从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白

泛素是一种进化保守的蛋白质，由76个氨基酸¹，^2，3组成。泛素通过涉及活化 （E1）、偶联 （E2） 和连接酶 （E3） 的级联共价结合靶蛋白上的赖氨酸残基。泛素首先被E1酶激活，然后转移到E2结合酶中。随后，E3泛素连接酶与泛素负载的E2酶和底物蛋白相互作用，并介导泛素的C端与底物¹，²，^3，4，5中的赖氨酸残基之间形成同肽键。泛素化涉及泛素部分附着在底物蛋白上的赖氨酸残基或自身上，导致蛋白质单泛素化或多泛素化。这种泛素化过程发生在真核生物的细胞内，并调节着各种各样的生物过程。泛素化导致底物蛋白通过泛素-蛋白酶体系统¹，²，³，^4，5降解。此外，泛素化调节细胞中的蛋白质亚细胞定位、蛋白质复合物形成和蛋白质运输^3，5。连接到底物蛋白的泛素部分可以通过去泛素化酶（DUB^）去除6^，7。值得注意的是，泛素链组装的不同方式提供了无数的方法来调节各种生物过程^1，5。泛素化在调节底物蛋白功能中的确切作用至今仍不完全清楚。泛素化蛋白质的纯化有助于阐明蛋白质泛素化对各种细胞过程的影响。

p53蛋白是最重要的肿瘤抑制蛋白之一，在几乎所有人类癌症中都表现出基因突变或失活⁸，⁹，^10，11。p53 的稳定性和活性在体内通过翻译后修饰（包括泛素化、磷酸化、乙酰化和甲基化）得到微妙的调节^12，13。p53蛋白在各种细胞中的半衰期很短，从6分钟到40分钟不等，这主要是由于其多泛素化和随后的蛋白酶体降解^10，12。小鼠双分钟2（Mdm2）是p53的E3泛素连接酶，与p53的N末端结合以抑制其转录活性¹²，^14，15。Mdm2促进p53的多泛素化和蛋白酶体降解以控制其稳定性，并诱导p53的单泛素化以促进其核输出¹²，¹⁴，^15，16。本文以Mdm2介导的p53泛素化为例，详细介绍了从哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白的方法。当它们在哺乳动物细胞中过表达或敲低/敲除时，可以使用这种体内泛素化测定法鉴定影响靶蛋白泛素化状态的调节因子。此外，泛素化蛋白可用作体外去泛素化测定的底物。通过将泛素化底物与单个 DUB 孵育，可以进行高通量筛选以鉴定靶蛋白的特定 DUB。泛素化蛋白可以作为支架在细胞中募集下游信号蛋白。泛素化的目标蛋白复合物可以在天然纯化条件下通过顺序免疫沉淀纯化，并通过质谱鉴定。目前的协议可以广泛用于研究泛素化调节的细胞蛋白。

已经建立了几种纯化泛素蛋白的方法，包括使用亲和标记的泛素、泛素抗体、泛素结合蛋白和分离的泛素结合结构域（UBD）¹⁷。在这里，我们提供了一种使用亲和标记的泛素作为介质来纯化哺乳动物细胞中泛素化蛋白质的方案。与其他方法相比，使用多His标记的泛素具有优势。泛素蛋白在强变性剂存在下纯化，通过线性化细胞蛋白和破坏蛋白质-蛋白质相互作用来减少与带镍树脂的非特异性结合。相比之下，使用泛素抗体、泛素结合蛋白和分离的UBD作为介质不能有效地从靶蛋白中排除结合伴侣，因为纯化需要在不太严格的条件下进行。此外，纯化还可能导致使用这些介质增加不相关蛋白质的结合。此外，存在各种泛素连接类型的结合倾向，以及泛素结合蛋白或分离的UBD的单泛素和多泛素化¹⁷。使用多His标记的泛素有助于降低所有细胞泛素化的蛋白质。或者，使用市售的抗Flag或抗HA抗体偶联琼脂糖使得在非变性条件下更容易免疫沉淀大规模Flag或HA标记的靶蛋白。第二个纯化步骤，例如，通过靶向聚His标记的泛素的带镍树脂，可用于获取具有高纯度的泛素化靶蛋白，用于下游实验。值得注意的是，当无法获得特异性抗体以有效免疫沉淀靶蛋白时，可以调整表位标记纯化策略。最后，与 体外纯化相比，哺乳动物细胞中泛素化蛋白的纯化保留了靶蛋白在更多生理条件下的泛素连接模式。

