Summary
철(Fe) 생체이용률에 대한 Caco-2 세포 생물학적 분석은 식품, 식품, 보충제, 식사 및 식이 요법에서 Fe 생체 이용률을 평가하는 비용 효율적이고 다양한 접근 방식을 나타냅니다. 인간 연구에 대해 철저하게 검증된, Fe 생체이용률의 연구를 위한 최첨단 기술을 나타낸다.
Abstract
Fe 생체 이용률에 대한 지식은 식품에서 Fe의 영양 품질을 평가하는 데 중요합니다. Fe 생체이용률의 생체내 측정은 비용, 처리량 및 Fe 식품의 동위원소 표지에 내 재된 주의 사항에 의해 제한된다. 따라서 처리량이 높고 비용 효율적인 접근 방식이 매우 필요합니다. Caco-2 세포 생물학적 분석은 이러한 요구를 충족시키기 위해 개발되었습니다. Fe 생체 이용률에 대한 Caco-2 세포 생물학적 분석은 Caco-2로 알려진 인간 장 상피 세포주의 배양과 결합 된 시뮬레이션 된 위 및 장 소화를 활용합니다. Caco-2 세포에서 Fe 흡수는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)으로 쉽게 측정 할 수있는 Fe 저장 단백질 인 페리틴의 세포 내 형성을 자극합니다. 페리틴은 Fe 흡수에 비례하여 형성됩니다. 따라서 Caco-2 세포 페리틴 생산을 측정함으로써 모의 식품 소화물에서 장 세포로의 장내 Fe 흡수를 평가할 수 있습니다.
이 접근법을 통해 모델은 식품 Fe 생체 이용률을 결정하는 주요 초기 단계를 복제합니다. 1998 년에 시작된 이래로이 모델 접근법은 인간 Fe 생체 이용률에 영향을 미치는 것으로 알려진 요인과 엄격하게 비교되었습니다. 또한, Fe 생물 강화 작물을 평가하는 3 가지 인간 효능 연구와 함께 병렬 연구에 적용되었습니다. 모든 경우에, 생물학적 분석은 인자, 작물 및 전반적인 식단으로부터 Fe 생체 이용률의 상대적 양을 정확하게 예측했다. 이 논문은 Fe 생체 이용률에 대한 Caco-2 세포 생물학적 분석을 수행하는 데 필요한 시험관 내 소화 과정 및 세포 페리틴 ELISA와 결합 된 Caco-2 세포 배양에 대한 자세한 방법을 제공합니다.
Introduction
Fe 생체 이용률에 대한 Caco-2 세포 생물학적 분석의 연구 필요성과 이점을 완전히 이해하려면 먼저이 모델이 출현하기 전에 있었던 접근 방식을 이해해야합니다. 생체 내에서 식품 또는 식사에서 Fe 생체 이용률을 측정하는 것은 특히 식사 또는 식단에서 식품 조합을 평가해야 하는 경우 어려운 작업입니다. 동위원소 표지는 지난 50년 동안 Fe 생체이용률의 측정을 위한 가장 일반적인 접근법이었다1. 동위원소 표지는 단일 식사 및 다중 식사 연구에 사용되며 장기 연구에는 비실용적입니다. 57Fe및 58Fe와 같은 Fe의 안정한 동위 원소가 가장 일반적으로 사용됩니다. 그러나 전신 계수2를 사용하여 59Fe와 같은 방사성 동위 원소에 대한 연구가 수행되었습니다. 식물성 식품의 경우 동위원소 라벨링은 외부 또는 고유 라벨링을 통해 수행되었습니다. 외인성 표지의 경우, 알려진 양의 동위 원소가 식품 또는 식사에 첨가됩니다. 그런 다음 음식을 혼합하고 소비 전에 15-30 분의 평형 기간을 프로토콜에 통합합니다. 수경 재배 배양 (동위 원소를 영양 용액에 첨가하여 식물이 성장하고 발달하는 동안 식물에 통합하는 것)은 식물성 식품의 고유 라벨링에 필요합니다. 각 접근 방식의 장단점은 아래에서 설명합니다.
