪器、脱气装置、自动进样器和泵，用 ddH2O 清洗整个系统 1 小时。将准备好的运行缓冲液置于单独的瓶中。
  2. 在检测器上滴加浸油，然后将涂有薄金膜、上表面修饰有羧甲基葡聚糖水凝胶的玻璃传感器芯片（参见材料表）直接安装到三通道流通池下方的检测器上。通过下拉操作手柄固定装置。
    注：C19RBDHC30M 200 nm 链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶芯片，其表面中等密度固定有生物素化的严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）受体结合域（RBD）蛋白，是一种预固定配体的即用型传感器芯片。

8. CV-N 与 HA、S 蛋白及 RBD 结合的 SPR 结合实验

  1. 按照以下步骤将蛋白质配体固定到传感器芯片上。
    1. 通过点击打开一个运行表格 表格 在菜单栏中 运行表格编辑器 在集成的 SPRAutoLink 软件中（参见 材料表）。选择并点击 基础_固定化 从可用的运行表格列表中选择，并按照计算机屏幕上显示的实验步骤进行操作。所使用的相应样品编辑器显示在右上角。
    2. 点击 样本集编辑器 在“表单”部分填写自动进样器中两个样品架的试剂列表，以进行后续分析。点击 自动进样器直接控制 作为一种 "工具" 在菜单栏中选择将架子向前或向后移回原位。选择 4 °C 作为工作温度。
      注意：SPR 软件允许进行 "SPR 仪器直接控制" 和 "泵直接控制" 通过 选择相应的工具，以及自动进样器操作，并通过点击 表格；也 运行表格编辑器，数据-绘图，或 后处理 可选择进行数据分析。文件将直接保存在默认目录中，并从“后处理”窗口导出为 scrubber.files。
  2. 启动泵以灌注 ddH₂O20，通过单击 工具 和 泵直接控制 并单击记录数据 SPR 仪器直接控制，且每次 开始 在新出现的窗口中。将偶联试剂（步骤 8.3）放入 300 µL 小瓶，放入自动进样器架子中，然后通过点击运行表开始运行 运行.
    注意：芯片表面可用 10 mM 甘氨酸缓冲液（pH 9.0）进行预处理，或用 1 M 氯化钠、0.1 M 硼酸钠缓冲液（pH 9.0）冲洗，以对羧基衍生化芯片表面进行预处理，用于 EDC/NHS 活化混合液的活化30.
  3. 对于这种简单的蛋白质-蛋白质相互作用，使用 CMD500D 芯片（参见 材料表) 以生成微折射率单位（µRIU) = 2500 - 3000 流通池，固定化 HA 和 µRIU = 400 流通池与刺突蛋白。在灌注流速为 15 µL/min，通过执行以下连续步骤，注入0.4 M盐酸N-乙基-N'-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC*HCl）和0.1 M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的等体积水溶液混合物。
    1. 泵补充液补充 25,000 µL/min，进行30秒的基线调整，然后注入 90 µL 在6分钟接触时间内加入样品活化溶液（EDC/NHS），然后继续孵育5分钟。
    2. 在基线运行1 min后重复此循环 10 µL/min 仅在左侧流动池（蓝色）中注入并固定化学合成的多肽10，HA 和刺突蛋白在 20 µg/mL，并允许后续使用 ddH₂O 进行基线校正2O 1.5 分钟，然后用 1 M 盐酸乙醇胺（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。
  4. 将管路从液体进样器切换至盛有ddH₂O的脱气装置20 加入含 HBS-EP(+) 的瓶中（补充图1).
  5. 分析 SPR 传感图。
    1. 为进行动力学研究，使用不同浓度的分析物（10-5-10-8 M），每次进样后进行再生步骤，并在不同分析物检测后进行空白测量。改变流速至 10 µL/min 注射开始，接触时间4 min，随后5 min的基线生成，以及两次再生步骤，每次2 min，间隔30 s。
    2. 注入缓冲液进行空白测量，其传感器图将从样品运行中扣除，以校正不同蛋白质浓度。
  6. 点击 表格，向下滚动，然后更改为 "后处理" 通过单击此操作模式。单击 添加 在“数据绘图格式”中选择每个流通池随时间生成的结合曲线，并将叠加结果导出为scrubber文件（.ovr）。点击“文件”以打开文件保存选项。通过比对左、右曲线，并从配体通道信号中减去第二参考通道信号，获得响应曲线。
    注意：数据在操作中 "后处理" 通过计算方法定义传感器图。可将其叠加至左侧和右侧流通池的传感器图，或表示为两个通道差值的传感器图。
  7. 在结合测量前后，使用 50–100 mM pH 9.5 甘氨酸缓冲液、水和 20% 乙醇清洗整个流体系统，以去除盐分或蛋白质污染残留；或采用更严格的清洗方式，使用 0.5% SDS 和甘氨酸缓冲液。
    注意：为防止仪器损坏，若芯片在缓冲液或100%湿度条件下储存，在将芯片盒重新插入仪器前，建议检查玻璃芯片的机械稳定性。

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结果

通过三次独立的表面等离子体共振实验，检测二聚体结构域交换型CVN2L0分子与HA顶部区域的结合情况，结合亲和力以K值表示。D 值。假设B区包含受二硫键替换为离子残基所影响的氢键结合位点，而A区形成L10,18首先通过单次注射CVN2L0及其变体V2（三个二硫键桥）和V5（两个二硫键桥）检测其与HA偶联传感器芯片的结合情况，以评估结合容量，随后使用自动进样器和运行表编辑器设置动力学测定图 3A 和 补充图2）。重复注射在纳摩尔浓度范围内以不同浓度的 CVN2L0、V2 和 V5 进行系列自动化操作。 µ-摩尔范围随时间在系统中的变化（图3B- D）。通过关联完整的Cys-Cys键数量，CVN2L0与固定的HA结合，其结合常数为KD = 255 nM 时...