注意:H1299细胞由中国科学院干细胞库提供，并被证明对支原体污染呈阴性。

1. 细胞培养

1. 对于初始培养，将 1 x 10⁶ 个人肺腺癌细胞系 H1299 细胞置于 10 cm 培养皿中，其中 10-12 mL RPMI 1640 培养基补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 谷氨酰胺添加剂、1% 丙酮酸钠和抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）。将细胞保持在37°C的加湿培养箱中，含有5%CO₂。每2-3天分裂一次细胞，具体取决于它们何时达到80%-90%汇合度。
2. 转染前一天，为三个培养皿准备6-9 x 10 6个细胞，并将2-3 x 10⁶个细胞接种在含有10-12 mL培养基的单个10 cm培养皿中，以在转染过程中达到70%-90%的汇合。
   注意:HEK293T细胞由于其高转染效率和蛋白表达水平，也可用于纯化泛素蛋白。

2. 质粒转染

1. 在三个 15 mL 离心管中加入 1.5 mL 还原血清培养基。
2. 将准备转染的质粒DNA添加到每个试管中，以按如下方式进行稀释。管1:1μgFlag-p53质粒，12μg空载体;试管 2:1 μg Flag-p53 质粒、3 μg His-HA-Ub （HH-Ub） 质粒和 9 μg 空载体;试管 3:1 μg Flag-p53 质粒、3 μg HH-Ub 质粒和 9 μg Mdm2 质粒。向每管中总共添加0.2 μg绿色荧光蛋白（GFP）质粒以监测转染效率。
   注意:应进行中试实验以确定在细胞中实现有效靶蛋白表达所需的最佳质粒量。
3. 将 78 μL 脂质体转染试剂加入另一个离心管中的 4.5 mL 还原血清培养基中以稀释脂质体。通过轻弹管充分混合，并在室温（RT）下静置5分钟。
4. 将 1.5 mL 稀释的脂质体溶液添加到步骤 2.2 的每个管中，其中包含 1.5 mL 稀释的 DNA 溶液。充分混合并在室温下将质粒与脂质体交联至少20分钟。 使用质粒DNA:每次转染的脂质体比例为1:2（μg:μL）。
5. 从培养皿中丢弃原始培养基，并在每个培养皿中加入 9 mL 还原血清培养基。向每个培养皿中加入 3 mL 脂质体-DNA 混合物，并通过轻轻来回摇动板 3 次来混合溶液，然后左右摇动 3 次以使混合物在板中均匀分布。
6. 在37°C的加湿培养箱中用5%CO₂培养细胞培养细胞。4-6小时后更换培养基，继续培养细胞24-36小时。

3. 细胞采集

1. 24-36小时后，用MG132以10μM的终浓度处理细胞4-6小时。
   注意:MG132是一种肽醛，可有效阻断26S蛋白酶体复合物的蛋白水解活性。用MG132或其他蛋白酶体抑制剂处理细胞后，用赖氨酸-48（K48）连接的多泛素链泛素蛋白的蛋白质量可以增加。
2. 丢弃培养基，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞2次（注意不要冲洗细胞），并用血清移液管吸出细胞。
3. 向培养皿中加入 1 mL PBS，用干净的刮刀刮除细胞，然后将细胞悬液转移到微量离心管中。以700× g 离心5分钟以收集细胞沉淀。

