本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具,以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD 值。
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本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具,以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD 值。
表面等离子体共振(SPR)用于测量血凝素(HA)与结构域交换的蓝藻病毒素-N(CV-N)二聚体的结合,并监测甘露糖化肽与CV-N高亲和力结合位点之间的相互作用。已有报道指出,病毒包膜刺突蛋白gp120、HA和埃博拉糖蛋白(GP)1,2可结合于二聚体CVN2上的高亲和力和低亲和力结合位点。双甘露糖基化HA肽也被证实可结合至一种工程化CVN2分子的两个低亲和力结合位点,该分子含有针对相应配体的高亲和力结合位点,并通过突变将碳水化合物结合口袋中的稳定二硫键替换为极性残基对(谷氨酸与精氨酸),从而验证了多价结合的存在。HA与伪抗体CVN2的一个高亲和力结合位点结合,其解离常数(KD为275 nM,该结合可通过寡聚化进一步中和1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。在结构域交换的CVN2中,通过将半胱氨酸替换为谷氨酸和精氨酸的极性残基对,二硫键数量从4个减少至2个,导致其对血凝素(HA)的结合亲和力降低。在已知最强的相互作用中,CVN2利用不含跨膜结构域的包膜糖蛋白,在低纳摩尔范围内通过两个高亲和力结合位点结合埃博拉病毒GP1,2。在本研究中,多特异性单体CV-N与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)糖蛋白的结合亲和力测得KD = 18.6 µM,与纳摩尔级的 KD 与其他病毒刺突蛋白相比,以及 通过 其受体结合域,处于中等微摩尔浓度范围µ微摩尔范围
由干扰素-α诱导的与tetherin相关的抗病毒活性包含基于蛋白质的锚定结构,可导致完全形成的病毒颗粒滞留在感染细胞表面1. 束素蛋白糖基化在抑制病毒释放中的必要性仍不明确,提示糖基化模式对重组表达的糖链功能具有重要意义 体外 研究1,2,这取决于(以流感病毒为例)表面表达的流感血凝素HA的构象3,4已发现,N-连接糖基化位点上连接的寡糖修饰足以介导tetherin对1型人类免疫缺陷病毒释放的限制作用2,而二聚化在阻止病毒释放过程中起着关键作用,因此涉及跨膜区或糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结构,以锚定出芽的病毒颗粒5人类和小鼠tetherin的独特特征可抑制多种包膜病毒、逆转录病毒和丝状病毒。BST-2/tetherin是先天免疫系统中一种由干扰素诱导的抗病毒蛋白1,6,具有广谱抗病毒活性,且可被包膜糖蛋白拮抗5 转运tetherin或破坏tetherin的结构6例如,甲型流感病毒表面表达的包膜糖蛋白HA和神经氨酸酶在不同毒株中以毒株特异性方式发挥牵连蛋白拮抗作用7,有助于识别宿主受体结合位点8糖类靶向抗体与其在血凝素(HA)上快速定制的糖类保护层之间的相互作用化学计量关系被用于研究,从而产生对甲型流感病毒H3N2和H1N1亚型的结合亲和力4.
为阐明抗病毒药物与病毒包膜刺突(即糖类配体)之间的结合机制,采用单一、双重及三重甘露糖基团的化学合成方法,并结合免疫学与光谱学手段,制备甘露糖化肽 通过 β-乙酰基糖基叠氮化物的叠氮糖基化反应转化为1,2-反式糖基叠氮化物9,模拟危及生命的病毒表面常见的N-乙酰葡萄糖胺和高甘露糖型寡糖。采用三唑类生物等排体来模拟构成血凝素肽甘露糖基化残基的连接结构10 并促进抗病毒CV-N衍生物在HA头部结构域第二个N-连接糖基化位点(HA顶端,含4个N-连接糖链N54、N97、N181、N301)周围的特定位点相互作用8,11,12谷氨酸(Glu)与精氨酸(Arg)之间的相互作用及其所导致的螺旋偶极效应表现出两种模型肽和蛋白质的良好稳定性,但需通过表面等离子共振(SPR)进行可视化。若与识别HA上单一化学合成的糖基化位点相比较10 通过直接抑制糖链部分上的受体结合,一种四点突变的Fc结构对其受体表现出更高的亲和力,从而引发效应功能 体内,揭示了与Fc突变体相连的N-连接聚糖的非相关组成是由机制决定的13.