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讨论

CV-N 的结合亲和力与其功能性结合位点的数量相关 [2H 位于 B 结构域，2L 位于经工程化改造为结构域交换二聚体时的 A 结构域]。一种结合亲和力改变的变体（CVN2L0-V2，一种包含二硫键敲除的同源二聚体稳定折叠构型的 CV-N）在 E. coli，经纯化，并通过表面等离子共振（SPR）检测证实可特异性结合HA蛋白（H3N2）10，且在H或L碳水化合物结合位点与HA结合时发生构象变化，并伴有KD1 = 49 nM 和 KD2 = 8 µM38随着CVN2中糖链靶向口袋附近的二硫键数量从4个减少到2个，其与HA蛋白的结合亲和力降低（图3B-D 和 补充表1）。通过将半胱氨酸（Cys）进行替换，并插入极性残基对Glu - Arg，可构建二硫键变体，其稳定性略有降低。除上述改变外，这些变体代表相同的分子，且四个结合位点...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢维也纳工业大学生物技术和微生物学系以及维也纳医科大学医学三部肾病和透析科的Christian Derntl博士，特别是Markus Wahrmann博士在技术和科学方面的支持。哺乳动物细胞中的蛋白表达得到了维也纳自然资源与生命科学大学（BOKU）生物技术系的支持。作者谨向德国杜塞尔多夫XanTec bioanalytics公司的Nico Dankbar博士致以诚挚谢意，感谢他在开展表面等离子共振（SPR）结合实验过程中提供的有益科学讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Äkta primeplusCytiva
Amicon 离心管MerckC7715
氨苄青霉素Sigma-AldrichA5354
Beckman Coulter Cooler Allegra X-30R 离心机Beckman CoulterB06320
涂布棒Sigma-AldrichHS86655银质不锈钢，棒长 33 mm
定制 DNA 寡核苷酸Sigma-AldrichOLIGO
定制基因合成GenScript#1390661 克隆载体：pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ 缓冲液 10, 4x50 mLThermo Scientific50-105-5354
Dionex UlitMate 3000Thermo ScientificIQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I 限制性内切酶 (10 U/μL) Fisher ScientificER1701
DTTMerckDTT-RO
EDCMerck39391
EDTAMerckE9884
Eppendorf Safe-Lock 管Eppendorf30120086
Eppendorf Safe-Lock 管Eppendorf30120094
Eppendorf Minispin 和 MiniSpin Plus 微型离心机Sigma-AldrichZ606235
乙醇Merck51976
乙醇胺盐酸盐MerckE6133
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖，无菌，25 个/包Corning352057
葡萄糖MerckG8270
甘氨酸盐酸盐Merck55097
HA H3 蛋白Abcamab69751
HEPESMerckH3375
His-select Ni²⁺MerckH0537
咪唑MerckI2399
IPTGMerckI6758
卡那霉素 ASigma-AldrichK1377
Kromasil 300-5-C4Nouryon
LB 琼脂Merck52062
LB 琼脂Merck19344
LB LennoxMerckL3022
溶菌酶Merck10837059001
氯化镁MerckM8266
硫酸镁MerckM7506
NaH2PO4MerckS0751
NanoDrop UV-Vis 2000c 分光光度计Thermo ScientificND2000CLAPTOP
NaOHMerckS5881
NHSMerck130672
NZ 胺（酪蛋白水解物）MerckC0626
PBSMerck806552
PD MidiTrap G-10Sigma-AldrichGE28-9180-11
蛋白胨Merck70171
pET11aMerck Millipore (Novagen)69436 
PMSFMerckPMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (1000)Qiagen27106X4
Reichert 软件包 Autolink1-1-9Reichert
Reichert SPR SR7500DC 双通道系统Reichert
用于数据分析的 Scrubber2-2012-09-04Reichert
SDSMerck11667289001
定点突变试剂盒（含 pUC18 对照质粒）Stratagene#200518
氯化钠MerckS9888
乙酸钠三水合物Merck236500
SPR 传感器芯片 C19RBDHC30MXanTec bioanalyticsSCR C19RBDHC30M
SPR 传感器芯片 CMD500DXanTec bioanalyticsSCR CMD500D
Sterilin 标准 90 mm 培养皿Thermo Scientific101R20
TBSMerckT591210x 溶液
吐温-100MerckT8787
胰蛋白胨Merck93657
吐温-20MerckP1379
Vortex-Genie 2 混匀仪MerckZ258423
X-galMerckXGAL-RO
XL1-Blue 超感受态细胞Stratagene#200236
酵母提取物MerckY1625

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