本文介绍了一种在双室可渗透支持系统中培养犬肠道类器官的实验方案。该方案详细描述了在可渗透支持膜上接种类器官、单层细胞的维持培养，以及后续的药物渗透性实验。
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摘要
摘要
可渗透支持系统通常与传统的二维（2D）细胞系联合使用 体外 用于评估新型治疗药物候选物口服渗透性的工具。然而，这些传统细胞系的使用存在局限性，例如紧密连接表达的改变、细胞部分分化以及关键核受体的缺失。尽管存在这些不足，Caco-2 和 MDCK 模型仍被广泛接受并验证用于预测人体吸收特性 体内 口服通透性
狗因其胃肠道解剖结构和肠道微生物群与人类具有高度相似性，是生物医学研究中重要的转化模型。因此，为了支持并行的药物开发，建立一种高效且准确的 体外 用于预测的工具 体内 在犬类和人类中均具有高度理想的药物渗透性特征。这种工具可能是犬类肠道类器官系统，其特征是由成体干细胞衍生的三维（3D）自组装上皮结构。
（1）可渗透支持物接种方案描述了在插入物中解离并接种犬类类器官的实验方法。犬类类器官的分离、培养与收获已在本期特刊的另一套方案中详细描述。（2）单层培养物维持方案则全面讨论了犬肠类器官单层培养的一般维护方法。此外，本方案还介绍了通过跨上皮电阻（TEER）测量和光学显微镜评估单层结构完整性的方法。最后，（3）通透性实验方案 描述实验直接前序所需完成的任务，包括 体外 实验结果的验证
总体而言，犬类类器官模型结合双室细胞培养技术，克服了二维实验模型的相关局限性，从而提高了对犬类及人类患者治疗性候选药物表观口服渗透性的预测可靠性。
引言
可渗透支持系统通常用于测定治疗性药物候选物通过肠上皮屏障的表观渗透性1,2它们也可用于评估细胞分泌。3细胞迁移4，以及药物毒性5. 体外 口服药物渗透性检测是药物发现与开发过程中的关键步骤2，各个药物候选物在药物研发早期阶段进行测试&D 生命周期6可渗透支持系统是一种双室细胞培养装置，由带有半透膜的插入式培养小室和多孔板组成。该系统可直接接触培养在插入式小室中的单层细胞的顶端和基底外侧表面。7这些系统中使用的单层通常来源于胃肠道上皮细胞（例如，人结肠直肠腺癌 Caco-2 细胞系）8细胞培养物以极化状态生长，模拟肠道上皮细胞的天然微结构，促进进一步的细胞分化，并实现相似的微观解剖结构与功能7. 有关可渗透支撑插入物的详细信息，可参见 图1将二维细胞培养物接种至小室中，传统上用于评估肠道药物通透性，其成本相对较低且易于培养9这些系统存在若干主要局限性，包括其预测治疗性药物候选物肠道代谢能力有限10,11这对于所有药物吸收机制均成立，无论是通过上皮细胞间紧密连接的被动吸收、通过外排或摄取转运蛋白（如P-糖蛋白、单羧酸转运蛋白1）的主动跨上皮吸收，还是由肠上皮细胞代谢的药物。
犬类与人类共享相似的生活环境和饮食12。犬类的肠道解剖结构和微生物组组成与人类高度相似13，这被认为源于过去36,000年来的驯化过程以及共通的饮食习惯14。然而，这些相似性也可能成为疾病发生共通的原因或诱因。犬类会罹患与人类类似的慢性疾病，例如肥胖症15、炎症性肠病16、结直肠腺癌17、胃肠道间质瘤（GIST）18，以及其他与其相对较长寿命相关的多种病理状况19。因此，在“同一健康”倡议（One Health Initiative）的理念下，犬类类器官可被成功应用于这些慢性多因素疾病的逆向转化研究20。
Caco-2 细胞是药物口服吸收实验中最常用的细胞系21这些细胞目前被认为是“金标准”模型 体外 肠道通透性检测2,22,23Caco-2 细胞系表达人肠道中发现的外排和摄取转运蛋白，尽管其表达水平有所不同24,25,26Caco-2 细胞还被广泛用作模型，以确定某种药物是否为肠道外排转运蛋白的底物或抑制剂22,27尽管Caco-2细胞来源于结肠，但其具有类似小肠上皮细胞的特性。然而，Caco-2细胞仅能代表小肠上皮层中的一种细胞类型9，无法准确重现复杂的肠道上皮细胞类型组成。例如，负责黏液分泌的杯状细胞在Caco-2培养中缺失，因此若不与其他细胞系共培养，便无法评估黏液与药物之间的相互作用28此外，Caco-2 细胞培养物不表达肠道中通常存在的多种重要核受体，例如妊娠烷X受体（PXR）、类固醇X受体（SXR）和组成型雄甾烷受体（CAR）。29因此，Caco-2 培养模型无法模拟某些药物（如利福平）作为这些受体的诱导剂对药物转运蛋白和代谢酶的诱导作用。30.
