成年泪腺（LG）干细胞的三维无血清培养方法已较为成熟，可用于诱导LG类器官形成，并分化为腺泡样或导管样细胞。
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本文内容
摘要
摘要
基于泪腺干细胞的治疗是泪腺疾病的一种有前景的策略。然而，目前缺乏一种可靠且无血清的培养方法来获得足够数量的泪腺干细胞（LGSCs），这成为进一步研究和应用的障碍。本文展示了已建立完善的成年小鼠泪腺干细胞三维（3D）、无血清培养方法。该方法中的泪腺干细胞可实现连续传代，并可被诱导分化为腺泡样或导管样细胞。
对于泪腺干细胞（LGSC）原代培养，取6至8周龄小鼠的泪腺（LGs），用中性蛋白酶（dispase）、I型胶原酶（collagenase I）和胰蛋白酶-EDTA进行消化。将总计1 × 104个单细胞接种至24孔板的每孔中，每孔含有80 µL基质凝胶-泪腺干细胞培养基（LGSCM）混合物，该孔预先包被有20 µL基质凝胶-LGSCM混合物。在37 °C孵育20分钟后，混合物凝固，随后加入600 µL LGSCM培养基。
对于LGSC的维持培养，将已培养7天的LGSCs用dispase和胰蛋白酶-EDTA消化为单细胞。单细胞按照LGSC原代培养的方法进行接种和培养。LGSC可连续传代超过40次，并持续表达干细胞/祖细胞标志物Krt14、Krt5、P63和nestin。在LGSCM培养基中培养的LGSC具有自我更新能力，可分化为腺泡样或导管样细胞 体外 和 体内.
引言
泪腺干细胞（LGSCs）维持泪腺（LG）细胞的更新，并是腺泡细胞和导管细胞的来源。因此，LGSC移植被视为治疗严重炎症性损伤和水液缺乏型干眼症（ADDED）的一种替代方法1,2,3已采用多种培养方法来富集低级别浆液性癌细胞（LGSCs）。Tiwari 等人. 采用胶原蛋白I和基质凝胶并补充多种生长因子分离并培养原代泪腺细胞；然而，泪腺细胞无法实现连续传代培养4采用二维（2D）培养方法，You 等人分离获得了小鼠泪腺来源的干细胞。5 以及 Ackermann 等人.6，发现表达干细胞/祖细胞标志基因， Oct4, Sox2, Nanog，以及 nestin，且可进行传代培养。然而，目前尚无明确证据表明这些细胞能够分化为腺泡细胞或导管细胞，也缺乏移植实验以验证其分化潜能 体内.
最近，c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/....
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方案
本方案中的所有实验均遵循中山大学动物实验伦理委员会的动物护理指南。所有与细胞相关的操作均须在细胞操作室的超净工作台中进行。所有使用二甲苯的操作均须在通风橱中进行。
1. 低级别浆液性癌原代培养
- 泪腺（LG）分离
- 取一只6-8周龄的雄性BALB/c小鼠，剪开耳后皮肤以暴露泪腺及其周围的结缔组织。使用镊子进行钝性剥离，去除结缔组织，并取出泪腺。
- 在6 cm培养皿中用4 mL无菌的10 mM PBS溶液冲洗泪腺两次，以去除血液。将泪腺浸入含4 mL 75%乙醇的6 cm培养皿中处理10秒，随后立即用10 mM PBS冲洗两次。
- 获取泪腺单细胞
- 使用HEPES缓冲液（50 mM HEPES/KOH，pH 7.4；150 mM NaCl溶于超纯水）配制25 U/mL分散酶。用超纯水配制0.1% I型胶原酶溶液。
- 将泪腺切成小块（约1 mm3），转移至无菌15 mL离心管中，加入500 µL 25 U/mL分散酶和500 µL 0.1% I型胶原酶，在37 °C孵育1小时。
- 用10 mM PBS配制胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05 g/L胰蛋白酶，0.04 g/L EDTA）。将步骤1.2.2中的泪腺组织碎片用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在....
