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方法文章

三维无血清泪腺干细胞培养系统

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DOI：

10.3791/63585

⸱

2022年6月2日

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

本文内容

摘要

成年泪腺（LG）干细胞的三维无血清培养方法已较为成熟，可用于诱导LG类器官形成，并分化为腺泡样或导管样细胞。

摘要

基于泪腺干细胞的治疗是泪腺疾病的一种有前景的策略。然而，目前缺乏一种可靠且无血清的培养方法来获得足够数量的泪腺干细胞（LGSCs），这成为进一步研究和应用的障碍。本文展示了已建立完善的成年小鼠泪腺干细胞三维（3D）、无血清培养方法。该方法中的泪腺干细胞可实现连续传代，并可被诱导分化为腺泡样或导管样细胞。

对于泪腺干细胞（LGSC）原代培养，取6至8周龄小鼠的泪腺（LGs），用中性蛋白酶（dispase）、I型胶原酶（collagenase I）和胰蛋白酶-EDTA进行消化。将总计1 × 104个单细胞接种至24孔板的每孔中，每孔含有80 µL基质凝胶-泪腺干细胞培养基（LGSCM）混合物，该孔预先包被有20 µL基质凝胶-LGSCM混合物。在37 °C孵育20分钟后，混合物凝固，随后加入600 µL LGSCM培养基。

对于LGSC的维持培养，将已培养7天的LGSCs用dispase和胰蛋白酶-EDTA消化为单细胞。单细胞按照LGSC原代培养的方法进行接种和培养。LGSC可连续传代超过40次，并持续表达干细胞/祖细胞标志物Krt14、Krt5、P63和nestin。在LGSCM培养基中培养的LGSC具有自我更新能力，可分化为腺泡样或导管样细胞 体外 和 体内.

引言

泪腺干细胞（LGSCs）维持泪腺（LG）细胞的更新，并是腺泡细胞和导管细胞的来源。因此，LGSC移植被视为治疗严重炎症性损伤和水液缺乏型干眼症（ADDED）的一种替代方法1,2,3已采用多种培养方法来富集低级别浆液性癌细胞（LGSCs）。Tiwari 等人. 采用胶原蛋白I和基质凝胶并补充多种生长因子分离并培养原代泪腺细胞；然而，泪腺细胞无法实现连续传代培养4采用二维（2D）培养方法，You 等人分离获得了小鼠泪腺来源的干细胞。5 以及 Ackermann 等人.6，发现表达干细胞/祖细胞标志基因， Oct4, Sox2, Nanog，以及 nestin，且可进行传代培养。然而，目前尚无明确证据表明这些细胞能够分化为腺泡细胞或导管细胞，也缺乏移植实验以验证其分化潜能 体内.

最近，c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- 通过流式细胞术从小鼠LG中分离出细胞，发现其表达LG前体细胞标志物（如Pax6和Runx1），并可分化为导管和腺泡 体外在患有ADDED的小鼠中，通过原位注射这些细胞可修复受损的泪腺并恢复其分泌功能2然而，通过该方法分离得到的干细胞数量较少，且目前尚无适合的培养条件用于扩增分离出的LGSCs。综上所述，需要建立一种合适的培养体系，以有效分离和培养成体LGSCs，并实现其稳定、持续的扩增，从而推动LGSCs在治疗ADDED中的研究。

源自干细胞或多能干细胞的类器官是一类在组织学上与相应器官相似且能够自我更新的细胞群。2009年Sato等人成功培养出小鼠肠道类器官7后，基于Sato的培养体系，相继实现了其他器官类器官的培养，如胆囊8、肝脏9、胰腺10、胃11、乳腺12、肺13、前列腺14和唾液腺15。由于在类器官培养中细胞分化前成体干细胞比例较高，三维（3D）类器官培养方法被认为是分离和培养泪腺成体干细胞的最佳方案。

本研究通过优化三维无血清培养方法，建立了成年小鼠泪腺干细胞（LGSC）培养体系。结果证明，源自正常小鼠和ADDED小鼠的LGSC均表现出稳定的自我更新和增殖能力。将LGSC移植至ADDED小鼠的泪腺后，细胞定植于受损泪腺并改善了泪液分泌。此外，从ROSA26小鼠中分离出表达红色荧光的LGSCmT/mG 小鼠和培养细胞。本研究为低级别浆液性癌（LGSC）的富集提供了可靠的参考依据 体外 以及LGSC自体移植在ADDED治疗中的临床应用。

