诱导珊瑚群落息肉获救，获得个体化微繁殖物，用于实验室实验用途

巩膜珊瑚或造礁珊瑚是能够形成碳酸盐骨架，形成珊瑚礁和结构复杂的生态系统的桔梗，可以从深水到浅水环境中找到¹。热带珊瑚礁拥有高度的生物多样性，并提供基本的生态系统服务，如海岸保护和渔业维护².大多数浅水造礁珊瑚依赖于与 共生藻科的藻类的互惠关系，共生藻类提供了珊瑚构建骨骼所需的能量。珊瑚和藻类之间的共生关系可以被环境压力破坏，导致珊瑚白化^{3，4，5，6}。最近的温度异常导致世界各地的珊瑚白化事件，导致大规模珊瑚死亡和永久珊瑚礁退化^{7，8，9，10，11}。由于这种现象是基于热应激后相关细胞机制（如细胞凋亡，自噬和胞吐作用）排出共生体，因此珊瑚白化可以被描述为具有生态系统规模后果^5，6，12的细胞过程，这意味着珊瑚细胞或组织的 体外 培养将适用于密切研究这种现象。

由于珊瑚礁的重要性及其面临的主要威胁，特别是在过去二十年中²，珊瑚已成为全球保护和恢复目的的研究重点¹³.然而，开发可靠，可重复且对环境影响最小的方法和实验系统来研究珊瑚是该领域的主要斗争。

微繁殖被定义为通过在受控容器中培养其生物材料来体 外 增殖生物体的基因型^14，15。近几十年来，细胞、组织和器官的培养对植物和动物生物学至关重要。它允许在实验室中大规模繁殖生物体，快速评估不同的治疗方法（如药物和药物），并直接研究细胞功能^{14，15，16，17}。一般而言， 体外 模型对于在更好地控制的物理和化学条件下补充和深化不同生物体的研究是有用的。由于 体外 培养技术的优势，不同的动物细胞和组织培养技术已被开发，优化并用作许多研究领域的重要工具，其中多种细胞系已被研究和商业化用于众多应用^16，17，18。

自1882年第一次动物组织培养以来，细胞和组织培养的知识已经取得了许多进步¹⁷， 例如使用天然和合成培养基， 已建立的细胞系的发明， 以及开发 3D 培养基以更好的方式培养多种细胞类型^{16，17，18，19}.然而，细胞生物学领域主要集中在一组选定的模式生物上，而许多分类群仍然没有完善的细胞，组织或器官²⁰的体外培养物。例如，在珊瑚研究中，没有永生化的细胞系被广泛用于研究，从而限制了珊瑚细胞研究使用原代细胞培养物。这些培养物的生存能力仅限于²¹周，没有研究记录所有珊瑚组织中单个细胞的存活时间超过13天，直到2021年初²²。将要发表的第一份可持续珊瑚细胞系的报告是具有长达6个月的Acropora tenuis细胞，这些细胞对未来研究的效用仍有待探索²³.

为了克服培养珊瑚细胞培养物的局限性并保持保留珊瑚整体组织组织的实验室培养，最近提出了使用分离的息肉作为珊瑚生物学研究的模型^24，25。息肉是珊瑚的解剖学单位，它们中的每一个都有一个位于口腔圆盘中心的嘴，并通过其腹侧区域的coenosarc连接到其他息肉²⁶。活息肉的分离通过息肉纾困过程自然发生，其中急性应激导致息肉之间腹肉的消化，然后可以从蜂群的骨骼中分离^25，27，28。据报道，这种现象发生在多种分类群中，包括八角藻^29，30，³¹，黑珊瑚³²和巩刹纪珊瑚^{25，27，28，32，33}，并且已经与多种环境压力源有关，例如水中缺钙^24，34，酸度增加³⁵，高渗条件^{25，27，32，36}，高温^36，37，饥饿³³，空气暴露^25，30和杀虫剂污染^28，38。例如，息肉救助在斑秃珊瑚¹⁹中已有报道，这些珊瑚广泛分布在世界各地，通常用作珊瑚研究的模型。属于该组的物种，如达米角虫和西葫芦，从5^毫米的25个碎片中产生了大约30-40个微繁殖体。这个数字强调了使用息肉救助作为珊瑚微繁殖方法的优势，因为它创造了从一小块珊瑚中产生许多遗传上相同的个体的可能性。使用分离的息肉进行研究也具有与细胞培养相同的优势，即在受控的实验室环境中培养的可能性，例如烧瓶和培养皿。此外，维持活息肉的微流体平台已经证明，这些微繁殖体可以保持在相对便宜且易于繁殖的环境中，水流，表面和温度受控^24，25。这些微流体平台也可用于在显微镜下直接可视化活珊瑚结构^24，25。

