从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白

摘要

本方案描述了一种从哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白的逐步方法，并以p53肿瘤抑制蛋白为例。在严格的非变性与变性条件下，从细胞中纯化出泛素化的p53蛋白。

摘要

泛素化是一种翻译后修饰，不仅调控底物蛋白的稳定性，还调控其定位和功能。泛素化过程发生在真核细胞内，几乎调控所有基本的细胞生物学过程。纯化泛素化蛋白有助于研究泛素化在调控底物蛋白功能中的作用。本文以p53肿瘤抑制蛋白为例，详细描述了一步一步纯化哺乳动物细胞中泛素化蛋白的实验流程。泛素化的p53蛋白在严格的非变性条件和变性条件下均实现了纯化。在非变性条件下，利用抗Flag抗体偶联的琼脂糖树脂纯化全细胞中的Flag标签p53蛋白。 alternatively，在变性条件下，利用镍离子负载的树脂纯化全细胞中的His标签泛素化蛋白。通过特异性抗体可在洗脱液中成功检测到泛素化的p53蛋白。采用该方法，可从哺乳动物细胞中高效纯化特定蛋白的泛素化形式，从而促进对泛素化调控蛋白功能作用的研究。

引言

泛素是一种由76个氨基酸组成的进化保守蛋白^1,2,3泛素通过激活酶（E1）、结合酶（E2）和连接酶（E3）参与的级联反应，共价结合至靶蛋白的赖氨酸残基上。泛素首先由E1酶激活，随后转移至E2结合酶。接着，E3泛素连接酶同时与携带泛素的E2酶及底物蛋白相互作用，介导泛素C末端与底物蛋白中某个赖氨酸残基之间形成异肽键。^1,2,3,4,5泛素化是指将泛素分子共价连接到底物蛋白的赖氨酸残基上或泛素自身，从而导致蛋白质发生单泛素化或多聚泛素化。该泛素化过程发生在真核细胞内，调控多种多样的生物学过程。泛素化可导致底物蛋白的降解。 通过 泛素-蛋白酶体系统^1,2,3,4

方案

注意：H1299 细胞由中科院干细胞库惠赠，并已证实无支原体污染。

1. 细胞培养

1. 初次培养时，将1 × 10⁶个人类肺腺癌细胞系H1299细胞接种于一个10 cm培养皿中，加入10–12 mL RPMI 1640培养基，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺添加剂、1%丙酮酸钠以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。根据细胞生长情况，当细胞融合度达到80%–90%时，每2–3天传代一次。
2. 转染前一天，为三个10 cm培养皿准备6–9 × 10⁶个细胞，将2–3 × 10⁶个细胞接种至单个含10–12 mL培养基的10 cm培养皿中，使转染时细胞融合度达到70%–90%。
   ​注意：由于HEK293T细胞具有较高的转染效率和蛋白表达水平，也可用于纯化泛素化蛋白。

2. 质粒转染

1. 在三个15 mL离心管中各加入1.5 mL低血清培养基。
2. 将用于转染的质粒DNA分别加入各管中，配制如下稀释液：1号管：1 µg Flag-p53质粒，12 µg空载体；2号管：....

结果

示意图显示了带 Flag 标签的 p53（Flag-p53）和带 His/HA 双标签的泛素（HH-Ub）蛋白（图 1A）。用于纯化泛素化蛋白的实验流程总结于 图 1B。在哺乳动物细胞中，带有 Poly-His 标签的泛素可连接至靶蛋白。泛素化蛋白可在非变性条件下使用 Flag/M2 琼脂糖微珠进行纯化，或在变性条件下通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）进行纯化（图 1B）。在非变性条件下，从 H1299 细胞中使用 Flag/M2 微珠免疫沉淀总 p53 蛋白（包括泛素化的 p53）。泛素化 p53 蛋白在免疫印迹上表现为从低到高分子量的弥散条带，当在这些细胞中外源表达 Mdm2 时，该信号显著增强，表明泛素化 p53 蛋白已从细胞中被有效纯化（图 2）。接下来，在变性条件下裂解细胞，并使用镍离子负载树脂下拉总细胞泛素化蛋白。通过抗 HA 单克隆抗体进行 Western 印迹检测总细胞泛素化蛋白，.......