외인성 동위원소 표지
1970 년대 초중반에 인간 Fe 흡수는 식품에서 Fe의 외적 표지에 의해 연구되었으며, 여기서 알려진 양의 동위 원소는 식품 또는 식사에서 알려진 양의 Fe에 첨가되고, 혼합 및 측정 전에 15-30 분 동안 평형화된다. 다양한 양의 외인성 동위 원소가 사용되었으며, 고유 Fe의 1 %에서 100 %에 이르지만 가장 일반적으로 7 % -30 % 3 범위입니다. 외인성 표지는 외인성 Fe 동위원소가 식품 또는 식사의 고유 Fe와 완전히 평형을 이룬다는 가정을 기반으로 합니다. 그런 다음 외인성 동위원소 흡수를 측정하고 외인성 동위원소의 각 원자를 계산하여 주어진 수의 고유 Fe 원자를 나타냅니다. 이 계산은 상대 몰량을 기반으로합니다. 1983 년에이 기술에 대한 여러 검증 연구가 리뷰 논문4에 요약되었습니다. 이 기술의 검증은 외인성 동위원소 표지의 흡수율을 내인성 동위원소 표지의 흡수율과 동시에 비교하여 수행되었습니다. 따라서, 1에 가까운 외인성 흡수 대 내인성 흡수의 비율은 Fe의 각 풀이 균등하게 흡수되었음을 시사한다. 당시에는 1에 가까운 비율이 외적 동위 원소와 식품 또는 식사의 고유 Fe의 평형을 나타내는 것으로 간주되었습니다. 외인성 Fe 흡수율과 내인성 Fe 흡수의 비율은 평균값 0.40에서 1.62 사이였으며 평균 (±SD) 비율은 63 번의 비교에서 1.08 ± 0.14였습니다. 이 검토에 요약 된 모든 연구에서 외적 라벨과 고유 Fe의 평형을 직접 테스트 한 연구는 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 요약하면, 리뷰의 저자는 다음과 같은 결론을 내렸다.
"외인성 태그 기술은 특정 실험 조건에서 여러 식품에 유효한 것으로 입증되었습니다. 그러나이 방법은 아직 모든 유형의 식품과 관련하여 입증 된 것으로 간주 될 수 없습니다. 외인성 태그 방법은 불용성 형태의 철분을 함유한 식단에서 철분 흡수를 모니터링하는 데 적합하지 않습니다. 이 기술의 타당성은 외인성 태그가 모든 내인성 비헴 식품 철분과 완전히 교환된다는 기본 가정에 의존합니다. 현재 다양한 형태의 비헴철이 외부 태그로 얼마나 완벽하게 표시되어 있는지는 알려져 있지 않습니다. 이것은 철 억제제가 식품의 일부 형태의 비헴철과 다르게 외인성 태그에 영향을 미칠 수 있다고 제안한 연구에 비추어 볼 때 중요합니다. 완전한 동위원소 교환을 손상시킬 수 있는 식품 요인에 대한 연구는 부족합니다. 따라서 외인성 태그 연구의 생체 이용률 데이터를 해석하려면 식품이나 식단에 존재할 수있는 교환 억제제를 고려해야합니다."
1983 년 이래로 Fe 3,5의 외적 표지의 정확성을 평가 한 두 가지 연구 만 발표되었습니다. 이 두 연구에서 외인성 동위 원소 라벨의 평형은 식품의 고유 Fe와 직접 비교되었으며,이 연구에서 주요 식량 작물이었습니다. 흰색, 빨간색 및 검은 콩 품종이 렌즈 콩 및 옥수수와 함께 테스트되었습니다. 확립 된 체외 소화 기술과 Fe 용해도 및 침전의 측정을 사용하여, 두 연구 모두 외인성 동위 원소 표지가 일관되게 완전한 평형을 초래하지 않는다는 것을 입증했으며, 일부 콩 품종의 경우 외인 동위 원소 및 종자 코트 색상의 양에 따라 불균형이 매우 높을 수 있다는 증거3. 1983년 리뷰 논문의 결론에도 불구하고 콩에 대한 외인성 라벨링 연구는 6,7,8,9,10,11,12를 계속했습니다. 이 연구 중 어느 것도 외적 라벨과 고유 Fe의 평형을 테스트하는 것을 포함하지 않았습니다.