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结果
建立三维无血清培养体系
本研究开发了含有EGF、Wnt3A、FGF10和Y-27632的培养基用于小鼠泪腺干细胞（LGSCs）的培养，并通过三维培养方法成功分离和培养了LGSCs（图1A）。利用该方法，已成功建立了来自C57BL/6小鼠、NOD/ShiLtJ小鼠、BALB/c小鼠以及ROSA26mT/mG小鼠的LGSCs的三维无血清培养体系16。对于雄性小鼠，通过解离两只泪腺可获得1.5–2 × 106个细胞。在培养开始时接种1 × 104个泪腺细胞，经过一周培养后可形成30–60个类球体。此外，采用该方法培养的细胞表达Epcam、Krt5、Krt14、P63、nestin及其他干细胞标志物16，表明所获得的细胞具有LGSCs的特性。培养7天后形成的全部类球体均表达Krt14和Ki67（图1B），表明LGSCs具有自我.......
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讨论
已有成熟的方法用于分离和纯化 体外 用于泪腺干细胞培养及泪腺损伤修复的泪腺干细胞培养。Shatos 等17 和 Ackermann等6 成功通过二维培养方法分别对大鼠和小鼠的泪腺干细胞进行了培养与传代，使得利用泪腺干细胞移植治疗干燥性角结膜炎（ADDED）成为可能。干细胞相关研究18 和间充质干细胞19,20 二维培养的LG细胞显示，移植这些细胞可在一定程度上缓解ADDED症状。通过荧光激活细胞分选，Gromova等2 从表达LG前体细胞标志物的小鼠LG中筛选出干细胞，并将其分化为导管和腺泡 体外成功实现了成体干细胞向功能性睑板腺细胞的分化。研究还表明，在小鼠模型中移植足量的干细胞可缓解干燥性角结膜炎（ADDED）症状。
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：31871413）以及广东省科学技术计划项目（2017B020230002 和 2016B030231001）的资助。我们衷心感谢在研究过程中给予我们帮助的研究人员，以及动物中心工作人员在动物饲养方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物（小鼠） | |||
| Balb/c | 南京大学模式动物研究中心 | ||
| C57 BL/6J | 中山大学实验动物中心 | ||
| NOD/ShiLtJ | 南京大学模式动物研究中心 | ||
| ROSA26mT/mG | 南京大学模式动物研究中心 | ||
| 仪器设备 | |||
| 分析天平 | 赛多利斯 | ||
| 自动脱水机 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 血细胞计数板 | BLAU | ||
| 细胞计数仪 | CountStar | ||
| CO2 恒温培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| ECL 凝胶成像系统 | GE 医疗 | ||
| 水浴电热器 | Yiheng Technology | ||
| 电泳装置 | BioRad | ||
| 荧光定量PCR仪 | 罗氏 | ||
| 冷冻组织切片机 | Lecia | ||
| 水平离心机 | CENCE | ||
| 倒置荧光显微镜 | 尼康 | ||
| 倒置显微镜 | Olympus | ||
| 激光层扫显微图像 | 卡尔·蔡司 | ||
| 液氮容器 | 赛默飞世尔科技（Thermo） | ||
| 低温高速离心机 | Eppendorf | ||
| 微量移液器 | Gilson | ||
| 微波炉 | 松下 | ||
| Nanodrop 紫外分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 测定RNA浓度 | |
| 石蜡切片机 | 赛默飞世尔科技 | ||
| PCR扩增仪 | Eppendorf | ||
| pH值测试仪 | 赛多利斯 | ||
| 4 °C 冰箱 | Haier | ||
| 恒温培养振荡器 | ZHICHENG | ||
| 组织石蜡包埋仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| -80°C 超低温冰箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| -20°C 超低温冰箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 超纯水净化系统 | ELGA | ||
| 试剂 | |||
| 动物实验 | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma | 57-33-0 | |
| 细胞培养 | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| 胶原酶 I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| 人成纤维细胞生长因子10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel（基质胶） | BD | 356231 | |
| 小鼠Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 小鼠 Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| 小鼠 EGF | PeproTech | 315-09 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| 胰蛋白酶抑制剂（TI） | Sigma | T6522 | 源自 大豆；对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和纤溶酶的抑制作用较弱。1 mg 可抑制 1.0–3.0 mg 胰蛋白酶。 |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE染色 & 免疫染色 | |||
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG | 赛默飞世尔科技 | A-21202 | 使用稀释度：IHC 2 μg/mL,（免疫荧光） 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG | 赛默飞世尔科技 | A-21206 | 使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG | 赛默飞世尔科技 | A-10037 | 使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 驴抗兔IgG | 赛默飞世尔科技 | A-10042 | 使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 4 μg/mL |
| 抗AQP5兔抗体 | Abcam | ab104751 | 使用稀释度：（IHC） 1 μg/mL,（免疫荧光） 0.1 μg/mL |
| 抗E-钙黏蛋白大鼠抗体 | Abcam | ab11512 | 使用稀释度：（免疫荧光） 5 μg/mL |
| 兔抗角蛋白14抗体 | Abcam | ab181595 | 使用稀释度：（IHC） 1 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL |
| 兔抗 Ki67 抗体 | Abcam | ab15580 | 使用稀释度：（IHC） 1 μg/mL,（免疫荧光） 1 μg/mL |
| 抗mCherry小鼠抗体 | Abcam | ab125096 | 使用稀释度：（IHC） 2 μg/mL,（免疫荧光） 2 μg/mL |
| 抗mCherry兔抗体 | Abcam | ab167453 | 使用稀释度：（免疫荧光） 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| 柠檬酸 | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB试剂盒（20倍浓缩） | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | 62248 | |
| 伊红 | BASO | 68115 | |
| 荧光封片剂 | Dako | S3023 | |
| 甲醛溶液 | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Abcam | ab6789 | 使用稀释度： 2 μg/mL |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体 | Abcam | ab6721 | 使用稀释度： 2 μg/mL |
| 苏木精 | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel（包埋用凝胶） | 赛默飞世尔科技 | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | 广州化学 | KD10 | |
| 30% 过氧化氢溶液 | 广州化学 | 7722-84-1 | |
| 甲醇 | 广州化学 | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| 中性树胶 | 上海易阳 | YY-中性树胶 | |
| 非免疫山羊血清 | BOSTER | AR0009 | |
| 石蜡 | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| 多聚甲醛 | DAMAO | 200-001-8 | |
| 蔗糖 | 广州化学 | 57-50-1 | |
| 柠檬酸钠三水合物 | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| 蔗糖 | 广州化学 | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. 包埋剂 | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | 丁国 | 9002-93-1 | |
| 二甲苯 | 广州化学 | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| 琼脂糖 | Sigma | 9012-36-6 | |
| 酒精 | 广州化学 | 64-17-5 | |
| 氯仿 | 广州化学 | 865-49-6 | |
| 溴化乙锭 | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| 异丙醇 | 广州化学 | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | 罗氏 | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | - | |
| Taq DNA聚合酶 | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview（核酸染料） | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| 载体构建 & 细胞转染 | |||
| 琼脂 | 氧化 | - | |
| 氨苄青霉素 | Sigma | 69-52-3 | |
| 氯霉素 | Sigma | 56-75-7 | |
| 无内毒素质粒提取试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A36227 | |
| 卡那霉素 | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 质粒转染试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | L3000015 | |
| LR反应试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 11791019 | |
| 质粒提取试剂盒 | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α 化学感受态细胞 | 转基因 | CD201-01 | |
| 胰蛋白胨 | 氧化 | - | |
| 酵母提取物 | 氧化 | - | |
| 引物与序列 | 公司 | ||
| 引物AQP5 序列: F：CATGAACCCAGCCCGATCTT R：CTTCTGCTCCCATCCCATCC | 合成生物技术 | ||
| 引物: β-肌动蛋白 序列: F：AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R：AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT | 合成生物技术 | ||
| 引物Epcam 序列: F：CATTTGCTCCAAACTGGCGT R：TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | 合成生物技术 | ||
| 引物Krt5 序列: F：AGCAATGGCGTTCTGGAGG R：GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | 合成生物技术 | ||
| 引物Krt14 序列: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R：GCCACCTCCTCGTGGTTC | 合成生物技术 | ||
| 引物Krt19 序列: F：TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R：TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | 合成生物技术 | ||
| 引物Ltf 序列: F：CACATGCTGTCGTATCCCGA R：CGATGCCCTGATGGACGA | 合成生物技术 | ||
| 引物Nestin 序列: F：GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R：GACCTCTAGGGTTCCCGTCT | 合成生物技术 | ||
| 引物P63 序列: F：TCCTATCACGGGAAGGCAGA R：GTACCATCGCCGTTCTTTGC | 合成生物技术 | ||
| 载体 | |||
| pLX302 慢病毒空载载体 | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | 中山大学秦晓峰实验室 |
参考文献
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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