三维肠道类器官技术解决了其中一些局限性19类器官是由成体干细胞衍生的自组装结构，可通过微创技术获取的组织样本建立20人类诱导多能干细胞正被用于构建肠道通透性模型31,32犬类类器官为人类类器官提供了相关替代方案，因为人类干细胞研究受到伦理问题的限制33此外，犬类类器官提供了一种 体外 用于研究犬类药物通透性、代谢、主动转运及药物-药物相互作用的系统。为弥补该技术空白，已有研究报道了在可渗透支持系统中稳定且可靠地培养犬类肠类器官的方法34. 利用犬肠道类器官进行通透性检测，可能比目前常用的检测方法（Caco-2）更有效地预测小分子药物在犬体内的肠道通透性和代谢情况。这些关键特性的验证为这一新型方法提供了支持 体外 将该系统用于未来研究诱导剂对细胞内代谢和主动运输潜在影响的工作。
犬类类器官包含肠道上皮层中通常存在的所有细胞类型。从功能和微解剖学角度来看，它们能够可靠地模拟犬肠道上皮层的环境19,35。此外，犬肠道类器官中黏液、犬特异性药物转运蛋白和酶的存在情况以及整体的细胞分化程度，均与犬体内（in vivo）观察到的结果相当34。因此，可从患病的兽医临床病例中分离类器官，并用于模拟各种疾病过程（如慢性肠道炎症）对犬口服药物通透性的影响19,36。犬肠道类器官系统也可应用于药物通透性实验以外的其他研究场景。这些三维结构还可如Chandra等人先前所述，从患有炎症性肠病、结直肠腺癌和胃肠道间质瘤的患病动物中分离获得19。
可渗透支持物接种方案描述了在插入物中建立犬肠道类器官培养物的方法。本方案首先概述了从包被于细胞外基质膜中的已建立犬类器官培养物进行解离的方法。此外，本方案还讨论了使用I型胶原和细胞外基质膜对插入物进行预包被的步骤。同时详细描述了将犬类器官嵌入可渗透支持物插入物中的过程。
第二个方案是单层培养物维持方案，包括对培养在插入式培养板中的犬类三维类器官进行常规维护。本方案介绍了用于更新培养物的类器官培养基的更换频率和体积，以及防止细胞培养损伤的方法，同时还提供了评估上皮单层细胞融合度的实验方法。
最后，通透性实验方案重点介绍如何判断犬肠道三维类器官在通透性检测中是否已具备实验使用条件，以及在开展任何实验前所需的验证步骤。本部分还描述了通透性实验的建立与成功实施过程，包括在单层培养体系的腔室中对治疗性候选药物进行孵育和取样。同时讨论了使用低通透性荧光素异硫氰酸盐（FITC-葡聚糖）监测单层结构完整性的方法。最后，一个 体外 实验结束后用于验证结果的评估方法已作描述。通透性实验是一个极为广泛的课题，Hubatsch 等人对此已有非常全面的综述。37各实验方案的工作流程总结如下 图2.
图1：犬类肠道类器官在可渗透支持系统上的培养。 可渗透支持膜插入物置于24孔板的孔中。微孔膜可用于接种解离的犬类肠道类器官，这些细胞最终将形成类器官的二维单层结构。该技术可同时接触单层细胞的顶侧（AP）和基底侧（BL）。在可渗透支持物的顶侧和基底侧腔室中均加入类器官培养基。图中展示了候选药物的吸收（AP→BL）和分泌（BL→AP）过程，以及两种可能的药物转运模式。缩写：AP = 顶侧；BL = 基底侧。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：犬类类器官可渗透支持膜实验流程图。 可渗透支持膜小室预先用细胞外基质膜与 I 型胶原的混合物包被，并孵育 1 小时。在孵育过程中，将类器官培养物进行解离。将单个类器官细胞接种至小室内，接种后立即向基底外侧室加入培养基，而向顶侧室加入培养基则在接种完成后 24 小时进行。类器官的维持与监测包括定期更换培养基、测量 TEER 值以及使用光学显微镜评估单层细胞的完整性。实验前，需通过从培养基中去除 ROCK 抑制剂和 GSKiβ 使类器官完成分化。实验当天测量 TEER 值，并通过光学显微镜检查类器官单层细胞是否受损。随后更换为适当的缓冲液，并在实验前进行孵育。在肠道通透性实验中，使用 FITC-葡聚糖实验39作为单层完整性标志物。实验后再次测量 TEER 值，并在 24 小时后通过光学显微镜验证结果。缩写：TEER = 跨上皮电阻；ROCK = Rho 相关激酶；GSKiβ = 糖原合酶激酶 β；F = 荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
方案
本研究经爱荷华州立大学机构动物照护与使用委员会批准并依照其规定执行（IACUC-19-337；IACUC-18-065；IACUC-19-017）。以下部分（步骤1.1–1.3）描述了可渗透支持物接种方案，相关操作流程总结于图3中。
图3：可渗透支持物接种方案的工作流程。 可渗透支持物小室预先包被CMGF+ R/G、I型胶原和细胞外基质的混合物，随后进行孵育。吸除犬类类器官培养物中的培养基，并替换为细胞回收溶液，于4 °C孵育30分钟。将培养物转移至离心管中，使用类胰蛋白酶蛋白酶进行类器官解离。通过滤网过滤去除未解离的类器官，以获得单细胞悬液，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。将细胞接种于可渗透支持物小室上，并向基底外侧腔室中加入CMGF+ R/G。培养24小时后，移除顶侧腔室中的剩余液体，并替换为CMGF+ R/G。缩写：ROCK = Rho相关激酶；GSKiβ = 糖原合酶激酶β；CMGF + R/G = 含生长因子的完全培养基，添加ROCK抑制剂和GSKiβ。 请点击此处查看该图的放大版本。