4. 非变性条件下泛素化蛋白的纯化

1. 使用前准备新鲜补充蛋白酶抑制剂混合物的 Flag 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl （pH 7.9）、137 mM NaCl、10 mM NaF、1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）、1% Triton X-100、0.2% sarkosyl 和 10% 甘油）。
2. 向每个管中的细胞中加入 800 μL 冰冷的 Flag 裂解缓冲液，使用涡旋振荡器或移液器枪混合细胞，然后将混合物在 4 °C 的旋转器上孵育 30 分钟。
3. 对混合物进行5-10次短暂的超声脉冲。在冰上以20 kHZ的超声频率和80%的振幅进行超声处理，每个脉冲持续1秒。将混合物在旋转器上以每分钟40转（rpm）在4°C孵育30分钟。
4. 在4°C下以8，000× g 离心超声样品20-30分钟。 将上清液转移到新的微量离心管中。
5. 将 80 μL （1/10） 细胞提取物分装，并与 20 μL 5x 十二烷基硫酸钠 （SDS） 上样缓冲液混合。将样品在98°C下煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并在-20°C下储存直至使用。使用这些样品作为监测蛋白表达的输入组。
6. 向剩余的细胞提取物中加入 30 μL 抗 Flag M2 抗体偶联 （Flag/M2） 珠，并在 4 °C 的旋转器上孵育至少 4 小时或过夜。
7. 在4°C下以1，500× g 离心2分钟以收集珠子。向磁珠中加入 1 mL 冰冷的 Flag 裂解缓冲液，并通过倒置试管数次进行混合。
8. 在4°C下以1，500× g 离心2分钟以收集珠子。重复步骤 4.7 4-6 次。
9. 向磁珠中加入终浓度为 200 ng/μL 的 40 μL Flag 肽，并在 4 °C 的旋转器上孵育 2 小时以洗脱结合的蛋白质。
10. 在4°C下以1，500× g 离心5分钟。 将上清液转移到新的微量离心管中。
11. 加入 10 μL 5x SDS 上样缓冲液，将混合物在 98 °C 下煮沸 5 分钟，在冰上冷却 2 分钟，并在 -20 °C 下储存以进行蛋白质印迹。或者，将步骤4.10的洗脱液直接储存在-80°C下用于其他下游实验。
    注意:纯化的泛素化蛋白质的量可以通过增加细胞数量和转染的质粒数量来扩大。表位标记策略可用于纯化在天然纯化条件下纯化与泛素化p53特异性结合的细胞复合物。通过共表达 Flag-p53、mdm2 和 HA-泛素，泛素化的 p53 蛋白复合物可以通过来自哺乳动物细胞的序贯 Flag 和 HA 抗体偶联琼脂糖免疫沉淀。为了保持泛素化p53蛋白的结合伴侣，在纯化过程中应使用不太严格的BC100裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.9），100 mM NaCl，10%甘油，0.2 mM EDTA，0.2%Triton X-100和1x蛋白酶抑制剂）。对HA肽的洗脱液进行质谱分析，以鉴定与泛素化p53特异性结合的所有伴侣。