본질 라벨링
Fe 생체 이용률 평가를위한 식물성 식품의 고유 라벨링은 외적 라벨링의 평형화의 정확성 문제를 제거합니다. 그러나이 접근법은 수경 재배를위한 온실 공간이 필요하기 때문에 많은 양의 물질을 생산할 수 없습니다. 수경 재배는 노동 집약적이며 고가의 안정 동위 원소를 많이 필요로하며 종종 수확량 및 종자 Fe 농도 측면에서 다른 식물 성장을 초래합니다. 비용 때문에 고유 라벨링은 Fe 흡수의 기본 메커니즘 또는 식품의 Fe 흡수에 영향을 미치는 요인을 이해하기위한 소규모 연구에만 적합합니다. 1-2kg의 주식 작물 생산은 동위 원소 및 수경 접근법 20,000에 따라 재료만으로 약 $ 30,000- $13,14입니다.
동위원소 표지와 관련된 문제를 감안할 때 연구자들은 시험관 내 접근 방식을 개발하려고 했습니다. 초기 방법은 생체 이용률15의 추정치로서 Fe 용해도 또는 Fe 투석성의 측정과 결합 된 시뮬레이션 된 위 및 장 음식을 활용했습니다. 이러한 연구는 Fe가 용해되고 화합물에 단단히 결합되어 교환되지 않아 생체 이용률을 과대 평가할 수 있기 때문에 Fe 투석성이 생체 이용률의 일관된 척도가 아니라는 것을 빠르게 발견했습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 인간 장 세포주를 활용하는 방법론이 발전하여 살아있는 구성 요소를 추가하고 Fe 흡수16을 측정 할 수있게되었습니다. 인간 장 세포인 Caco-2 세포는 인간 결장암에서 유래했으며 영양소 섭취 연구에 널리 사용되었습니다. 이 세포주는 배양에서 세포가 소장의 브러시 경계 세포와 유사하게 기능하는 장 세포로 분화하기 때문에 유용합니다. 연구에 따르면 Caco-2 세포는 Fe 흡수에 영향을 미치는 인자에 대한 적절한 수송 체와 반응을 나타냅니다17,18.
Caco-2 세포에서 Fe 흡수를 측정하기 위해 방사성 동위 원소를 사용하는 초기 연구는 Caco-2 세포 페리틴 형성을 기반으로 Fe 흡수를 측정하도록 개선되었습니다. Caco-2 세포 페리틴 측정은 시료 처리량을 향상시키고 방사성 동위 원소 처리 및 외인성 Fe와 고유 Fe19,20의 평형 문제를 무효화했습니다. 페리틴 형성을 통한 Fe 흡수 측정을 통해 연구자들은 복잡한 식사를 포함한 광범위한 식품을 연구 할 수있었습니다21. 따라서, Caco-2 세포 Fe 흡수와 결합된 모의 (시험관내) 소화는 식품으로부터의 Fe 흡수의 더 나은 생리학적 평가를 제공하였다. 이 모델은 주로 Fe 생체 이용률의 상대적 차이를 결정한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 많은 유용한 세포주와 마찬가지로 Caco-2 세포도 반응성의 다양성을 보였지만 식품 간의 Fe 흡수에서 일관된 상대적 차이를 유지했습니다. 적절한 기술과 세부 사항에 대한 세심한 주의는 Caco-2 세포에서 일관된 세포 페리틴 형성 반응을 개선할 수 있습니다.