1. 可渗透支持物接种方案
- 可渗透支持性插入物的预包被
- 根据表1中的信息，配制含生长因子并添加Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂和糖原合成酶激酶-β抑制剂（GSKiβ）的完全培养基（CMGF + R/G）。
- 准备一个冰桶，开始在冰上解冻细胞外基质基底膜。将含有所需数量插入物的24孔板放入培养箱中预热。取出大鼠尾胶原I（3 mg/mL），避光并置于冰上。同时取出CMGF + R/G，也置于冰上。
- 计算实验所需的插入物和空白对照的总数，为每个插入物预留100 µL包被液。
注意：应配制比实际需要量更多的包被液；建议至少多配制15%。 - 在15 mL离心管中，将CMGF + R/G与细胞外基质基底膜（1%）和胶原I（1%）混合，并轻轻吹打混匀。
- 向每个聚酯插入物中加入100 µL包被液，然后将插入物放入培养箱（37 °C；5% CO2环境）中孵育1小时。
- 孵育结束后，使用真空抽吸装置或P1000移液器小心地从每个插入物中吸除包被液，注意不要扰动插入物的滤膜。将已包被的孔板放回培养箱中保温。
- 犬类类器官的解离
注意：使用已培养至少四天的犬类类器官。在开始解离前，请参考Gabriel等人的研究38，以判断样本是否健康、致密且适合实验。建议每次铺板操作额外解离一孔类器官。此外，建议将目标插入物数量增加约20%，以弥补类器官生长不均或操作不当造成的损失。若计划使用FITC-葡聚糖，请额外准备若干孔样本。- 在生物安全柜中准备一个冰桶和一瓶冷的1× Advanced DMEM/F12储备液。
- 将细胞外基质基底膜置于冰上开始解冻，确保其完全浸没在冰中，以防快速解冻或凝固。将一盒P200移液器吸头放入冰箱冷冻，用于后续细胞外基质基底膜的铺板操作。
- 将冷冻离心机预冷至4 °C。
- 将CMGF + R/G从冰箱或冷冻柜转移至37 °C水浴中预热。尽可能避免直接光照。
- 从24孔板中移除含有类器官培养物的培养基（每2–4个插入物使用1孔），注意不要扰动细胞外基质基底膜。
注意：移除体积可能因所用细胞计数系统而异。 - 每孔加入0.5 mL预冷的细胞回收溶液，以溶解细胞外基质基底膜的穹顶结构。
- 将孔板在冰箱（4 °C）中孵育30分钟。
- 用移液器吹打悬浮液，收集所有类器官及溶解的细胞外基质基底膜，并转移至15 mL离心管中。
- 离心（700 × g，4 °C，5分钟），弃去上清液至液面接近0.5 mL刻度线，注意不要扰动沉淀。
- 加入1 mL类胰蛋白酶蛋白酶，在37 °C水浴中孵育8分钟。孵育期间多次轻弹管壁以混匀细胞。
- 将样品管转移回生物安全柜，缓慢加入7 mL预冷的Advanced DMEM/F12，以灭活类胰蛋白酶蛋白酶并终止细胞解离过程。
- 用1 mL Advanced DMEM/F12预润湿40 µm细胞筛网。轻轻吹打混合液并通过筛网过滤；再用适量Advanced DMEM/F12冲洗筛网。
- 离心（700 × g，4 °C，5分钟），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
- 每解离一孔类器官，用约50–100 µL培养基（CMGF + R/G）重悬细胞沉淀。
- 使用血细胞计数板或相应仪器对部分悬浮液（约10 µL）进行计数，确定悬浮液中的总细胞数。
- 犬类类器官的接种
- 将细胞悬液稀释或浓缩，使细胞浓度达到约75,000个细胞/mL。
- 使用预先用BSA（1%）包被的吸头，向每个插入物中接种100 µL细胞悬液，以避免转移过程中细胞黏附。额外添加一个包被过的插入物作为空白对照（无类器官生长），但仍需定期更换培养基。
- 轻轻以圆形方式旋转孔板约30秒，使接种的细胞在插入物表面均匀分布。通过光学显微镜确认细胞分布的均匀性。
- 向基底侧腔室加入700 µL CMGF + R/G，并将孔板放入培养箱（37 °C；5% CO2环境）中培养24小时。
- 24小时后，小心移除顶侧腔室中的细胞悬液，替换为200 µL CMGF + R/G。将孔板放回培养箱继续培养。
2. 类器官细胞单层培养维持方案
注意：以下部分（步骤 2.1–2.2）描述了类器官细胞单层的维持方案。本方案中操作流程的概要见图 4。用于记录笔记、有助于标准化 TEER 值测量的表格见补充表 1。
图 4：可渗透支持培养物维护流程。使用电极（探针）和伏特/欧姆表测量 TEER 值。在将探针插入孔板前，必须用 70% 乙醇进行化学灭菌。随后测量空白对照和类器官细胞插入物的 TEER 值并进行计算。接着在顶腔和基底外侧腔中更换培养基，并使用光学显微镜观察插入物上的犬类类器官培养物。若发现类器官培养物或微孔膜出现撕裂，应根据实验方案进行相应处理。缩写：TEER = 跨上皮电阻。 请点击此处查看该图的放大版本。
- TEER 值测量
注意：TEER 值测量使用带有筷子式电极附件的上皮细胞伏特/欧姆计进行。请参阅制造商的使用说明。TEER 值可提供关于犬类类器官单层完整性的信息。- 在细胞培养生长期间，每隔一天进行一次 TEER 值测量。