5. 变性条件下泛素化蛋白的纯化

1. 向步骤3.3中获得的细胞沉淀中加入1mL冰冷的PBS，并混合均匀。将 100 μL（1/10 体积）的细胞悬液等分到微量离心管中作为输入样品。
2. 在4°C下以700× g 离心5分钟以收集细胞沉淀。向输入样品中加入 80 μL Flag 裂解缓冲液，使用涡旋振荡器或移液器枪混合细胞，并在冰上裂解细胞 1 小时。
3. 在4°C下以8，000× g 离心20-30分钟。 将 80 μL 上清液分装到新的微量离心管中。
4. 向上清液中加入20μL的5x SDS上样缓冲液，在98°C下煮沸5-10分钟，在冰上冷却2分钟，并在-20°C下储存直至使用。
5. 将剩余的900μL细胞悬液在4°C下以700×g离心5分钟以收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入 1 mL 泛素缓冲液 1（UB 缓冲液 1;6 M 胍-HCI、0.1 M Na 2 HPO 4、6.8 mM NaH 2 PO₄、10 mM Tris-HCI （pH 8.0） 和_0.2% Triton X-100，新鲜补充有 10 mM β-巯基乙醇和 5 mM 咪唑），并通过上下移液混合数次以使细胞均匀分布。
   注意:咪唑的浓度可能在5mM至20mM之间变化，以减少带镍树脂上的非特异性蛋白质结合。泛素缓冲液含有盐酸胍，可使连接酶和DUB失活。β-巯基乙醇是一种透明无色液体，具有类似于臭鸡蛋的强烈难闻气味。高浓度溶液会对粘膜、上呼吸道、皮肤和眼睛造成严重损害。戴上手套和护目镜，在通风橱中操作。
6. 对细胞裂解物进行10-20轮超声处理，直到溶液不再粘稠。在冰上以20 kHZ的超声频率和80%的振幅进行超声处理，每个脉冲持续1秒。在室温下以8，000× g 离心20-30分钟，并将上清液转移到新的微量离心管中。
7. 向上清液中加入 30 μL 带镍的树脂，并在设置为 15 rpm 的旋转器上孵育 4 小时或在室温下孵育过夜。 在室温下以 1，500 x g 离心 2 分钟以收集珠子。
8. 加入 1 mL UB 缓冲液 1，在室温下在摇床中旋转孵育 10 分钟，并在室温下以 1，500 x g 离心 2 分钟以收集珠子。
9. 向磁珠中加入 1 mL 泛素缓冲液 2（UB 缓冲液 2;8 M 尿素、0.1 M Na 2 HPO 4、6.8 mM NaH 2 PO₄、10 mM Tris-HCI （pH 8.0） 和 0.2% Triton X-100），在室温下在摇床中旋转孵育 10 分钟，并以 1，500 x g 离心₂分钟以收集珠子。再重复一次。
10. 向珠子中加入 1 mL PBS，在室温下在摇床中旋转孵育 10 分钟，并在室温下以 1，500 x g 离心 2 分钟以收集珠子。再重复一次。
11. 通过将珠子与 40 μL 咪唑在室温下以 0.5 M 的终浓度孵育 1 小时来洗脱结合的蛋白质。 在室温下以 1，500 x g 离心 2 分钟。
12. 将上清液转移到干净的微量离心管中，加入 10 μL 5x SDS 上样缓冲液，在 98 °C 下煮沸 5 分钟，在冰上冷却 2 分钟，并在 -20 °C 下储存用于蛋白质印迹。或者，将未处理的洗脱液储存在-80°C下以进行其他下游实验。

6. 蛋白质印迹法检测纯化的泛素蛋白

1. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离步骤4.11和5.12中的样品，然后通过蛋白质印迹将其转移到硝酸纤维素膜上，以使用相应的抗体检测靶蛋白，如¹⁸所述。
2. 简而言之，通过将含有5%defat奶粉的20mL封闭溶液浸入TBST缓冲液（15mM Tris-HCI;pH = 7.6，4.6mM Tris碱，150mM NaCI，使用前新鲜补充0.1%吐温-20）在室温下孵育膜1小时。然后，将膜与一抗在室温下孵育2小时或在4°C下孵育过夜。 每组使用以下抗体。所有一抗均以1:1000的稀释度使用。
   1. 用 Flag/M2 琼脂糖珠免疫沉淀后，用抗 p53 单克隆抗体检测总 p53 蛋白，包括泛素化的 p53。
   2. 用 Flag/M2 琼脂糖珠免疫沉淀后，用抗 HA 抗体或抗泛素抗体检测泛素化的 p53 蛋白。
   3. 在带镍树脂下拉后，用抗 p53 单克隆抗体检测泛素化的 p53 蛋白。
   4. 在带镍树脂下拉后，使用抗 HA 抗体或抗泛素抗体检测总泛素化蛋白。
3. 用TBST缓冲液洗涤3次后，在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育膜1小时。所有二抗均以1:3000的稀释度使用。然后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟，轻轻搅拌。
4. 启动化学发光成像系统以检测蛋白质印迹的信号。通过以1:1的比例混合溶液A和B来制备HRP的底物溶液。
5. 将硝酸纤维素膜面朝上放入相机暗箱中，并使用移液枪将底物溶液均匀地涂覆在膜上。选择自动曝光程序以捕获化学发光信号并手动调整曝光时间，直到获得理想信号。