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方案

本方案中的所有实验均遵循中山大学动物实验伦理委员会的动物护理指南。所有与细胞相关的操作均须在细胞操作室的超净工作台中进行。所有使用二甲苯的操作均须在通风橱中进行。

1. 低级别浆液性癌原代培养

  1. 泪腺（LG）分离
    1. 取一只6-8周龄的雄性BALB/c小鼠，剪开耳后皮肤以暴露泪腺及其周围的结缔组织。使用镊子进行钝性剥离，去除结缔组织，并取出泪腺。
    2. 在6 cm培养皿中用4 mL无菌的10 mM PBS溶液冲洗泪腺两次，以去除血液。将泪腺浸入含4 mL 75%乙醇的6 cm培养皿中处理10秒，随后立即用10 mM PBS冲洗两次。
  2. 获取泪腺单细胞
    1. 使用HEPES缓冲液（50 mM HEPES/KOH，pH 7.4；150 mM NaCl溶于超纯水）配制25 U/mL分散酶。用超纯水配制0.1% I型胶原酶溶液。
    2. 将泪腺切成小块（约1 mm3），转移至无菌15 mL离心管中，加入500 µL 25 U/mL分散酶和500 µL 0.1% I型胶原酶，在37 °C孵育1小时。
    3. 用10 mM PBS配制胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05 g/L胰蛋白酶，0.04 g/L EDTA）。将步骤1.2.2中的泪腺组织碎片用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C处理10分钟，并通过反复吹打将其解离为单细胞悬液。
    4. 将细胞悬液经70 µm滤膜过滤，收集滤液至无菌15 mL离心管中，以150 × g离心5分钟。
    5. 离心后弃去上清液，加入10 mL 10 mM PBS洗涤细胞沉淀，再次离心。
    6. 重复步骤1.2.5，弃去上清液后加入1 mL DMEM/F12（DMEM与Ham's F-12按1:1混合）重悬细胞沉淀。
  3. 泪腺干细胞（LGSC）原代培养
    1. 配制泪腺干细胞培养基（LGSCM），包含DMEM/F12、1× N2添加剂、1× B27添加剂、2 mM谷氨酰胺替代物、0.1 mM非必需氨基酸（NEAAs）、50 ng/mL小鼠表皮生长因子（EGF）、100 ng/mL成纤维细胞生长因子10（FGF10）、10 ng/mL Wnt3A以及10 µM Y-27632（ROCK抑制剂）。
    2. 在24孔板每孔中央加入20 µL基质胶-LGSCM混合基质（基质胶:LGSCM = 1:1）。用移液枪头将其铺展成直径6-8 mm的圆形，于37 °C孵育20分钟，以预包被孔底。
    3. 使用细胞计数仪测定细胞数量，将总数为1 × 104的细胞加入40 µL LGSCM中，再与40 µL基质胶混合。用移液器轻轻吹打混匀，得到基质胶-LGSCM混合物（基质胶:LGSCM = 1:1）。
    4. 用移液器小心地将80 µL上述混合液滴加至步骤1.3.2中已预包被的24孔板各孔区域上。
    5. 于37 °C孵育20分钟后，每孔加入600 µL LGSCM。
    6. 每隔两天更换一次各孔中的培养基。培养7天后，在倒置显微镜下（目镜：10×，物镜：4×）观察直径为100-300 µm的泪腺干细胞球体。
      注意：泪腺干细胞可连续培养超过14天。
  4. 按照上述步骤，分离并培养ROSA26mT/mG小鼠和干眼病（DED）模型小鼠（NOD/ShiLtJ）的原代泪腺干细胞。

2. LGSC 的维持与传代

  1. 移除球体培养孔中的培养基。
  2. 将培养7天的低级别浆液性癌（LGSC）球体用20 µL含10 U/mL中性蛋白酶（dispase）和100 µL 10 mM PBS溶液在37 °C下孵育30分钟，以进行解离。
  3. 将悬液转移至15 mL离心管中，在150 × g 条件下离心4分钟，弃去上清液。
  4. 加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C处理5分钟。随后加入1 mL 0.05%胰蛋白酶抑制剂（TI），反复吹打以中和胰蛋白酶活性，并将球体解离为单细胞。
  5. 在150 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，收集沉淀中的LGSC细胞。加入1 mL LGSC培养基（LGSCM）重悬细胞沉淀。
  6. 按照步骤1.3.1至1.3.6所述方法接种单细胞。