- 将上皮细胞伏特/欧姆计及其电极移至生物安全柜内。使用 70% 乙醇对电极进行化学消毒后再使用。将功能设置为欧姆（Ohms）。等待至少一分钟，直至电极完全干燥。
- 在进行首次测量前，将导线电极插入接口并打开电源。确保仪器在插入导线电极而非测量用筷子电极时显示 1,000 Ω。若不符合此情况，请调整设备。
- 将电极插入无细胞的培养插件（空白对照）的顶侧腔室和基底外侧腔室中，使顶侧腔室中插入较短的电极，基底外侧腔室中插入较长的电极（如图 4所示）。切勿触碰膜表面，但同时确保电极完全浸入培养基中。
- 等待数秒，直至读数稳定，并在实验记录本中记录该数值。测量其余犬类类器官单层时，务必在测量不同样品之间使用 70% 乙醇对电极进行消毒。注意避免电极接触类器官单层。
- 测量完成后，最后一次使用 70% 乙醇对电极进行消毒。务必避免因操作不当造成电极损坏，并按照制造商的说明妥善存放。
- 使用公式（1）计算每个孔的 TEER 值，其中 Rsample 和 Rblank 分别为单层孔和空白孔测得的电阻值（Ω），面积（cm²）为插件的有效膜面积。
(1)
- 单层培养维护
注意：请参阅表 2中推荐的培养基更换方案。- 使用无菌一次性 9 英寸巴斯德吸管和真空抽吸装置，轻柔地从顶侧腔室开始，然后从基底外侧腔室中抽吸培养基。倾斜培养板以清晰观察培养基液面。在顶侧腔室中抽吸时，避免过于靠近微孔膜，以防损伤细胞单层。
注意：在不同样品间操作时应使用新的巴斯德吸管。移液器也可作为该步骤的替代工具。 - 使用 P1000 移液器缓慢加入 CMGF+ R/G 培养基，将液体沿顶侧或基底外侧腔室的孔壁加入。在顶侧腔室中更换培养基时需格外小心，避免损伤单层结构。
- 每隔一天在光学显微镜下检查各孔，评估培养状态，并监测类器官单层或微孔膜是否存在撕裂。使用相差显微镜以突出显示培养物的细节。
注意：若发生犬类类器官单层撕裂，可给予一定时间使其恢复和再生；若微孔膜发生撕裂，则该孔必须从实验中剔除。
- 使用无菌一次性 9 英寸巴斯德吸管和真空抽吸装置，轻柔地从顶侧腔室开始，然后从基底外侧腔室中抽吸培养基。倾斜培养板以清晰观察培养基液面。在顶侧腔室中抽吸时，避免过于靠近微孔膜，以防损伤细胞单层。
表2：类器官培养的培养基更换建议。 每隔一天在孔板的顶腔和基底外侧腔更换一次CMGF+ R/G培养基。周末期间因培养时间延长，需在星期五下午向基底外侧腔和顶腔添加更大体积的培养基，并于星期一进行更换。缩写：ROCK = Rho相关激酶；GSKiβ = 糖原合酶激酶β；CMGF + R/G = 含生长因子的完全培养基，添加ROCK抑制剂和GSKiβ。 请点击此处下载该表格。
3. 通透性实验方案
注意：以下部分（步骤 3.1-3.5）描述了通透性实验方案。in vitro 药物通透性测定的实验流程总结于图 5中。
图 5：实验方案的工作流程。 在接种细胞小室后 8 至 12 天内，必须将类器官培养基从 CMGF+ R/G 更换为 CMGF+，以促进细胞分化。将培养基（包括顶侧和基底侧）更换为 CMGF+ 后，TEER 值应继续上升，犬类类器官单层接近完全汇合。培养基更换为 CMGF+ 至少四天后，评估单层的准备状态。当单层完全形成且 TEER 值达到平台期（通常在 1,500 至 2,500 Ω·cm2 之间）时，将培养基更换为转运缓冲液，孵育 30 分钟，使单层适应新环境。在实验的 0 分钟时，进行 FITC-葡聚糖检测，并收集 20 分钟时的基底侧样品。随后在酶标仪上分析结果。实验结束后，再次将顶侧和基底侧腔室内容物更换为 CMGF+，并测量 TEER 值。单层继续孵育 24 小时，并通过重复测量 TEER 值评估单层完整性。缩写：TEER = 跨上皮电阻；ROCK = Rho 相关激酶；GSKiβ = 糖原合酶激酶 β；CMGF + R/G = 含生长因子的完全培养基，添加 ROCK 抑制剂和 GSKiβ；CMGF+ = 含生长因子的完全培养基，不含 ROCK 抑制剂或 GSKiβ；FITC = 异硫氰酸荧光素；F = 荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 评估类器官单层细胞的准备状态
注意：此步骤在接种后 8–14 天进行。- 每隔一天至少在光学显微镜下检查一次单层细胞（使用相差显微镜观察单层细胞的完整性）。当细胞单层完全形成、无间隙或明显撕裂迹象时，进入下一步。
- 将类器官培养基从 CMGF+ R/G 更换为 CMGF+（去除培养基中的 ROCK 抑制剂和 GSKiβ）。建议在实验前至少四天完成培养基更换。
注意：此步骤有助于类器官单层细胞的正常分化。 - 继续每隔一天左右测量 TEER 值。当 TEER 值开始稳定在约 1,500 至 2,000 Ω × cm² 时（图 6），改为每天测量 TEER 值。
注意：这种稳态可维持约 2–3 天，是进行通透性检测的最佳时间窗口（通常在第 11 至 13 天）。稳态 TEER 值可能因类器官的肠道定位、测量温度、犬的品种、年龄和疾病状态而略有波动。 - 应立即安排药物通透性测定，以避免 TEER 值迅速下降或类器官单层过度生长形成多层细胞。
- 实验前准备
注意：实验过程中可使用摇床培养箱，以避免静止水层的影响。TEER 值应在恒定温度下测量。- 实验当天，测量 TEER 值，并确认其已达到稳态且未快速下降。