CV-N 对 HIV14,15、流感病毒16 和埃博拉病毒具有抗病毒活性,其作用机制是通过纳摩尔级结合包膜刺突蛋白上的高甘露糖型寡糖修饰12,17,18,19。流感病毒血凝素(HA)与 CV-N 中的一个高亲和力碳水化合物结合位点(H)或共价连接的二聚体 CVN2 中的两个 H 位点结合,其平衡解离常数(KD)分别为 5.7 nM(图 1A)和 KD = 2.7 nM。CV-N 和 CVN2 还各含有一个或两个低亲和力碳水化合物结合位点(L)12,17,20,21。埃博拉病毒 GP1,2 与 CVN2 的两个 H 位点(2H)结合,亲和力处于较低的纳摩尔范围(KD = 26 nM)。野生型 CV-N 与埃博拉病毒 GP1,2 和 HA 的结合亲和力范围为 KD = 34 nM 至 KD = 5.7 nM(A/New York/55/04)12。凝集素(如 CV-N)可特异性靶向病毒包膜上的高甘露糖型糖链,进一步抑制丙型肝炎病毒、SARS-CoV、疱疹病毒、马尔堡病毒和麻疹病毒的复制22。
小分子CV-N已被深入研究超过20年,因其能够结合多种病毒,从而抑制病毒进入细胞16,18结构分析和结合亲和力测定表明,二价结合在微摩尔范围内可促进两个L链在结构域交换的CVN2二聚体中交联,从而增强对病毒包膜糖蛋白的结合力10,19Manα1-2Manα 在 Man(8) D1D3 支链和 Man(9) 上的选择性结合包含两个位于相反蛋白原体上的不同亲和力结合位点20,从而达到纳摩尔级的结合亲和力(图1B因此,CVN2 被视为一种拟抗体,可用于结合 HIV gp120 上的表位,作用类似于病毒中和抗体。17在此,作者旨在研究CVN2与SARS-CoV-2刺突蛋白潜在的结合能力 通过 其受体结合域(RBD)。固定化的人血管紧张素转换酶2(ACE2)与SARS-CoV-2 RBD结合的结合曲线得到KD = 4.7 nM,针对此具有生物学意义的结合相互作用23.
相比之下,某些免疫球蛋白类别可识别特定且稳定的结构蛋白模式,这些模式为膜锚定的HA区域中的亲和力成熟提供了底物24。CV-N在几乎所有甲型和乙型流感病毒中均表现出强效活性16,是一种广谱中和性抗病毒剂。目前对于HA1和HA2茎部区域上靶向表位的具体位置仍了解不足,这些区域可能包含高效中和抗体识别的糖链靶向表位结构,并可与凝集素结合方式进行比较25。

图1:CV-N与病毒包膜刺突蛋白结合的表面等离子体共振(SPR)检测示意图。(A)CV-N与配体HA全长蛋白(90 kDa)结合的SPR检测。动力学数据集(5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 nM),显示CV-N与固定化的流感病毒HA A/New-York/55/04(H3N2)实时双参考结合曲线。(B)CVN2L0变体V2在500 nM至16 µM浓度范围内与固定化配体DM的结合情况。序列中,L残基以黄色高亮,H残基以灰色高亮。E58和R73取代了野生型蛋白中的半胱氨酸,使V2形成具有三个而非四个二硫键的稳定蛋白构象。请点击此处查看该图的放大版本。
膜远端HA顶端的聚糖屏障可诱导其与CV-N的高亲和力结合12,此外,CVN2与HA顶端二硫键邻近区域的低亲和力结合位点也已被观察到10,12。在CV-N介导的碳水化合物结合过程中,已鉴定出多种极性相互作用及相互作用位点。这些相互作用通过在结合位点构建敲除突变体,并将其结合亲和力与in silico预测的糖基化模式进行关联分析而得以验证12。因此,本项目旨在比较先前测试的化学甘露糖基化HA肽段与SARS相关2019-nCoV刺突蛋白及SARS-CoV-2中天然存在的、仅含少数不同N-连接和O-连接糖基化位点的短肽序列在结合亲和力和特异性上的差异。Pinto及其同事利用冷冻电子显微镜和结合实验报道了一种单克隆抗体S309,该抗体可能识别Sarbecovirus亚属中SARS-CoV-2刺突蛋白上包含保守糖链的一个表位,且不干扰受体结合26。本研究的实验方案描述了设计、表达和表征CV-N突变体的方法,这对于利用SPR技术研究CV-N和CVN2如何与糖基化蛋白及合成甘露糖基化肽段结合具有重要意义10,12。
串联连接的二聚体 CVN2L027 及其结合位点变体(V2-V5)通过重组表达获得,其中部分变体含有二硫键替换(C58E 和 C73R)(图 2A)。此外,还制备了在 E41A 位点发生单点突变的突变体,因为该位点被认为是分子间交叉接触的关键残基。该突变体是表面等离子共振(SPR)结合实验中研究凝集素与高甘露糖型寡糖之间相互作用的另一种重要分子,可用于解析结合结构域,并与二聚体形式进行比较。CVN2 的结构域交换晶体结构显示其连接区具有柔性,长度介于 49 至 54 个残基之间。两个结构域可作为刚性体围绕铰链区域自由运动,通过分子内结构域相互作用形成单体(结构域 A:残基 1-39 和 90-101;结构域 B:残基 40-89),或通过分子间结构域交换形成二聚体[第一个单体的结构域 A 与第二个单体的结构域 B 配对,第一个单体的结构域 B 与第二个单体的结构域 A 配对]。