3. 低级别浆液性癌分化

  1. 步骤 1：在 LGSC 培养体系中，将 LGSCs 的培养时间从 7 天延长至 14 天，以实现随机分化。
  2. 步骤 2：在 LGSC 培养开始时，将基质胶-LGSCM 混合物的比例从 1:1 调整为 1:2，以促进导管细胞的分化。将 LGSCs 接种至基质中，诱导培养 14 天（参见步骤 1.3）。
  3. 步骤 3：传代后，将 LGSCM 替换为含 10% 胎牛血清（FBS）的 LGSCM 混合液，以诱导腺泡细胞分化。诱导分化持续 14 天。

4. 涎腺组织脱水

  1. 获取LG组织（步骤1.1.1），在6 cm培养皿中用4 mL无菌10 mM PBS溶液冲洗LG组织2 min。将组织转移至10%福尔马林溶液中固定24 h。
  2. 用10 mM PBS冲洗固定后的组织2 min以去除福尔马林，将组织转移至组织包埋盒中。将包埋盒放入自动脱水机中。
  3. 使用自动脱水机按以下程序对组织进行脱水：70%乙醇，2 h；80%乙醇，2 h；90%乙醇，30 min；95%乙醇，30 min；无水乙醇，30 min；无水乙醇，2 h；无水乙醇:100%二甲苯（1:1）混合液，30 min；100%二甲苯，30 min；100%二甲苯，2 h；100%二甲苯:石蜡（1:1）混合液，30 min；石蜡，2 h；石蜡，3 h。

5. 涎腺类器官/球体脱水

  1. 在1.5 mL微量离心管中获取LG类器官/球体（步骤2.1-2.3），加入1 mL无菌10 mM PBS溶液，清洗2分钟。
  2. 以100 × g 离心1分钟，弃去上清液。
  3. 配制4%多聚甲醛（PFA）溶液：将20 g PFA加入400 mL 10 mM PBS与40 µL 1 M NaOH的混合液中，充分振荡，然后置于65 °C水浴中加热2小时，直至PFA完全溶解。冷却至室温后，用10 mM PBS定容至500 mL，4 °C保存。
  4. 向含有类器官/球体沉淀的微量离心管中加入1 mL 4% PFA，将管子置于4 °C冰箱中固定至少24小时。
  5. 固定完成后，以100 × g 离心1分钟，弃去上清液。向含有类器官/球体沉淀的微量离心管中加入1 mL 10 mM PBS，用移液器轻轻吹打混匀2分钟，以洗去PFA。重复此步骤两次。
  6. 以100 × g 离心1分钟，弃去上清液。
  7. 加热包埋水凝胶使其溶解，取50–60 µL加入类器官/球体沉淀中并混匀。将混合物以液滴形式滴加至Parafilm表面，室温静置5分钟，使其凝固。
  8. 在新的1.5 mL微量离心管中对含类器官/球体的凝胶进行脱水处理，步骤如下：
    1. 向管中加入1 mL 50%乙醇，室温静置30分钟，用移液器吸除液体。依次将乙醇浓度更换为70%、80%、90%、95%，重复此步骤。
    2. 向管中加入1 mL无水乙醇，室温静置30分钟，用移液器吸除液体。重复此步骤一次。
    3. 向管中加入1 mL由0.5 mL无水乙醇与0.5 mL 100%二甲苯组成的混合液，室温静置30分钟，用移液器吸除液体。
    4. 向管中加入1 mL 100%二甲苯，室温静置30分钟，用移液器吸除液体。重复此步骤。
      注意：步骤5.8.5–5.8.6必须在65 °C金属浴中进行。
    5. 向管中加入1 mL由0.5 mL石蜡与0.5 mL 100%二甲苯组成的混合液，65 °C下静置30分钟，用移液器吸除液体。
    6. 向管中加入1 mL石蜡，65 °C下静置30分钟，用移液器吸除液体。重复此步骤，并将处理时间延长至1小时。

6. 石蜡包埋与切片

  1. 石蜡包埋
    1. 包埋前，打开包埋机并预热，使包埋机蜡缸中的石蜡熔化。
    2. 将脱水后的组织或类器官/球状体凝胶放入包埋铁盒的槽内，并将铁盒浸入包埋机的石蜡中。
    3. 取下塑料盖，将塑料包埋盒置于铁盒上覆盖。将包埋铁盒移至冷却台。
    4. 当石蜡在包埋盒中凝固成块后，将其从铁盒中取出，可直接切片或暂时储存于4 °C冰箱中。
  2. 石蜡切片
    1. 石蜡切片前，预先组装好石蜡切片机，并在切片机水槽中加入蒸馏水进行预热。当水温升至42 °C时开始切片。
    2. 将样本固定在石蜡切片机的样本槽上。切片过程中将切片厚度调整为5 µm。
    3. 连续切片样本。将完全展开的切片固定在切片机水槽中的防脱载玻片上。
    4. 切片完成后，将贴有组织样本的载玻片放入37 °C生化培养箱中干燥24小时。之后可暂时存放在4 °C冰箱中。