- 从超过 20% 的小室中，选择最佳的单层细胞（通过光学显微镜观察和 TEER 值判断）用于实验。
- 在光学显微镜下观察单层细胞，排除不完整、撕裂或过度生长的类器官单层。
- 配制转运缓冲液，并将其 pH 调整至所需数值。
注意：实验缓冲液的组成根据实验设计而异。常用的缓冲液包含 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）、葡萄糖（12.5 mM）和 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，25 mM）。该组成可确保类器官在实验期间维持活性。 - 小心吸除所选小室的顶腔和基底外侧腔中的培养基。
- 向顶腔加入 200 µL 转运缓冲液，向基底外侧腔加入 800 µL 转运缓冲液。
注意：为避免单层细胞从微孔膜上脱落，应先向顶腔加入转运缓冲液，再向基底外侧腔加入。 - 将培养板置于培养箱中（37 °C；5% CO2 气氛）平衡 30 分钟。
注意：犬类器官单层细胞现已准备好进行药物通透性实验。
- 典型实验设计——IgY 浓度溶液
注意：实验设计和布局可根据研究问题进行调整。本方案以免疫球蛋白 Y（IgY）通过类器官单层的通透性为例，可进行相应修改。“供体腔”指药物初始加入的腔室，“接收腔”指从供体腔接收药物的腔室。典型实验在 2 小时内（例如 15、30、60、90、120 分钟）于接收腔中采集样本。- 将 IgY 溶液（所选药物或溶质）溶解于转运缓冲液中，配制成所需终浓度。所配制的药物溶液应多于实际所需量。
注意：水溶性较差的药物可先溶于有机溶剂（如乙醇、DMSO），再加入缓冲液。最终溶剂浓度应低于 1%，以免损伤细胞单层。 - 移除每孔供体腔（顶腔或基底外侧腔）中的缓冲液。
- 向所有供体腔中加入 IgY 溶液（药物溶液）。保留部分溶液作为时间点为 0 的供体溶液，用于测定初始药物浓度。
- 在指定时间点，从接收腔中取出 50 µL 样本并置于标记好的试管中。在最后一个时间点，从供体腔中取样。实验结束后，将供体和接收腔的样品 aliquot 转移至 -20 °C 冰箱保存。
注意：若需多个时间点，可更换接收腔中的缓冲液，但计算表观通透系数时需对此进行校正。实验结束时，接收腔中的浓度不应超过供体腔的 10%，以维持沉降条件44。
- 将 IgY 溶液（所选药物或溶质）溶解于转运缓冲液中，配制成所需终浓度。所配制的药物溶液应多于实际所需量。
- 类器官单层细胞的质量控制
注意：可在实验过程中使用 FITC-葡聚糖溶液确认单层细胞的完整性。FITC-葡聚糖作为单层完整性检测的示例，其他可用物质包括荧光素黄、PEG-4000、放射性标记的甘露醇和菊粉44。- 在 0 分钟时，吸除顶腔内容物，并为每组实验重复三次，加入 250 µL FITC-葡聚糖溶液（5 mg/mL，4 kDa）。
注意：避免将 FITC-葡聚糖暴露于光照下。 - 20 分钟后，移除基底外侧腔中的缓冲液。
- 使用荧光酶标仪测量基底外侧样本的荧光强度（使用标准曲线；激发波长设为 485 nm，发射波长为 528 nm）。
注意：FITC 的 Papp 也可根据讨论部分所述方法计算。 - 实验结束后，小心吸除顶腔和基底外侧腔中的多余缓冲液。
- 向顶腔加入 200 µL CMGF+，向基底外侧腔加入 700 µL CMGF+。
- 测量各小室的 TEER 值。
- 将培养板置于培养箱中（37 °C；5% CO2 气氛）培养 24 小时。
- 如适用，在 24 小时后再次测量 TEER 值，以评估实验质量控制阶段是否对单层细胞造成损伤。使用光学显微镜观察犬类器官单层细胞的完整性。
- 在 0 分钟时，吸除顶腔内容物，并为每组实验重复三次，加入 250 µL FITC-葡聚糖溶液（5 mg/mL，4 kDa）。
- 固定细胞单层用于后续分析
- 配制福尔马林-乙酸-酒精溶液（FAA，成分见 Table 1）。
- 使用 P1000 移液器或无菌一次性 9 英寸巴斯德吸管配合真空抽吸装置，移除顶腔和基底外侧腔中的转运缓冲液或 CMGF+。
- 向顶腔和基底腔中加入 FAA。
- 24 小时后，吸除 FAA 并替换为 70% 乙醇。
- 用可塑性实验室封膜包裹培养板以防止蒸发，并继续进行组织块制备。
图6：各实验组的TEER值。 在五组犬肠道类器官单层细胞中测量了TEER值。其中三组为犬空肠类肠体，两组为结肠类器官。每组包含12至22个重复样本。空肠类肠体培养物的TEER值显示从接种后第4天至第14天，结肠类器官培养物的TEER值显示从第4天至第12天（测量在类器官单层细胞达到稳态值时终止，表明单层细胞已具备实验使用条件）。误差条表示测量值的标准误（SEM）。缩写：TEER = 跨上皮电阻。 请点击此处查看该图的放大版本。
结果
犬类类器官培养的标准操作流程此前已有描述33，本特刊中也详细讨论了犬类类器官实验方案38。在可渗透支持物上培养的犬肠类器官经固定和石蜡包埋，用于观察单层结构的显微解剖特征及细胞组成。石蜡包埋过程此前已由Gabriel等38详细阐述。已进行常规染色（苏木精和伊红染色），并采用阿利新蓝染色法检测犬类类器官单层中的杯状细胞（见图7）。
