本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具，以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD 值。
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摘要
摘要
表面等离子体共振（SPR）用于测量血凝素（HA）与结构域交换的蓝藻病毒素-N（CV-N）二聚体的结合，并监测甘露糖化肽与CV-N高亲和力结合位点之间的相互作用。已有报道指出，病毒包膜刺突蛋白gp120、HA和埃博拉糖蛋白（GP）1,2可结合于二聚体CVN2上的高亲和力和低亲和力结合位点。双甘露糖基化HA肽也被证实可结合至一种工程化CVN2分子的两个低亲和力结合位点，该分子含有针对相应配体的高亲和力结合位点，并通过突变将碳水化合物结合口袋中的稳定二硫键替换为极性残基对（谷氨酸与精氨酸），从而验证了多价结合的存在。HA与伪抗体CVN2的一个高亲和力结合位点结合，其解离常数（KD为275 nM，该结合可通过寡聚化进一步中和1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）。在结构域交换的CVN2中，通过将半胱氨酸替换为谷氨酸和精氨酸的极性残基对，二硫键数量从4个减少至2个，导致其对血凝素（HA）的结合亲和力降低。在已知最强的相互作用中，CVN2利用不含跨膜结构域的包膜糖蛋白，在低纳摩尔范围内通过两个高亲和力结合位点结合埃博拉病毒GP1,2。在本研究中，多特异性单体CV-N与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）糖蛋白的结合亲和力测得KD = 18.6 µM，与纳摩尔级的 KD 与其他病毒刺突蛋白相比，以及 通过 其受体结合域，处于中等微摩尔浓度范围µ微摩尔范围
引言
由干扰素-α诱导的与tetherin相关的抗病毒活性包含基于蛋白质的锚定结构，可导致完全形成的病毒颗粒滞留在感染细胞表面1. 束素蛋白糖基化在抑制病毒释放中的必要性仍不明确，提示糖基化模式对重组表达的糖链功能具有重要意义 体外 研究1,2，这取决于（以流感病毒为例）表面表达的流感血凝素HA的构象3,4已发现，N-连接糖基化位点上连接的寡糖修饰足以介导tetherin对1型人类免疫缺陷病毒释放的限制作用2，而二聚化在阻止病毒释放过程中起着关键作用，因此涉及跨膜区或糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构，以锚定出芽的病毒颗粒5人类和小鼠tetherin的独特特征可抑制多种包膜病毒、逆转录病毒和丝状病毒。BST-2/tetherin是先天免疫系统中一种由干扰素诱导的抗病毒蛋白1,6，具有广谱抗病毒活性，且可被包膜糖蛋白拮抗5 转运tetherin或破坏tetherin的结构
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方案
在本研究中，使用了CVN-小泛素样修饰蛋白（SUMO）融合蛋白替代CV-N，用于酶联免疫吸附试验，并适用于基于细胞的检测。重组全长甲型流感病毒HA H3蛋白通过商业途径获得（见 材料表）或根据标准方案在哺乳动物HEK293细胞系和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达12武汉-1刺突蛋白在哺乳动物HEK293细胞中表达。单甘露糖基化肽（MM）和双甘露糖基化肽（DM）的合成，使得均一性配体对CVN2及单甘露糖基化小分子的检测成为可能。10.
1. 构建CV-N表达载体
- 针对每种CVN2变体及CVN2L0蛋白（PDB编号3S3Y），从商业来源获取带有N端pelB信号肽序列和His标签的pET27b(+)载体基因构建体（参见材料表，补充文件1）。
- 在CVN2L0模板基因背景下获得CVN2L0及其变体（V2、V3、V4和V5；图2A，C），该模板基因包含两个不同的DNA序列，分别对应每个CV-N重复单元。
- 将冻干的质粒DNA溶解于无菌去离子蒸馏水（ddH2O）中，终浓度为100 ng/µL。
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结果
二聚体结构域交换型CVN2L0分子在三次独立的表面等离子共振实验中检测其与血凝素顶部区域的结合能力，结合亲和力以K值表示D 值。假设B区包含氢键结合位点，这些位点在二硫键被替换为离子残基时会受到影响，而A区则形成L10,18首先通过单次注射CVN2L0及其变体V2（三个二硫键）和V5（两个二硫键）至HA偶联的传感器芯片，检测其结合能力，以评估结合容量，随后使用自动进样器和运行表编辑器设置动力学测定图3A 和 补充图2）。在纳米摩尔浓度范围内，对一系列CVN2L0、V2和V5进行重复注射的自动化操作 µ-摩尔范围随时间在系统中的变化（图3B- D）。通过关联完整Cys-Cys键的数量，CVN2L0与固定的HA结合，其结合常数为KD = 255 nM 时达到良好饱.......