7. 苏木精和伊红染色

  1. 将石蜡切片在 60 °C 下熔解 30 分钟，用 100% 二甲苯浸泡 15 分钟，并重复一次。
  2. 在摇床上用无水乙醇处理切片 5 分钟。
  3. 在摇床上依次用 90% 乙醇、80% 乙醇和 70% 乙醇处理切片，每种浓度各 3 分钟。
  4. 在摇床上用去离子水依次处理切片 5 分钟和 2 分钟。
  5. 在湿盒中用 4 mg/mL 苏木精溶液染色 5 分钟，然后用流水冲洗切片 10 分钟。
  6. 在摇床上先用去离子水振荡处理切片 2 分钟，再用 0.5%-1% 伊红处理 1 分钟。
  7. 在摇床上依次用 70% 乙醇、80% 乙醇和 90% 乙醇振荡处理切片，每种浓度各 3 分钟；然后在摇床上用无水乙醇处理 5 分钟。
  8. 用 100% 二甲苯浸泡切片 15 分钟，并重复一次浸泡步骤。
  9. 用移液管或滴管向载玻片滴加 3–4 滴中性树胶，缓慢加盖盖玻片，在室温下空气干燥。

8. 免疫组织化学（IHC）染色

  1. 将石蜡切片在 60 °C 下熔化 30 分钟，浸入 100% 二甲苯中 10 分钟，并重复此步骤两次。
  2. 将切片置于摇床上，依次用无水乙醇、90% 乙醇和 80% 乙醇各振荡 2 分钟，然后用去离子水振荡 3 分钟。重复去离子水振荡步骤两次。
  3. 将切片置于摇床上，先用 20 mL 30% H2O2 与 180 mL 甲醇的混合液振荡 10 分钟，再用去离子水振荡 5 分钟。重复此步骤三次。
  4. 将切片转移至预热的柠檬酸缓冲液（1 L 去离子水中含 3 g Na3C6H5O7·2H2O 和 0.4 g C6H8O7，pH 6.0）中，微波加热 10 分钟以维持亚临界沸腾状态，室温冷却 30 分钟。将切片置于摇床上用去离子水振荡 5 分钟。重复此步骤三次。
  5. 将切片置于摇床上用 10 mM PBS 振荡 5 分钟，重复此步骤三次。用疏水性标记笔在湿盒中标记组织区域，滴加一滴即用型非免疫性山羊血清覆盖样本，室温孵育 1 小时。
  6. 去除血清，加入一抗（见材料表），4 °C 过夜孵育。去除一抗，将切片置于摇床上用 10 mM PBS 振荡 5 分钟，重复此 PBS 振荡步骤三次。
  7. 加入二抗（见材料表）覆盖样本，在湿盒中室温孵育 30 分钟。将切片置于摇床上用 10 mM PBS 振荡 5 分钟，重复振荡步骤三次。
  8. 在湿盒中加入新鲜配制的 0.03–0.05% 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液覆盖样本，染色 30–90 秒。用流水冲洗切片 10 分钟。
    注意：在光学显微镜下观察，控制染色时间，直至出现黄色为止。
  9. 加入 4 mg/mL 苏木精溶液覆盖样本，在湿盒中染色 5 分钟，然后用流水冲洗切片 10 分钟。
  10. 将切片置于摇床上，依次用 80% 乙醇、90% 乙醇和无水乙醇各振荡 2 分钟，随后将切片浸入 100% 二甲苯中 30 分钟。
  11. 用移液器或滴管向载玻片上滴加 3–4 滴中性树胶，缓慢加盖盖玻片。室温下空气干燥载玻片。