除 Glu4128 外,两个原体的结构域 A 与 B 之间不存在紧密的相互作用。CV-N 基因可通过重复 PCR 方法构建,使用合成的 40-mer 寡核苷酸片段29,随后亚克隆至 pET11a 载体的 NdeI 和 BamHI 位点,并按 Keeffe, J.R.27 所述方法通过电穿孔转化至电感受态细胞中。用于解析相应晶体结构(PDB ID 3S3Y)的蛋白在其 N 端包含一个 6×组氨酸纯化标签,其后接一个 Xa 因子蛋白酶切割位点。定点突变技术被用于引入点突变、改变密码子,或插入或删除单个或多个碱基/密码子以实现氨基酸替换。这些改造为理解蛋白质功能与结构提供了宝贵信息。重组表达并纯化的 CV-N、CVN2 和 CVN3 已在生物物理层面得到深入研究20,21,27,且生产成本低廉,因此被广泛用于表征结合在 SPR 传感器芯片上的糖类配体的结合实验。传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)在糖配体固定化技术方面重现性较差,且将 SPR 所能呈现的实时结合过程转化为终点检测,无法动态反映不同结合位点变体的结合行为。
结合亲和力变异体 CVN2L0-V2(具有二硫键替换的完整同源二聚体 CV-N 折叠结构)10) 在带有 His 标签的情况下表达 大肠杆菌 (E. coli), 通过镍-NTA亲和层析柱纯化,并利用表面等离子共振技术检测其与HA(H3N2)、单甘露糖基化HA肽段及双甘露糖基化HA肽段的结合能力。化学甘露糖基化的肽段、HA蛋白和S蛋白均作为配体,通过胺偶联法固定于亲水芯片表面 通过 活性酯或生物素-链霉亲和素蛋白工程。对这些配体采用相同的连续运行程序,注入不同稀释浓度的CV-N及其变体(以及CVN2),以获得分子相互作用分析的动力学信息,如下所述。30使用RBD固定的SPR传感器芯片进行CV-N与S肽的结合研究,并将亲和力与SARS-CoV-2与人ACE2的结合进行比较。
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在本研究中,使用了CVN-小泛素样修饰蛋白(SUMO)融合蛋白替代CV-N,用于酶联免疫吸附试验,并适用于基于细胞的检测。重组全长甲型流感病毒HA H3蛋白通过商业途径获得(见 材料表)或根据标准方案在哺乳动物HEK293细胞系和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达12武汉-1刺突蛋白在哺乳动物HEK293细胞中表达。单甘露糖基化肽(MM)和双甘露糖基化肽(DM)的合成,使得均一性配体对CVN2及单甘露糖基化小分子的检测成为可能。10.
1. 构建CV-N表达载体
2. 含质粒DNA转化细胞的LB琼脂平板的制备
3. 克隆
4. 定点突变
5. 细菌细胞的转化
6. 表达与蛋白纯化

图2:CV-N序列与表达。(A)在大肠杆菌(E. coli)中,使用pET11a载体表达无连接肽的CVN2(每个CV-N重复单元含101个氨基酸残基),并具有四个二硫键。(B)CV-N(单体)和CVN2(二聚体)两个独立克隆的表达情况。(C)二硫键突变体经纯化后进行SDS-PAGE分析。使用低分子量标记物(6 µL)作为参照。WT = CVN2L0,含有如(A)中标注的四个二硫键。V2为在58和73位点由极性残基取代二硫键的变体。V3-V5为保留两个S-S键的变体,分别引入极性(C58E-C73R)或非极性(C58W-C73M)替代氨基酸,或这些残基对替代的组合。(D)纯化的CVN2L0通过HPLC色谱分析,流速为1 mL/min,在30分钟内以缓冲液A中5%-65%的缓冲液B进行线性梯度洗脱。缓冲液A为:ddH2O中含0.1%(v/v)三氟乙酸;缓冲液B为:乙腈中含0.08%(v/v)三氟乙酸。蛋白在高性能硅胶300-5-C4(150 x 4.6 mm)柱上于214 nm和280 nm处检测。 请点击此处查看该图的放大版本。
7. 表面等离子体共振光谱法
8. CV-N 与 HA、S 蛋白和 RBD 结合的 SPR 结合实验
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二聚体结构域交换型CVN2L0分子在三次独立的表面等离子共振实验中检测其与血凝素顶部区域的结合能力,结合亲和力以K值表示D 值。假设B区包含氢键结合位点,这些位点在二硫键被替换为离子残基时会受到影响,而A区则形成L10,18首先通过单次注射CVN2L0及其变体V2(三个二硫键)和V5(两个二硫键)至HA偶联的传感器芯片,检测其结合能力,以评估结合容量,随后使用自动进样器和运行表编辑器设置动力学测定图3A 和 补充图2)。在纳米摩尔浓度范围内,对一系列CVN2L0、V2和V5进行重复注射的自动化操作 µ-摩尔范围随时间在系统中的变化(图3B- D)。通过关联完整Cys-Cys键的数量,CVN2L0与固定的HA结合,其结合常数为KD = 255 nM 时达到良好饱...