시험관 내 소화/Caco-2 세포 모델은 Caco-2 세포 생물학적 분석으로도 알려져 있습니다. 이 분석은 인간 및 동물 연구22와의 직접적인 비교를 통해 철저히 검증되었습니다. 생물학적 분석과 인간 효능 시험의 직접적인 병렬 비교 외에도이 모델은 Fe 흡수에서 인간18,19,23의 Fe 흡수와 질적으로 유사한 반응을 나타내는 것으로 나타났습니다. 따라서 시험관 내 접근 방식으로서 Caco-2 세포 생물학적 분석은 식품에서 Fe 영양을 평가하기위한 스크리닝 도구로서 높은 신뢰성을 보장합니다. 그것은 수많은 식품 및 식품 21,24,25,26,27,28에 널리 적용되었습니다.
1998 년에 시작된 이래 Caco-2 세포 생물 분석은 장 Fe 흡수에 영향을 미치는 요인을 식별하는 데 도움이되어 Fe 영양 분야를 발전 시켰습니다. 그렇게함으로써이 모델은보다 결정적이고 비용이 적게 드는 인간 연구를위한 연구 목표를 개발하고 개선했습니다. 이 모델의 사용이 일부 인간 실험의 필요성을 부정한다고 주장 할 수도 있습니다.
요약하면, 음식 또는 식사로부터의 Fe의 상대적 전달은 Caco-2 세포 생물 검정으로 측정 할 수있다. 시험 식사에서 Fe의 양에 관계없이, 생물 분석은 흡수 과정의 첫 번째 단계 인 장 세포로 흡수되는 Fe의 상대적 양을 정의합니다. 이것은 Fe 생체 이용률을 정의하는 가장 중요한 단계이며, 대부분의 목표는 식품에서 Fe의 영양 품질을 개선하거나 최소한 모니터링하려는 의도로 측정하는 것입니다. 철분 상태가 흡수에 의해 조절되고, 따라서 Fe 흡수가 영양 요구를 충족시키기 위해 Fe 결핍 개체에서 상향 조절된다는 점을 감안할 때, 모델의 표준 조건은 세포에 의한 Fe 흡수가 최대가되도록 설계되었습니다. 이러한 방식으로 생물학적 분석은 Fe를 전달하는 식품의 잠재력에 대한 진정한 척도를 제공합니다.
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Protocol
참고: 독자를 위한 편리한 참조 지점으로 다음 방법론은 생물학적 분석 실행에서 20개의 실험 샘플에서 Fe 생체 이용률을 측정하는 데 필요한 특정 배양 조건 및 재료와 필요한 품질 관리를 설명합니다. 이 용량을 초과하는 샘플 수를 늘리는 것은 생물학적 분석 내에서 다양한 세포 배양 및 체외 소화 단계에 필요한 시간 때문에 권장되지 않습니다.
1. 샘플 양 선택
- 고체 또는 액체 식품의 경우 테스트 할 샘플을 대표하는 것으로 간주 될 수있는 식품의 양을 결정하십시오.
- 콩 품종의 Fe 생체 이용률을 테스트 할 때 100-150g의 콩 종자를 사용하고이 양을 균질 한 샘플로 처리하십시오.
- 강화 주스, 유제품 및 스포츠 음료와 같은 액체 샘플의 경우 샘플링 전에 식품이 잘 혼합되었는지 확인하십시오.
알림: 위에서 언급 한 콩 종자 재료의 양은이 주요 작물의 종자 간의 고유 한 차이를 설명하는 데 필수적입니다.
2. 샘플 준비
- 가공하기 전에 증류수 탈이온수로 식품 샘플의 흙과 먼지를 헹굽니다.
- 실험 목적에 따라 적절한 양의 시료를 증해방법 및 밀링 등으로 처리한다.