9. 类器官/球状体的全免疫荧光染色

注意：将用4% PFA溶液固定的类器官/球体收集到1.5 mL微量离心管中（参见步骤5.1至5.4）。按如下步骤进行荧光标记。

  1. 向离心管中加入1 mL 30%蔗糖溶液，对类器官/球体进行脱水处理，并于4 °C冰箱中孵育过夜。
  2. 向离心管中加入100 µL PBST溶液（含0.1% Triton X-100的10 mM PBS溶液），清洗类器官/球体5分钟，然后以100 × g离心1分钟，收集沉淀。重复此步骤三次。
  3. 向离心管中加入0.5–1 mL即用型非免疫性山羊血清，在室温下封闭1小时。以100 × g离心1分钟，收集沉淀。
  4. 加入数滴稀释的一抗溶液，恰好覆盖沉淀，于4 °C冰箱中孵育48小时。孵育结束后以100 × g离心1分钟，收集沉淀。
  5. 重复步骤9.2。
  6. 加入数滴荧光标记的二抗及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，恰好覆盖沉淀，于4 °C冰箱中避光孵育24小时。
  7. 重复步骤9.2，过程中避光操作。
  8. 向离心管中加入100 µL PBST溶液，暂时存放于4 °C冰箱中并避光。使用光片扫描显微镜观察并拍摄类器官/球体图像。

10. LGSC pLX-mCherry 转染

注意：慢病毒颗粒的制备必须在生物安全柜和生物安全二级（BSL2）级别的洁净台中进行。

  1. 将慢病毒包装细胞293T在含DMEM + 10% FBS的培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养3-5天，使其细胞融合度达到80%。
  2. 将慢病毒载体pLX-mCherry转染至LGSCs中。
    注意：以下试剂配制适用于6孔板中的1个孔。
    1. 准备两个无菌的1.5 mL离心管，每管加入250 µL DMEM/F12培养基。
    2. 向其中一管加入7.5 µL转染试剂，并用移液器充分混匀。
    3. 向另一管中加入2 µg无内毒素的pLX-mCherry质粒以及匹配的慢病毒包装质粒，并按每微克质粒加入2 µL转染试剂（即共4 µL）。
    4. 将两根离心管中的液体分别混匀后，室温静置5分钟。
    5. 吸除293T细胞的培养液，将步骤10.2.4中的混合液加入293T细胞中。8小时后更换为新鲜的DMEM + 10% FBS培养基。
    6. 48小时后，首次收集病毒上清液，并通过0.45 µm滤器过滤；72小时后，第二次收集病毒上清液，并再次通过0.45 µm滤器过滤。
      注意：两次过滤后的上清液均需置于冰上保存，直至进行慢病毒转导。
  3. 获取来自DED小鼠（NOD/ShiLtJ）的LGSCs（参见步骤1）。
  4. 加入1 mL预先收集的pLX-mCherry慢病毒上清液重悬细胞。
  5. 将离心管置于CO2培养箱内的摇床上，37 °C、100 rpm条件下振荡，以最大化慢病毒与细胞的接触。8小时后，于250 × g离心4分钟，弃去上清液。
  6. 加入1 mL DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀。使用细胞计数仪测定细胞数量，并将总计1 × 104个细胞接种至24孔板每孔中含100 µL基质胶-LGSCM基质（基质胶 : LGSCM = 1:1）的体系中，该24孔板预先在每孔中包被20 µL基质胶-LGSCM基质（参见步骤1.3.2）。
  7. 培养7天后（参见步骤1），在荧光显微镜下挑选发出红色荧光的类球体进行扩增培养。