示意图显示了Flag标记的p53（Flag-p53）和His/HA双标记泛素（HH-Ub）蛋白（图1A）。用于纯化泛素化蛋白质的程序总结在 图1B中。Poly-His标记的泛素可以连接到哺乳动物细胞中的靶蛋白。泛素化的蛋白质可以在非变性条件下用Flag/M2磁珠纯化，也可以在变性条件下用固定化金属离子亲和色谱（IMAC）纯化（图1B）。总p53蛋白，包括泛素化的p53，在非变性条件下用来自H1299细胞的Flag/M2磁珠免疫沉淀。当Mdm2在这些细胞中异位表达时，来自泛素化p53蛋白的信号（从低分子量到高分子量表现为拖尾条带）显着增加，这表明泛素化的p53蛋白已从细胞中有效纯化（图2）。接下来，在变性条件下裂解细胞，并用带镍的树脂拉下总细胞泛素化蛋白。使用抗HA单克隆抗体通过蛋白质印迹法检测总细胞蛋白，并使用抗p53单克隆抗体检测泛素化的p53蛋白。结果表明，在这些细胞中过表达Mdm2后，总泛素化蛋白水平保持不变，但泛素化的p53蛋白水平显着增加。这些结果表明，在变性条件下，含有泛素化p53的总泛素蛋白被有效地从细胞裂解物中拉下（图3）。

图 1:用于纯化泛素化蛋白的程序摘要 。 （A）Flag标记p53（Flag-p53）和His/HA双标记泛素（HH-Ub）蛋白的示意图。（B）泛素化的蛋白质可以在非变性条件下用Flag/M2磁珠纯化，在变性条件下可以用IMAC纯化。缩写:His/HA = 聚组氨酸/血凝素;Ub = 泛素;Flag/M2 磁珠 = 抗 Flag M2 抗体偶联磁珠;IMAC = 固定化金属离子亲和色谱。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:泛素化的 p53 蛋白在非变性条件下纯化。 将Flag-p53表达质粒单独转染至HH-Ub或Mdm2和HH-Ub转染到H1299细胞中。总p53蛋白和泛素化形式由细胞提取物中的Flag/M2磁珠免疫沉淀。洗脱液用抗p53（A）和抗HA（B）单克隆抗体进行蛋白质印迹。（C）粗细胞提取物（输入）用抗p53和抗Mdm2单克隆抗体进行蛋白质印迹。GFP被用作加载控件。缩写:HH-Ub = His/HA 双标记泛素;HA = 血凝素;Flag/M2 磁珠 = 抗 Flag M2 抗体偶联磁珠;GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:泛素化的 p53 蛋白在变性条件下纯化。 将Flag-p53表达质粒单独转染至HH-Ub或Mdm2和HH-Ub转染到H1299细胞中。用带镍的树脂拉下总细胞泛素化蛋白，然后用抗p53和抗HA单克隆抗体进行蛋白质印迹。（A）使用抗p53抗体检测泛素化的p53蛋白。（B）使用抗HA抗体检测总泛素蛋白。（C）粗细胞提取物（输入）用抗p53和抗Mdm2单克隆抗体进行蛋白质印迹。GFP被用作加载控件。缩写:HH-Ub = His/HA 双标记泛素;HA = 血凝素;GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。

作者声明没有相互竞争的经济利益。