在本文中，我们总结并演示了已经开发的从其殖民地分离单个珊瑚虫的技术，展示了如何在实验室条件下维持它们以进行长期培养。所讨论的方法包括通过蒸发和泵送高盐度海水的高渗条件以及在无钙海水中孵育来拯救息肉。

在本研究中，SCUBA通过使用锤子和凿子潜水，从Al Fahal礁（22.305118 N; 38.964568 E）中收集了属于疣 状栉珊 瑚物种的殖民地。该殖民地的属在形态学上被鉴定出来，其物种根据先前发表的工作被归类为 疣状芽孢杆菌 ，包括来自红海的 Pocillopora ，表明从遗传学的角度来看，该区域存在的物种是疣 状芽孢杆菌^39，40。法哈尔礁不是受保护的环境区域的一部分，收集珊瑚不需要特别许可证。该殖民地在300升的水族箱中保存了一个月，然后被分割并"救出"息肉。水族箱保持在26°C，有两个水族箱加热器，三个泵和两个光源（见 材料表），保持12小时的光周期。通过将两个加热器中的每一个连接到温度控制器来维持水族箱的温度。光发射被编程为从早上6点开始，在下午6点结束，产生一个辐照度曲线，该曲线在下午12点达到峰值，光子为230μmol m⁻²s⁻¹。

1. 水蒸发后高盐度的息肉救助

注:此方法改编自夏皮罗等人²⁵。如果使用与 疣状孢子虫不同的物种，则在确定要切割的碎片的大小之前，应考虑息肉的大小。

1. 使用对角切割钳从珊瑚群落中切割小碎片（长度小于1厘米）（参见 材料表）。
   注意:根据所使用的珊瑚种类调整切割工具。对角钳可用于切割具有细枝的珊瑚。在目前的研究中，每次处理都切出一个片段，但片段的数量和大小可以根据所需的息肉数量而变化。切割碎片的大小不得超过蒸发后水的深度，因此珊瑚在过程完成后完全留在水中。
2. 将切碎的碎片放入装有12 mL海水的小培养皿中，珊瑚群已经适应了这些海水。这可以是人工海水（见 材料表）或过滤后的海水，其盐度与珊瑚群落在破碎前的盐度相同。
   注意:用水完全覆盖碎片非常重要。如果培养皿中的12 mL不足以覆盖切割的片段，请相应地优化容器和体积。在本研究中，所利用的水是从红海收集的，其盐度为40 PSU，由多参数计测量（见 材料表）。
3. 将板在环境温度下打开约24小时，以便水可以蒸发，其盐度可以逐渐增加。当息肉之间可以观察到组织消化时，继续执行步骤1.4。
   注意:孵育时间过后，水的盐度必须比开始时高出约40%，并且息肉需要准备好从骨架上分离。
4. 使用1 mL转移移液管，在靠近珊瑚组织的地方产生温和的流动。这种流动将慢慢地帮助息肉的完全脱离，息肉已经从骨骼中消化了它们周围的组织。
   注意:当使用移液器产生水流时，单独的息肉或息肉组必须以薄片的形式从骨架上脱落。如果浑浊的物质脱落，则表明组织死亡或分解，这意味着珊瑚的孵育时间过长或压力太大（在这种情况下，盐度高）。使水的温和流动以分离息肉非常重要，因为更强的流动可能会对它们造成物理损伤。
5. 使用移液管将培养皿中的水与等烟水（使用与步骤1.2中相同的水）缓慢交换。在10分钟内进行50%的水交换足以使息肉适应无压力的盐度条件。
   注:由于 使用了来自红 海的疣状栉水母的珊瑚群落，因此进行了测试以确定来自这种独特环境的珊瑚将在哪些特定条件下获救。与大多数其他珊瑚礁环境相比，重要的是要强调红海的高盐度。