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CV-N 的结合亲和力与其功能性结合位点的数量相关 [2H 位于 B 结构域,2L 位于经工程化改造为结构域交换二聚体时的 A 结构域]。一种结合亲和力改变的变体(CVN2L0-V2,一种包含二硫键敲除的同源二聚体稳定折叠构型的 CV-N)在 E. coli,经纯化,并通过表面等离子共振(SPR)检测证实可特异性结合HA蛋白(H3N2)10,且在H或L碳水化合物结合位点与HA结合时发生构象变化,并伴有KD1 = 49 nM 和 KD2 = 8 µM38随着CVN2中糖链靶向口袋附近的二硫键数量从4个减少到2个,其与HA蛋白的结合亲和力降低(图3B-D 和 补充表1)。通过将半胱氨酸(Cys)进行替换,并插入极性残基对Glu - Arg,可构建二硫键变体,其稳定性略有降低。除上述改变外,这些变体代表相同的分子,且四个结合位点...
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢维也纳工业大学生物技术和微生物学系以及维也纳医科大学医学三部肾病和透析科的Christian Derntl博士,特别是Markus Wahrmann博士在技术和科学方面的支持。哺乳动物细胞中的蛋白表达得到了维也纳自然资源与生命科学大学(BOKU)生物技术系的支持。作者谨向德国杜塞尔多夫XanTec bioanalytics公司的Nico Dankbar博士致以诚挚谢意,感谢他在开展表面等离子共振(SPR)结合实验过程中提供的有益科学讨论。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon 离心管 | Merck | C7715 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckman Coulter Cooler Allegra X-30R 离心机 | Beckman Coulter | B06320 | |
| 涂布棒 | Sigma-Aldrich | HS86655 | 银质不锈钢,棒长 33 mm |
| 定制 DNA 寡核苷酸 | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| 定制基因合成 | GenScript | #1390661 | 克隆载体:pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ 缓冲液 10, 4x50 mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I 限制性内切酶 (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管 | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管 | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin 和 MiniSpin Plus 微型离心机 | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| 乙醇 | Merck | 51976 | |
| 乙醇胺盐酸盐 | Merck | E6133 | |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管,带卡扣盖,无菌,25 个/包 | Corning | 352057 | |
| 葡萄糖 | Merck | G8270 | |
| 甘氨酸盐酸盐 | Merck | 55097 | |
| HA H3 蛋白 | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni²⁺ | Merck | H0537 | |
| 咪唑 | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| 卡那霉素 A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB 琼脂 | Merck | 52062 | |
| LB 琼脂 | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| 溶菌酶 | Merck | 10837059001 | |
| 氯化镁 | Merck | M8266 | |
| 硫酸镁 | Merck | M7506 | |
| NaH2PO4 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis 2000c 分光光度计 | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ 胺(酪蛋白水解物) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| 蛋白胨 | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert 软件包 Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC 双通道系统 | Reichert | ||
| 用于数据分析的 Scrubber2-2012-09-04 | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| 定点突变试剂盒(含 pUC18 对照质粒) | Stratagene | #200518 | |
| 氯化钠 | Merck | S9888 | |
| 乙酸钠三水合物 | Merck | 236500 | |
| SPR 传感器芯片 C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR 传感器芯片 CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin 标准 90 mm 培养皿 | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x 溶液 |
| 吐温-100 | Merck | T8787 | |
| 胰蛋白胨 | Merck | 93657 | |
| 吐温-20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 混匀仪 | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue 超感受态细胞 | Stratagene | #200236 | |
| 酵母提取物 | Merck | Y1625 |
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