讨论

泛素化在几乎所有生理和病理性的细胞过程中都起着关键作用²。近年来，在理解泛素在信号通路中的分子作用以及泛素系统的变化如何导致不同人类疾病方面已取得重大进展²。纯化泛素化蛋白有助于深入揭示泛素化在这些过程中的确切功能。泛素偶联蛋白的混合物可从细胞中在非变性和变性条件下进行纯化。在变性条件下，可使用镍树脂的IMAC 方法纯化带有多聚组氨酸标签的蛋白。在变性条件下纯化泛素化蛋白的目的是去除与目标蛋白相互作用的伴侣分子。在变性条件下，所有与目标蛋白结合的细胞组分都会在洗脱过程中被去除。相比之下，在天然条件下，部分与目标蛋白结合的细胞蛋白可能仍保留在洗脱液中，从而可能干扰后续实验。即使存在强变性剂，泛素化蛋白仍可被有效纯化，这显著减少了非特异性蛋白与镍树脂的结合。相反，包括其泛素化形式在内的全部目标蛋白，可在非变性条件下利用抗体偶联的琼脂糖微珠通过表位标签策略进行纯化。由于该过程采用抗体介导的亲和纯化，蛋白纯化在较温和的条件下进行。目标蛋白及其泛素化形式可通过特异性识别蛋白或泛素的抗体进行检测。HA标签和Myc标签蛋白可使用相同的抗体偶联琼脂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
β-巯基乙醇	Sangon Biotech	M6250
Amersham ECL 小鼠 IgG，HRP 标记全抗体（来自绵羊）	GE healthcare	NA931	二抗
Amersham ECL 大鼠 IgG，HRP 标记全抗体（来自驴）	GE healthcare	NA935	二抗
Anti-Flag M2 亲和凝胶	Sigma-Aldrich	A2220	FLAG/M2 琼脂糖珠
抗 GFP 单克隆抗体	Santa Cruz	sc-9996	一抗
抗 HA 高亲和力抗体	Roche	11867423001	一抗
抗 Mdm2 单克隆抗体（SMP14）	Santa Cruz	sc-965	一抗
抗 p53 单克隆抗体（DO-1）	Santa Cruz	sc-126	一抗
EDTA	Sigma-Alddich	E5134	溶剂
胎牛血清	VivaCell	C04001-500	FBS
FLAG 肽段	Sigma-Alddich	F3290	洗脱缓冲液配制
GlutaMAX	Gibco	35050-061	添加剂
盐酸胍	Sangon Biotech	A100287-0500	溶剂
H1299	中国科学院干细胞库
Image Lab	Bio-rad		软件
咪唑	Sangon Biotech	A500529-0100	溶剂
Immobilon Western 化学发光 HRP 底物	Millipore	WBKLS0500
Lipofectamine 2000 试剂	Invitrogen	11668019	转染试剂
MG132	MedChemExpress	HY-13259	蛋白酶体抑制剂
Na₂HPO₄	Sangon Biotech	A501727-0500	溶剂
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	溶剂
NaF	Sigma-Alddich	201154	溶剂
NaH₂PO₄	Sangon Biotech	A501726-0500	溶剂
Ni-NTA 琼脂糖	QIAGEN	30230	镍离子负载树脂
硝酸纤维素印迹膜	GE healthcare	10600002	0.45 µm 孔径
Opti-MEM 低血清培养基	Gibco	31985-070	转染培养基
PBS	Corning	21-040-cv
青霉素-链霉素溶液	Sangon Biotech	E607011-0100	抗生素
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340
RPMI 1640	Biological Industries	01-100-1ACS	培养基
Sarkosyl	Sigma-Alddich	L5777	溶剂
SDS 上样缓冲液	Beyotime	P0015L
丙酮酸钠	Gibco	11360-070	添加剂
Tris 碱	Sangon Biotech	A501492-0005	溶剂
Tris-HCl	Sangon Biotech	A610103-0250	溶剂
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694-0500	试剂
Tween-20	Sangon Biotech	A100777-0500	添加剂
超灵敏化学发光成像系统	Bio-rad		ChemiDoc XRS+
尿素	Sangon Biotech	A510907-0500	溶剂