11. LGSC 原位移植

注意：所有外科手术均在SPF级手术室中进行，所有外科器械均已灭菌。

  1. 从培养7天的ROSA26mT/mG小鼠中获取具有红色荧光（td-Tomato）或转染mCherry的LGSC类球体（见步骤1）。
  2. 使用前将含有基质胶与DMEM/F12以1:1比例混合的1.5 mL微量离心管置于冰上冷却。将LGSC类球体消化为单细胞，并以2 × 106 个细胞/mL的密度重悬于该管中。
  3. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对NOD/ShiLtJ小鼠进行麻醉。
    注：NOD/ShiLtJ小鼠是一种理想的模型，具有特发性ADDED症状，包括泪液分泌减少、炎性细胞浸润和眶部溃疡。
  4. 麻醉后，使用生理盐水或兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥，然后使用眼科剪在麻醉小鼠耳后（靠近眼睛处）皮肤上做5-8 mm切口，暴露泪腺（LGs）。
    注：切口周围应严格使用碘伏进行消毒。
  5. 将2 × 104个细胞注射至左侧LG，右侧LG则注射不含细胞的混合液（见步骤11.2）作为对照。
  6. 注射后，使用眼科镊将LG复位并缝合伤口。饲养小鼠2个月，观察治疗效果。
    注：术后笼具垫料必须严格灭菌，且垫料应每日更换一次。缝合伤口后，可选择性地以2.5 mg/kg的标准剂量经尾静脉注射曲马多，以实现镇痛。
  7. 实验2个月后对小鼠进行麻醉（见步骤11.3），拍摄眼部区域症状影像。
    1. 麻醉过程中观察以下体征：颈部和四肢肌肉松弛；呼吸深、慢而平稳；瞳孔缩小；角膜反射消失。
    2. 在麻醉和手术过程中，保持小鼠体温在37 °C。术后应在饮水中添加适当抗生素，以降低伤口感染风险。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前不得无人看管。手术后的小鼠在完全恢复前不得与其他小鼠合笼饲养。
    3. 拍摄眼部症状影像后，打开ImageJ软件，点击文件 | 打开 | 手绘选区，按住鼠标左键，在图像中选择眶部溃疡区域。点击分析 | 测量，获得溃疡相对面积。
  8. 将酚红棉线置于麻醉小鼠外眦处10秒；测量并记录棉线变色部分的长度。在完成泪液测量后，通过颈椎脱位法处死小鼠。
  9. 解剖小鼠并取出LG用于免疫组化（IHC）分析。

12. RNA 提取

注意：实验前，将离心机预冷至 4 °C，并确保所有试剂和耗材均无 RNase 污染。

  1. 在微量离心管中收集LGSCs或LG组织碎片。加入1 mL细胞裂解液，通过涡旋振荡充分裂解细胞或组织。
  2. 加入0.2 mL氯仿，涡旋振荡1分钟后，室温静置10分钟。在4 °C、12,000 ×g条件下离心15分钟。
    注意：离心后液体分为三层，RNA位于最上层透明的水相中。
  3. 小心吸取最上层透明水相，转移至新的1.5 mL无RNase的离心管中。
  4. 加入等体积异丙醇，轻轻混匀。室温静置10分钟后，在4 °C、12,000 ×g条件下离心15分钟。
  5. 弃去上清液，加入1 mL 75%乙醇。倒置离心管以洗涤沉淀物，在4 °C、7,500 ×g条件下离心5分钟。重复此步骤一次。
  6. 小心弃去上清液，将离心管置于超净工作台中干燥约20分钟。
    注意：当白色沉淀变为半透明时，进行下一步操作。所有操作均需在冰上进行。
  7. 加入20 µL无RNase的水，充分溶解沉淀。使用分光光度计（见材料表）测定RNA浓度，并将RNA溶液于-80 °C保存。

13. 聚合酶链式反应（PCR）

  1. 反转录反应
    1. 取1 µg总RNA（根据RNA溶液浓度计算所需体积）加入PCR反应管中，65 °C孵育5分钟进行变性。
    2. 冰上放置1分钟，然后加入无酶水至总体积达到12 µL。加入4 µL的4x DNA Master Mix，37 °C孵育5分钟。
    3. 将反应管置于冰上，加入4 µL的5x RT Master Mix，轻轻混匀。设置以下PCR程序：37 °C反应15分钟，50 °C反应5分钟，98 °C反应5分钟，4 °C保持1分钟。
    4. 反转录反应完成后，可将产物储存于-20 °C，或直接进行下一步操作。
  2. PCR反应
    1. 在PCR管中按如下体系配制PCR反应液：14.1 µL无酶水、2 µL dNTP、2 µL 10x Buffer、0.8 µL引物（10 µM，含0.4 µL上游引物和0.4 µL下游引物，参见材料表）、1 µL反转录获得的cDNA（参见步骤13.1）以及0.1 µL Taq酶。
    2. 将配制好的PCR反应液放入PCR仪中进行扩增。PCR程序请参照Taq酶试剂盒说明书（见材料表）。
  3. 琼脂糖凝胶电泳
    1. 使用分析天平称取242 g Tris和37.2 g Na2EDTA·2H2O，加入1 L烧杯中。加入约800 mL去离子水和57.1 mL冰乙酸，充分混匀后加去离子水定容至1 L，得到50x TAE缓冲液，室温保存。
      注意：使用前需用去离子水将50x TAE缓冲液稀释。
    2. 使用分析天平称取1.2 g琼脂糖，加入含有80 mL 1x TAE缓冲液的锥形瓶中，放入微波炉中反复加热至完全溶解。
    3. 将锥形瓶置于流动自来水下冷却，直至溶液温度降至60 °C。加入8 µL核酸染料，充分混匀后倒入制胶模具中，插入梳子，室温静置30分钟使其凝固。
    4. 拔出梳子，将PCR产物上样至已制备好的琼脂糖凝胶中，在120 V电压下电泳30分钟。
    5. 将凝胶放入ECL凝胶成像系统中拍照记录结果。