알림: 조리 및 가공을 위해서는 오염 물질 Fe의 잠재적 원인이 아닌 조리기구 및 장비를 사용하는 것이 중요합니다. 스테인레스 스틸 장비는 오염되지 않습니다. 그러나 석재 분쇄기, 주철 조리기구 및 Fe가 포함 된 비 스테인리스 스틸 장비와 같은 장비는 상당한 양의 오염 물질 Fe를 추가 할 수 있습니다. 표준 스테인레스 스틸 커피 그라인더는 종종 분쇄에 적합합니다. - 동결 건조시키고 균질 한 분말로 분쇄하십시오.
참고: 일단 균질화되면 연구에 따르면 측정되는 각 식품에 대해 세 가지 독립적인 분석 복제가 적절하다는 것이 밝혀졌습니다.- 샘플 균질성을 달성하기 어려운 경우 제품의 제형 또는 가공을 수정하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 비균질성이 심각하지 않은 경우 복제를 추가합니다.
- 대부분의 균질 고체 식품의 경우 복제 당 0.5g의 동결 건조 된 샘플을 사용하십시오. 필요한 경우 반복실험당 최대 1.0g의 샘플을 사용하되 0.5g을 초과하면 반응 정도에 이점이 있는지 확인합니다.
알림: 0.5g의 고체 식품보다 높은 양은 투석막을 막을 수 있습니다(아래 참조). - 1-2mL의 액체 샘플을 사용하십시오.
알림: 동결 건조는 종종 액체 샘플에 필요하지 않습니다.
3. 카코-2 세포 배양
- 주식 문화
- 인증 된 공급 업체로부터 Caco-2 세포를 구입하십시오.
- 25mM hepes (pH 7.2), 10 % (v / v) 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 항생제-항진균 용액으로 보충 된 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 사용하여 5 %CO2 공기 분위기 (일정한 습도)의 인큐베이터에서 37 ° C의 스톡 바이알에서 세포를 배양합니다.
- 충분한 세포가 사용 가능해지면 일반적으로 배양 7-10일 후에 콜라겐이 코팅되지 않은 플라스크에 30,000cells/cm2의 밀도로 세포를 시드합니다.
- 사용 가능하고 멀티웰 플레이트 파종에 필요한 셀 수에 따라 플라스크 크기를 선택합니다.
참고: 일반적으로 T225(225cm 2) 플라스크는 생물학적 분석당 11개의 멀티웰(6웰, 9.66cm2/웰) 플레이트(샘플 비교용 플레이트 10개, 품질 관리용 플레이트 1개)가 사용되는 실험에 가장 적합합니다. - 플라스크에서 7 일 동안 세포를 성장시키고 격일로 배지를 교체하고 7일 째에 멀티 웰 플레이트를 파종하는 데 사용합니다.
참고: 세포가 스톡 배양에서 시작된 후 일련의 실험에 사용될 때부터 10-15 계대 이하의 계대 범위를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 계대는 광범위한 계대가 세포주에서 적응적 변화를 초래할 수 있고, 따라서, 모델의 반응에서 가변성을 초래할 수 있으므로 제한되어야 한다.
- 멀티웰 플레이트에서의 세포 배양
- Caco-2 세포를 6웰 콜라겐 코팅 플레이트에 50,000 cells/cm2 의 밀도로 시드합니다.
참고: 이 단계는 일반적으로 수요일에 수행하는 경우 가장 잘 작동합니다. 다음 단계를 통해 이 요일이 최적인 이유를 분명히 알 수 있습니다. - 25mM hepes (pH 7.2), 10 % (v / v) FBS 및 1 % 항생제 - 항진균 용액으로 보충 된 DMEM을 사용하여 5 % CO2 공기 분위기 (일정한 습도)의 인큐베이터에서 37 ° C에서12 일 동안 세포를 성장시킵니다.
참고: 세포 단층을 12일 이상 배양하면 세포가 과증식할 수 있습니다. 이전 연구는 이러한 조건 하에서 파종 후 12 일에 세포 단층이 성숙하고 플레이트에 잘 부착되며 반응 29,30,31의 일관성에서 최적임을 분명히 보여주었습니다. 세포를 최대 19-21일과 같이 더 오래 성장시키면 세포가 과증식하고 배지는 영양소가 빠르게 고갈되어 건강에 해로운 단층이 생성됩니다. - 12일 동안 일관된 일일 일정에 따라 최소 2일마다 매체를 교체하십시오.