图 7：犬类肠道类器官单层染色。 来源于结肠的犬类肠道类器官在可渗透支持膜上培养后，经石蜡包埋，并使用 H&E 和 AB 染色。代表性图像通过光学显微镜在 40x (A) 和 60x (B) 放大倍数下拍摄。H&E 染色显示为柱状上皮单层结构，在 60x 放大倍数下可观察到细胞顶端的微绒毛。AB 染色进一步揭示了犬类肠道类器官单层中杯状细胞（深蓝色）的存在。比例尺 = 20 µm (A)，50 µm (B)。缩写：H&E = 苏木精和伊红；AB = 阿利新蓝。 请点击此处查看该图的放大版本。
在可渗透支持物上培养的类器官需生长10至14天，方可进行通透性实验。应结合使用光学显微镜与跨上皮电阻（TEER）值测定，以确认类器官培养物是否已具备进行药物候选物通透性测试的条件。不同健康状态和患病犬只来源的犬肠类器官单层的代表性光学显微图像见图8。
图 8：犬肠道类器官单层显微镜图像。 在光学显微镜下观察到的生长中单层图像。来源于健康供体的类器官单层包括空肠类器官（10x；40x）和结肠类器官（20x；40x）培养物。来源于患病供体的类器官单层包括来自诊断为蛋白丢失性肠病（PLE）犬只的十二指肠类器官（5x；10x）和回肠类器官（5x；10x）。这两个PLE类器官培养物均为类器官接种过程中细胞分离不当的示例，由于存在三维类器官，这些培养物无法用于药物通透性测定。单层形成异常的其他示例包括因对生物样本操作不慎导致的单层撕裂（5x）。类器官长期培养（10x；20x）会导致类器官在插入物上维持过久，使其逐渐恢复原始的三维结构形态。作为对比，图中还展示了常用于药物通透性研究的可渗透支持物上的传统二维细胞系图像（MDCK-10x；40x，以及Caco-2-10x；20x）。缩写：PLE = protein-losing enteropathy（蛋白丢失性肠病）；MDCK = Madin-Darby canine kidney（Madin-Darby犬肾细胞）。比例尺 = 500 µm（5x），200 µm（10x），100 µm（20x），50 µm（40x）。 请点击此处查看该图的放大版本。
类器官单层也用含3%多聚甲醛和3%戊二醛的磷酸盐缓冲液（PBS）固定。采用透射电子显微镜（TEM）对生长在可渗透支持膜上的类器官培养物的超微结构进行表征。微绒毛和紧密连接的微解剖结构如 图9所示。
图9：健康犬类肠类器官单层细胞的透射电镜（TEM）图像。 采用透射电镜观察空肠（A）、回肠（B）和结肠（C）类器官单层细胞的细胞微结构。可渗透支持插件的微孔膜以黄色箭头标示。图像中清晰显示了微绒毛（蓝色箭头）和紧密连接（红色箭头）的结构。缩写：TEM = 透射电镜（Transmission electron microscopy）。比例尺 = 5 µm（A），2 µm（B, C）。 请点击此处查看该图的高清版本。
应同时进行TEER测量和光学显微镜检查，以确保系统已准备好进行通透性检测。当TEER达到稳定状态时，表明检测系统已准备就绪，而光学显微镜检查有助于排除类器官的损伤或过度生长。图6展示了五组犬空肠肠类器官和结肠类器官典型的TEER测量结果汇总。
表1：类器官培养基和FAA的组成。 本表总结了CMGF+、CMGF+ R/G和FAA的完整成分。缩写：ROCK = Rho相关激酶；GSKiβ = 糖原合酶激酶β；CMGF + R/G = 含生长因子的完全培养基，并添加ROCK抑制剂和GSKiβ；CMGF+ = 含生长因子的完全培养基，但不含ROCK抑制剂或GSKiβ；FAA = 甲醛-乙酸-酒精；EGF = 表皮生长因子。本表改编自38。请点击此处下载该表格。
补充表1：犬类类器官在可渗透支持系统中记录笔记的表格。 缩写：TEER = 跨上皮电阻；ROCK = Rho相关激酶；GSKiβ = 糖原合成酶激酶β；CMGF + R/G = 含生长因子的完全培养基，添加ROCK抑制剂和GSKiβ；CMGF+ = 含生长因子的完全培养基，但不含ROCK抑制剂或GSKiβ。请点击此处下载该表格。
讨论
犬类肠道类器官培养在可渗透支持装置中的应用是一种独特概念，将传统药物渗透性测定方法连接起来40 一种新型的 体外 犬模型41不同类型的犬肠道类器官可根据实验目的进行选择和评估，仅需极少调整。建议每组使用3-4个孔测试目标药物的多个浓度。药物浓度可依据其在肠道中的预期浓度确定。此外，参考既往研究有助于确定实验设计中的合适时间点。应妥善记录实验设计，以提高可重复性并便于故障排查。
该技术确实存在一些局限性，这源于该方法的新颖性42，这主要是由于各实验室在实验设计和方案执行方面缺乏标准化。其他研究团队也已承认这种缺乏标准化的问题43，犬类三维类器官单层培养方案将促进实验室间的可重复性，并为该系统引入标准化。对数据分析采用标准化方法可提高结果的可重复性，并加强在不同实验室中利用犬类类器官在可渗透支持物系统中进行初步药物测试的结果可靠性。犬类三维类器官模型目前仍缺乏对不同数据集进行比较的研究 体外 P应用程序 模型药物的值与其已知的人类或犬类值 体内 肠道吸收，与Caco-2细胞相似44,45,46一旦获得此类数据，该犬类类器官模型便可用于药物开发过程中肠道通透性的评估。
在将类器官接种到可渗透支持系统时，必须注意接种足够密度的适当解离细胞。当形成严格单层时，系统的跨上皮电阻（TEER）值更可靠且可重复。单层细胞长期培养可能导致TEER值呈指数增长，偏离肠道生理范围。此类三维结构的苏木精-伊红（H&E）切片显示，细胞在膜附近多层堆叠，肠上皮细胞结构也发生改变。