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结果

建立三维无血清培养体系
本研究开发了含有EGF、Wnt3A、FGF10和Y-27632的培养基用于小鼠泪腺干细胞（LGSCs）的培养，并通过三维培养方法成功分离和培养了LGSCs（图1A）。利用该方法，已成功建立了来自C57BL/6小鼠、NOD/ShiLtJ小鼠、BALB/c小鼠以及ROSA26mT/mG小鼠的LGSCs的三维无血清培养体系16。对于雄性小鼠，通过解离两只泪腺可获得1.5–2 × 106个细胞。在培养开始时接种1 × 104个泪腺细胞，经过一周培养后可形成30–60个类球体。此外，采用该方法培养的细胞表达Epcam、Krt5、Krt14、P63、nestin及其他干细胞标志物16，表明所获得的细胞具有LGSCs的特性。培养7天后形成的全部类球体均表达Krt14和Ki67（图1B），表明LGSCs具有自我...

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讨论

已有成熟的方法用于分离和纯化 体外 用于泪腺干细胞培养及泪腺损伤修复的泪腺干细胞培养。Shatos 等17 和 Ackermann等6 成功通过二维培养方法分别对大鼠和小鼠的泪腺干细胞进行了培养与传代，使得利用泪腺干细胞移植治疗干燥性角结膜炎（ADDED）成为可能。干细胞相关研究18 和间充质干细胞19,20 二维培养的LG细胞显示，移植这些细胞可在一定程度上缓解ADDED症状。通过荧光激活细胞分选，Gromova等2 从表达LG前体细胞标志物的小鼠LG中筛选出干细胞，并将其分化为导管和腺泡 体外成功实现了成体干细胞向功能性睑板腺细胞的分化。研究还表明，在小鼠模型中移植足量的干细胞可缓解干燥性角结膜炎（ADDED）症状。