- 파종 후 12일 째 되는 날, 배양 배지를 10mM 파이프(피페라진-N,N'-비스-[2-에탄술폰산]), 1% 항생제-항진균제, 하이드로코르티손(4mg/L), 인슐린(5mg/L), 셀레늄(5μg/L), 트리요오드티로닌(34μg/L) 및 표피 성장 인자(20μg/L)가 보충된 최소 필수 배지(MEM[pH 7]) 2mL로 교체합니다.
참고: 시드가 수요일에 시작된 경우 12일 째 되는 날은 월요일이 됩니다. - 다음 날(즉, 13일)에 MEM을 제거하고 1mL의 MEM으로 교체합니다(pH 7).
참고: 이 단계는 화요일에 발생합니다. 이것은 생물학적 분석이 시작되는 날입니다. 따라서 13일 일정은 일관된 주간 일정의 이점을 제공하여 생물학적 분석이 동일한 평일에 일관되게 수행될 수 있도록 합니다.
- Caco-2 세포를 6웰 콜라겐 코팅 플레이트에 50,000 cells/cm2 의 밀도로 시드합니다.
4. 체외 소화
- 인서트 링의 준비
- 산성 세척 투석막이 장착된 실리콘 O-링을 사용하여 멸균된 삽입 링을 만듭니다(그림 1A).
알림: 바이오어세이 당일 1일 전(즉, 월요일, 12일) 삽입물을 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 18MΩ 물에 보관하십시오. - 생물학적 분석 당일(화요일, 13일차)에 냉장고에서 삽입물을 제거하고 배수한 다음 물을 0.5M HCl로 교체합니다. 사용하기 전에 층류 후드의 실온에서 최소 1시간 동안 그대로 두십시오.
알림: 이 단계는 배양 플레이트에서 MEM을 제거하기 전에 수행해야 합니다. 멤브레인의 산 세척은 가능한 오염 Fe를 제거하고 인서트 링 및 멤브레인을 살균하는 역할을합니다. - 인서트에서 0.5 M HCl을 배출하고 멸균 18 MΩ 물로 헹굽니다. 사용할 준비가 될 때까지 층류 후드에 실온의 멸균 18MΩ 물에 보관하십시오.
- Caco-2 셀이있는 6 웰 플레이트의 각 웰에 링을 삽입하여 2 챔버 시스템을 만듭니다. 인서트가있는 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
알림: 이 단계는 각 웰에 새로운 1.0mL의 MEM을 추가한 직후에 수행해야 합니다(3.2.5단계 참조).
- 산성 세척 투석막이 장착된 실리콘 O-링을 사용하여 멸균된 삽입 링을 만듭니다(그림 1A).
- 펩신 용액의 제조
- 실험 당일에, 0.1 M HCl 50 mL에 0.145 g의 펩신을 용해시켜 펩신 용액을 제조한다. 실온에서 30 분 동안 플랫폼 쉐이커에서 용액을 부드럽게 흔든다.
- 췌장 - 담즙 용액의 제조
- 실험 당일, 18MΩ의 물 250mL에 2.1g의 NaHCO3를 용해시켜 0.1MNaHCO3를 제조하였다.
- 0.1 M NaHCO3 175 mL에 0.35 g의 판 크레아틴과 2.1 g의 담즙 추출물을 혼합한다.
- pancreatin과 담즙 추출물이 가용화되면 약한 양이온 교환 수지 87.5g을 넣고 ( 재료 표 참조) 실온에서 30 분 동안 흔들어 혼합합니다.
- 슬러리를 큰 컬럼에 붓고 용출액을 수집합니다.
- 0.1M NaHCO3 70mL를 추가로 사용하여 컬럼을 용리하고이 부피를 pancreatin 담즙 용액에 수집합니다.