2. 高盐度海水供应的息肉救助

注:该方法改编自庄某等人²⁷。

1. 通过在海水中加入NaCl来制备3L高盐度海水，直到盐度增加85%，由盐度探头测量。
   注:在目前的研究中，从红海的40个PSU海水中制备了74 PSU高盐度海水。
2. 按照步骤1.1中所述切割小块珊瑚。
3. 将切割的碎片放入一个10 L的容器中，该容器装有3 L等渗海水（在这种情况下，对于珊瑚具有无压力盐度的海水，与步骤1.2中使用的相同），连接到蠕动泵（参见 材料表）。
   注意:为了更好地维护珊瑚的健康，可以添加温度控制器，空气泵和灯来模拟与殖民地以前暴露的相同水族箱条件。在当前工作的孵育期间，珊瑚碎片在26°C的容器中，每天光照周期为12小时。水的运动和温度的均匀性由空气泵保持。
4. 使用蠕动泵以126 mL / h的速度将含有珊瑚碎片的容器与步骤2.1中制备的高盐度海水填充24小时。加入总共3升水，盐度增加约40%。
   注意:只需将NaCl添加到海水中直到达到预期的盐度即可生产高盐度水。
5. 用移液管产生温和的水流，从骨架中释放息肉（步骤1.4.）。
6. 慢慢地将含有息肉的水交换为等渗水（步骤1.5）。接下来，继续执行步骤 4 或步骤 5。

3. 无钙海水孵化纾息息肉

注:该方法改编自Pang等人²⁴。

1. 通过在1L去离子水中加入26.29克NaCl，0.872克KCl，2.16克MgSO₄，11.94克MgCl₂，3.42克Na₂SO₄和0.286克NaHCO₃ （见 材料表），制备无钙人造海水（CaFSW）溶液。
   注意:该解决方案从以前的协议进行了调整，以更适合适应盐度为40 PSU的珊瑚。对于适应其他盐度条件的珊瑚，使用相同比例的盐，但调整溶质的总质量以获得更适合使用中的珊瑚的盐度。
2. 按照步骤1.1中所述切割小块珊瑚。
3. 将珊瑚碎片浸没在装满先前制备的CaFSW的培养皿中（步骤3.1），并以80 rpm的转速将它们孵育在轨道培养箱中3小时。
   注意:同样，用水完全覆盖碎片很重要。如果培养皿不足以覆盖碎片，请根据实验需要优化容器和体积。
4. 将片段转移到培养皿或6孔板中，其中装有20%Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）和100mg / mL氨苄西林溶液（参见 材料表），用40 PSU人造海水制备。在26°C和80rpm下孵育片段，每天交换培养基，直到息肉之间观察到组织消化并且单个息肉开始从骨架上分离。
   注意:在大多数情况下，组织消化在该培养基中孵育的20小时内完成，并且不需要交换。
5. 将息肉转移到灭菌的海水中，使用移液管进行初始回收。孵育1小时后，继续执行步骤4或步骤5。

4. 培养皿中的息肉维护

1. 一旦息肉返回具有非应力盐度的过滤海水中，通过观察组织完整性和由立体显微镜下的睫状流动引起的运动来选择可行的息肉。
2. 将选定的息肉放入玻璃或塑料培养皿中，并用浮游生物网（200μm网状尺寸，参见 材料表）覆盖培养皿，以使息肉不会漂浮在培养皿上。
   注意:网状网的大小可以根据息肉的大小而变化。重要的是要注意，网必须具有比息肉小的孔隙，并允许水交换和光穿透。
3. 将培养皿放在水族箱中，为所使用的珊瑚物种提供适当的条件。
   注:在本研究中，条件是40 PSU过滤海水在26°C和12小时的光循环。
4. 每周至少打开一次培养皿，以更新水并清洁培养皿。此步骤对于消除藻类过度生长非常重要，藻类过度生长可以通过局部释放有毒化合物来与珊瑚虫竞争或破坏珊瑚虫。