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：31871413）以及广东省科学技术计划项目（2017B020230002 和 2016B030231001）的资助。我们衷心感谢在研究过程中给予我们帮助的研究人员，以及动物中心工作人员在动物饲养方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物（小鼠）
Balb/c南京大学模式动物研究中心
C57 BL/6J中山大学实验动物中心
NOD/ShiLtJ南京大学模式动物研究中心
ROSA26mT/mG南京大学模式动物研究中心
仪器设备
分析天平赛多利斯
自动脱水机赛默飞世尔科技
血细胞计数板BLAU
细胞计数仪CountStar
CO2 恒温培养箱赛默飞世尔科技
ECL 凝胶成像系统GE 医疗
水浴电热器Yiheng Technology
电泳装置BioRad
荧光定量PCR仪罗氏
冷冻组织切片机Lecia
水平离心机CENCE
倒置荧光显微镜尼康
倒置显微镜Olympus
激光层扫显微图像卡尔·蔡司
液氮容器赛默飞世尔科技（Thermo）
低温高速离心机Eppendorf
微量移液器Gilson
微波炉松下
Nanodrop 紫外分光光度计赛默飞世尔科技测定RNA浓度
石蜡切片机赛默飞世尔科技
PCR扩增仪Eppendorf
pH值测试仪赛多利斯
4 °C 冰箱Haier
恒温培养振荡器ZHICHENG
组织石蜡包埋仪赛默飞世尔科技
 -80°C 超低温冰箱赛默飞世尔科技
 -20°C 超低温冰箱赛默飞世尔科技
超纯水净化系统ELGA
试剂
动物实验
HCGSigma9002-61-3
PMSGSigma14158-65-7
戊巴比妥钠Sigma57-33-0
细胞培养
B27Gibco17504044
胶原酶 IGibco17018029
DispaseBD354235
DMEMSigmaD6429
DMEM/F12SigmaD0697
DMSOSigma67-68-5
EDTASangon BiotechA500895
胎牛血清Gibco04-001-1ACS
GlutaMaxGibco35050087
人成纤维细胞生长因子10PeproTech100-26
Matrigel（基质胶）BD356231
小鼠NogginPeproTech250-38
小鼠 Wnt3APeproTech315-20
小鼠 EGFPeproTech315-09
非必需氨基酸Gibco11140050
N2Gibco17502048
R-spondin 1PeproTech120-38
胰蛋白酶抑制剂（TI）SigmaT6522源自 大豆；对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和纤溶酶的抑制作用较弱。1 mg 可抑制 1.0–3.0 mg 胰蛋白酶。
胰蛋白酶Sigma T4799
Y-27632SelleckS1049
HE染色 & 免疫染色
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG赛默飞世尔科技A-21202使用稀释度：IHC 2 μg/mL,（免疫荧光） 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG赛默飞世尔科技A-21206使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG赛默飞世尔科技A-10037使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 驴抗兔IgG赛默飞世尔科技A-10042使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 4 μg/mL
抗AQP5兔抗体Abcamab104751使用稀释度：（IHC） 1 μg/mL,（免疫荧光） 0.1 μg/mL
抗E-钙黏蛋白大鼠抗体Abcamab11512使用稀释度：（免疫荧光）  5 μg/mL
兔抗角蛋白14抗体Abcamab181595使用稀释度：（IHC） 1 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL
兔抗 Ki67 抗体Abcamab15580使用稀释度：（IHC） 1 μg/mL,（免疫荧光） 1 μg/mL
抗mCherry小鼠抗体Abcamab125096使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL
抗mCherry兔抗体Abcamab167453使用稀释度：（免疫荧光）  2 μg/mL
C6H8O7Sangon BiotechA501702-0500
柠檬酸Sangon Biotech201-069-1
DAB试剂盒（20倍浓缩）CWBIOCW0125
DAPI赛默飞世尔科技62248
伊红BASO68115
荧光封片剂DakoS3023
甲醛溶液Sangon BiotechA501912-0500
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体Abcamab6789使用稀释度： 2 μg/mL
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体Abcamab6721使用稀释度： 2 μg/mL
苏木精BASO517-28-2
Histogel（包埋用凝胶）赛默飞世尔科技HG-400-012
30% H2O2广州化学KD10
30% 过氧化氢溶液广州化学7722-84-1
甲醇广州化学67-56-1
Na3C6H5O7.2H2OSangon BiotechA501293-0500
中性树胶上海易阳YY-中性树胶
非免疫山羊血清BOSTERAR0009
石蜡Sangon BiotechA601891-0500
多聚甲醛DAMAO200-001-8
蔗糖广州化学57-50-1
柠檬酸钠三水合物Sangon Biotech200-675-3
蔗糖广州化学IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. 包埋剂SAKURASAKURA.4583
Triton X-100丁国9002-93-1
二甲苯广州化学128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
琼脂糖Sigma9012-36-6
酒精广州化学64-17-5
氯仿广州化学865-49-6
溴化乙锭Sangon Biotech214-984-6
异丙醇广州化学67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix罗氏488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO-
Taq DNA聚合酶TAKARAR10T1
Goldview（核酸染料）BioSharpBS357A
TRIzolMagenR4801-02
载体构建 & 细胞转染
琼脂氧化-
氨苄青霉素Sigma69-52-3
氯霉素Sigma56-75-7
无内毒素质粒提取试剂盒赛默飞世尔科技A36227
卡那霉素Sigma25389-94-0
Lipo3000 质粒转染试剂盒赛默飞世尔科技L3000015
LR反应试剂盒赛默飞世尔科技11791019
质粒提取试剂盒TIANGENDP103
Trans5α 化学感受态细胞转基因CD201-01
胰蛋白胨氧化-
酵母提取物氧化-
引物与序列公司
引物AQP5
序列:
F：CATGAACCCAGCCCGATCTT
R：CTTCTGCTCCCATCCCATCC		合成生物技术
引物: β-肌动蛋白
序列:
F：AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R：AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		合成生物技术
引物Epcam
序列:
F：CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R：TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		合成生物技术
引物Krt5
序列:
F：AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R：GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		合成生物技术
引物Krt14
序列:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R：GCCACCTCCTCGTGGTTC		合成生物技术
引物Krt19
序列:
F：TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R：TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		合成生物技术
引物Ltf
序列:
F：CACATGCTGTCGTATCCCGA
R：CGATGCCCTGATGGACGA		合成生物技术
引物Nestin
序列:
F：GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R：GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		合成生物技术
引物P63
序列:
F：TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R：GTACCATCGCCGTTCTTTGC		合成生物技术
载体
pLX302 慢病毒空载载体Addgene
pENRTY-mCherry中山大学秦晓峰实验室

参考文献

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
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