在成功扩增犬肠道类器官单层后，可通过计算药物的表观渗透系数（Papp）公式来分析结果，方法与传统的二维细胞实验相同44。Papp值（见公式（2））描述了物质穿过细胞单层的转运速率47。
（2）
该
是浓度随时间变化曲线的初始斜率（例如，nmol/s）。A 为插入膜的面积（cm2），C0 为供体室中药物或化合物的初始浓度37。单层完整性可靠识别是通透性测定中需要标准化的关键环节。建议采用光学显微镜和跨上皮电阻（TEER）测量来评估可渗透支持系统中的犬类类器官，并帮助确定实验的合适时机。此外，可使用零分子通透性标记物（例如，FITC-葡聚糖、Lucifer yellow、PEG-400）对类器官单层完整性进行功能性评价。若被测化合物受转运体影响，则需特别注意。P-糖蛋白（P-gp）是常见的外排泵示例。必须计算外排比值（Papp,BL-AP/Papp,AP-BL），并与已知的P-gp探针底物进行比较。
光学显微镜（普通显微镜或相差显微镜）是一种用于评估二维或三维单层细胞及滤膜插件完整性的宝贵方法，同时可检测是否存在细胞过度生长。图7可作为识别健康犬肠道类器官细胞培养状态的参考。跨上皮电阻（TEER）值是评估类器官培养物形成细胞间连接并分化为完整肠上皮的重要指标。犬肠道类器官可分化为肠上皮细胞和杯状细胞（图6）。这些产黏液细胞使得研究药物与黏液的相互作用成为可能，而此类研究在传统二维细胞培养中难以实现48。Chandra 等人已通过先前研究证实犬肠道类器官中存在肠内分泌细胞33。
提供了利用透射电子显微镜（TEM）对源自空肠、回肠和结肠类器官的犬类类器官单层细胞进一步表征的结果。TEM图像展示了细胞的微观结构，包括紧密连接和微绒毛的形成，进一步说明了这些类器官模型在转化医学中的复杂性与应用价值。根据实验结果，接种后第11至第13天，生长在通透性支持膜上的类器官培养物已准备好用于实验（图9）。此时的跨上皮电阻（TEER）值介于1,500至2,500 Ω·cm2之间。TEER值的平台期持续时间非常短暂，实验必须在此值开始缓慢下降之前启动。TEER值本身也可作为展示重要实验结果的关键指标，因为某些药物或药物辅料可能与单层细胞（例如紧密连接）发生相互作用，从而显著影响TEER读数。这一指标本身即可作为实验数据使用。
由于形成的细胞单层具有独特的结构，犬类肠道类器官在双室细胞培养装置中的应用不仅限于口服药物渗透性研究。例如，它们还可用于微生物学研究（如肠道微生物群变化的影响）、病毒摄取研究、药物-药物相互作用以及药物转运机制49。通常将待测药物或化合物加入供体室，于不同时间点从接收室中取样。这些样品可通过高效液相色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法或其他技术进行分析，以确定溶质透过单层细胞的量和速度。
这些研究需要完整的单层细胞，以准确评估药物的通透性。通常需要培养超出实际需求的单层细胞数量，以弥补无法使用的孔。类器官细胞单层也可用于检测病毒从单层细胞的顶侧或基底侧的摄取，检测方法包括免疫荧光分析——利用抗体检测病毒的细胞摄取情况。最后，可在供体室中同时施加多种药物（即底物和抑制剂），以鉴定基于转运体的药物-药物相互作用。
根据目前的观察结果，这些方法不仅适用于培养插件中的犬类类器官，经过少量调整后也可适用于其他兽医物种和器官系统，以更好地适应特定物种或目标器官模型。犬肠道类器官的培养方案需根据培养体系的独特性质进行调整。因此，该方案可针对其他物种进行优化，但需要对方案进行细微修改。修改可能从调整细胞接种密度开始，并扩展至培养基成分的改变，以适当地诱导目标类器官的分化。
标准化实验操作流程、详细记录实验步骤以及对细胞单层进行持续监测，是可渗透支持物实验中至关重要的实践要求，不仅限于犬类体系。不同物种或器官的潜在差异必须加以详细记录和报告，以推动该领域的进一步发展。该模型存在若干局限性，例如成本较高、不同实验室之间的变异性较大，以及在预测肠道吸收能力方面的数据仍然有限。 体内在某些情况下，犬类具有与人类不同的药物转运蛋白和代谢酶50.
此外，还需要在其他厂商生产的多种双室装置上测试犬类类器官系统，以确定该模型的适用性（例如，需确定不同滤膜成分的适用性）。另一个缺点是，论文中药物通透性实验部分的描述不如之前的部分内容详细。这是由于该领域信息过于丰富所致。该部分的目标是以可修改的方式描述这些方法，同时不遗漏这些实验中关键的基本要点。有关通透性实验的更详细信息可参考Hubatsch等人37的收集整理。此外，可渗透性插入物还可用于共培养、细胞迁移和侵袭实验4。
总之，双室培养装置中的犬肠道类器官具有广泛的应用潜力，包括生物医学领域和转化医学等。这些实验方案提供了多种策略，可用于设计实验，并促进生物学领域内类器官模型在不同实验室之间的数据可靠性。
披露
K. Allenspach 是 LifEngine Animal Health 和 3D Health Solutions 的联合创始人。她担任 Ceva Animal Health、Bioiberica、LifeDiagnostics、Antech Diagnostics、Deerland Probiotics 和 Mars 的顾问。J.P. Mochel 是 LifEngine Animal Health 和 3D Health Solutions 的联合创始人，并担任 Ceva Animal Health 和 Ethos Animal Health 的顾问。本文反映作者观点，不应被理解为代表美国食品药品监督管理局（FDA）的认可、观点或政策。其他作者均无任何利益冲突需要声明。