5. 培养箱中的息肉维护

1. 选择可行的息肉，如步骤4.1中所述。
2. 使用转移移液管将息肉放入75 cm² 表面细胞瓶中，该烧瓶中装有50 mL等渗海水。
   注:在目前的工作中，从红海收集的过滤海水用于息肉维护。可以使用与步骤1.2中使用的水具有相同特性的水。
3. 关闭烧瓶并将其移至培养箱中。将培养箱设置为26°C和40rpm下12小时光照循环。每4天交换50%的水量，当/如果墙壁上充满藻类或生物膜时，将内容物转移到干净的烧瓶中。
   注:图像是使用配备高清摄像头的全复消色差变焦系统拍摄的（参见 材料表），以获得具有代表性的结果。

通过三种不同的方法，在属于疣螈属物种的单一殖民地的珊瑚碎片中诱导息肉救助（图1）。在培养皿中浸泡珊瑚碎片24小时后，水蒸发后高盐度诱导的脱脱在培养皿中，最初在40 PSU下充满水，然后在过程结束后达到59 PSU的最终盐度（图2A-C，I）。在最初在40 PSU的水中孵育24小时后，盐水供应也达到了救助，该水在12小时后达到52 PSU的盐度，在过程结束时达到59 PSU，24小时后（图2D-F，I）。在这两个实验中，盐度的增加是息肉诱导组织消化的原因。12 h后，高盐度条件导致息肉收缩，同时辅酶肉逐渐变薄，最终导致息肉在24 h后最终脱离。在CaFSW中孵育3h后，然后在20%DMEM培养基中孵育20h后，通过无钙海水孵育的救助诱导完成（图2G-H）。用移液管将其推开后，在所有三种方法中将组织从骨架上分离出来，直到产生个体化的珊瑚息肉（图3A-C）和"组织球"。

分离后，收集所有三种方法的息肉并使其在海水中恢复，然后分配到覆盖有网或细胞瓶的培养皿中。从蒸发和供水方法中获得的息肉在水族箱内的培养皿中保持，并分别存活6周和8周（图3D 和 图3F）。这些微繁殖体保留了息肉的通常解剖结构，呈现触手，基底盘和口腔1。通过在无钙海水中孵育获得的息肉寿命短，存活长达1天，之后其组织解离。从海水蒸发方法获得的息肉保存在培养箱内的细胞培养瓶中，存活长达3周，而不会使组织解离（图3F）。在所有情况下，即使息肉不能附着在基质上，它们也是视觉健康的并保持其颜色，虫黄藻细胞在其组织内仍然可见1。

图1:三种不同测试的息肉救助诱导方法的示意图（左图），然后是在实验室条件下维持获得性息肉的两种方法的图示（右） （A）通过水蒸发来拯救息肉的方法的表示。（B） 通过高盐度海水供应拯救息肉的方法的表述。（C） 无钙海水孵化蚌除息肉的方法说明。 请点击此处查看此图的大图。

图2:使用珊瑚物种疣螈的碎片，通过三种不同的方法诱导息肉救助过程的图像。 （自动对照）分别在培养皿中使用水蒸发法在培养皿中孵育后0h，12h和24h的珊瑚碎片。（D-F）珊瑚碎片分别在孵育后0 h、12 h和24 h，采用高盐度海水供应法。（G，H）珊瑚碎片分别暴露于无钙海水孵育方法之前和之后。（I）在无钙人工海水中孵育3 h，在20%DMEM中孵育21 h.（I）在水蒸发过程中海水PSU中盐度值的图形表示和高盐度海水供应救助诱导方法。请点击此处查看此图的大图。

图3:从三个演示的救助诱导程序中获得的疣状疱疹息肉的图像（A-C）分别从蒸发，盐水供应和无钙海水方法获得的息肉的图像在从骨骼上分离后立即捕获。（D）在培养皿中存活6周后从蒸发方法获得的珊瑚息肉的图像。（E）在培养皿中存活8周后从盐水供应方法获得的珊瑚息肉的图像。（F）在细胞培养瓶中存活3周后从蒸发方法获得的珊瑚息肉的图像。请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。