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讨论
CV-N 的结合亲和力与其功能性结合位点的数量相关 [2H 位于 B 结构域，2L 位于经工程化改造为结构域交换二聚体时的 A 结构域]。一种结合亲和力改变的变体（CVN2L0-V2，一种包含二硫键敲除的同源二聚体稳定折叠构型的 CV-N）在 E. coli，经纯化，并通过表面等离子共振（SPR）检测证实可特异性结合HA蛋白（H3N2）10，且在H或L碳水化合物结合位点与HA结合时发生构象变化，并伴有KD1 = 49 nM 和 KD2 = 8 µM38随着CVN2中糖链靶向口袋附近的二硫键数量从4个减少到2个，其与HA蛋白的结合亲和力降低（图3B-D 和 补充表1）。通过将半胱氨酸（Cys）进行替换，并插入极性残基对Glu - Arg，可构建二硫键变体，其稳定性略有降低。除上述改变外，这些变体代表相同的分子，且四个结合位点.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢维也纳工业大学生物技术和微生物学系以及维也纳医科大学医学三部肾病和透析科的Christian Derntl博士，特别是Markus Wahrmann博士在技术和科学方面的支持。哺乳动物细胞中的蛋白表达得到了维也纳自然资源与生命科学大学（BOKU）生物技术系的支持。作者谨向德国杜塞尔多夫XanTec bioanalytics公司的Nico Dankbar博士致以诚挚谢意，感谢他在开展表面等离子共振（SPR）结合实验过程中提供的有益科学讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon 离心管 | Merck | C7715 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckman Coulter Cooler Allegra X-30R 离心机 | Beckman Coulter | B06320 | |
| 涂布棒 | Sigma-Aldrich | HS86655 | 银质不锈钢，棒长 33 mm |
| 定制 DNA 寡核苷酸 | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| 定制基因合成 | GenScript | #1390661 | 克隆载体：pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ 缓冲液 10, 4x50 mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I 限制性内切酶 (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管 | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管 | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin 和 MiniSpin Plus 微型离心机 | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| 乙醇 | Merck | 51976 | |
| 乙醇胺盐酸盐 | Merck | E6133 | |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖，无菌，25 个/包 | Corning | 352057 | |
| 葡萄糖 | Merck | G8270 | |
| 甘氨酸盐酸盐 | Merck | 55097 | |
| HA H3 蛋白 | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni²⁺ | Merck | H0537 | |
| 咪唑 | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| 卡那霉素 A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB 琼脂 | Merck | 52062 | |
| LB 琼脂 | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| 溶菌酶 | Merck | 10837059001 | |
| 氯化镁 | Merck | M8266 | |
| 硫酸镁 | Merck | M7506 | |
| NaH2PO4 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis 2000c 分光光度计 | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ 胺（酪蛋白水解物） | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| 蛋白胨 | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert 软件包 Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC 双通道系统 | Reichert | ||
| 用于数据分析的 Scrubber2-2012-09-04 | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| 定点突变试剂盒（含 pUC18 对照质粒） | Stratagene | #200518 | |
| 氯化钠 | Merck | S9888 | |
| 乙酸钠三水合物 | Merck | 236500 | |
| SPR 传感器芯片 C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR 传感器芯片 CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin 标准 90 mm 培养皿 | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x 溶液 |
| 吐温-100 | Merck | T8787 | |
| 胰蛋白胨 | Merck | 93657 | |
| 吐温-20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 混匀仪 | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue 超感受态细胞 | Stratagene | #200236 | |
| 酵母提取物 | Merck | Y1625 |
参考文献
- Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
- Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin i....
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