致谢
我们谨向爱荷华州立大学兽医诊断实验室的员工表示感谢，特别是 Haley Lambert、Emily Rahe、Rosalyn Branaman、Victoria Green 和 Jennifer Groeltz-Thrush，感谢他们及时处理样本。我们还要感谢 Jodi Smith 和 Bethann Valentine 为通透性实验提供了材料。同时，我们感谢 David Diaz-Reganon 在图9绘制过程中提供的帮助。除图6外，所有图均使用 BioRender.com 制作。作者谨此致谢来自爱荷华州立大学教员启动基金、ISU VPR Miller 奖项、ISU VPR Miller 奖项以及 NSF SBIR 拨款给爱荷华州立大学的子项目（编号 #1912948）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 类器官培养基 | |||
| ROCK 抑制剂 (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-胃泌素 I 人源 | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| 高级 DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 谷氨酰胺替代物 |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| 人源 R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| 小鼠 EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| 小鼠 Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| 小鼠 Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A9165-25G | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 抑制剂) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (硫酸甲氧苄啶) | Sigma | T7883-5G | |
| 试剂 | |||
| 冰醋酸 | Fisher Chemical | A38-500 | |
| α-D(+)-葡萄糖，99+%，无水 | Acros Organics | 170080010 | |
| 细胞回收溶液 | Corning | 354253 | |
| 胶原蛋白 I，大鼠尾，3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-葡聚糖 | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| 甲醛 (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| 戊二醛溶液 | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| 用于类器官培养的 Matrigel 基质 | Corning | 356255 | 细胞外基质 |
| 对苯二甲醛，97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (磷酸盐缓冲液) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | 类胰蛋白酶蛋白酶 |
| 材料与设备 | |||
| 15 mL 离心管 | Corning | 430766 | |
| 9" 巴斯德吸管 | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm 聚酯膜插件（预装于 24 孔培养板中），孔径：0.4 µm，无菌 | Corning | 3470 | 可渗透支持物 |
| Millicell ERS（探针） | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 伏特计 | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic 培养箱 | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M 封口膜 | Bemis Company Inc | PM996/EMD | 柔性实验室薄膜 |
| 24 孔组织培养板 | Fisherbrand | FB012929 |
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