알림: 수지의 목적은 pancreatin-담즙 추출물에서 일반적으로 발견되는 오염 물질 Fe를 제거하는 것입니다.
- 체외 소화를 시작하십시오.
- 멸균된 50mL 원심분리 튜브(폴리프로필렌)에서 샘플을 칭량한 다음 140mM NaCl 및 5mM KCl을 포함하는 pH 2의 생리식염수 10mL를 추가합니다.
- 준비된 돼지 펩신 용액 0.5mL를 샘플에 첨가하여 위 소화 과정을 시작하고 37 ° C에서 1 시간 동안 낮고 부드러운 설정으로 흔들리는 셰이커에서 배양합니다.
- 이 기간 후, 1.0 M NaHCO3로 pH를 5.5-6.0으로 조정하여 각 샘플의 장 소화 과정을 개시한다.
- 각 샘플 튜브에 2.5mL의 판크레아틴-담즙 용액을 추가하고 1.0MNaHCO3로 pH를 6.9-7.0으로 조정합니다.
- pH가 조정되면 140mM NaCl, 5mM KCl(pH 6.7) 용액을 사용하여 각 튜브의 부피를 균등화하고 15g의 목표값으로 튜브의 무게를 측정합니다.
알림: 일부 식품의 경우 식품의 완충 용량에 따라 총 부피를 16g 또는 17g으로 가져와야 할 수도 있습니다. - 각 장 소화액 1.5mL를 Caco-2 세포를 함유하는 6-웰 배양 플레이트의 상응하는 웰의 상부 챔버(즉, 투석막이 있는 삽입 고리 포함)로 옮깁니다(그림 1B).
- 플레이트 커버를 교체하고 로킹 셰이커에서 37°C(5%CO2 공기 분위기)에서 분당 6회 진동으로 2시간 동안 배양합니다.
- 다이제스트와 함께 삽입 링을 제거하고 각 웰에 1mL의 MEM(pH 7)을 추가합니다.
- 세포 배양 플레이트를 인큐베이터(37°C; 5% CO2 공기 분위기)로22 시간 더 되돌립니다.
- 22시간 후, 세포 배양 배지를 제거하고 2.0mL의 18MΩ 물을 세포 단층에 첨가한다.
알림: 물은 세포를 삼투압으로 용해시킵니다. - 후속 세포 단백질 및 세포 페리틴 분석을 위해 전체 세포 용해물을 표준 폴리프로필렌 미세 원심분리 튜브 또는 이와 유사한 튜브로 수확합니다.
5. Caco-2 세포 페리틴 및 세포 단백질의 측정
- 단계 4.4.10의 세포 용해물을 사용하십시오. 세포 페리틴과 단백질의 측정을 위해.
- Caco-2 세포의 페리틴 함량을 측정하려면 마우스 항 페리틴 항체-양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 접합체에 대해 배양 시간을 30 분에서 2 시간으로 늘리는 것을 제외하고는 키트의 지침 ( 재료 표 참조)을 따르십시오.
- 세포 단백질을 측정하려면 세포 단백질 키트에 제공된 지침을 따르십시오( 재료 표 참조).
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Representative Results
주요 식량 작물의 Fe 생체 이용률 확인 및 측정
이 모델을 개발 한 주된 이유 중 하나는 주요 식량 작물의 Fe 생체 이용률에 영향을 미치는 요인을 식별하고 식물 육종가가 Fe 생체 이용률이 향상된 품종을 식별하고 개발할 수있는 도구를 제공하는 것이 었습니다. 일반적인 콩 (Phaseolus vulgaris)은 Fe 생물 강화를위한 작물로 전 세계적으로 표적화되었습니다. 따라서이 모델은 광범위한 콩 시장 등급 및 콩 육종 프로그램에서 Fe의 영양 품질을 평가하기 위해 광범위하게 적용되었습니다. 예를 들어, 노란 콩은 미국의 신흥 시장 클래스입니다. 동 아프리카와 같은 지역에서는 인기가 높으며 빠른 요리로 널리 알려져 있으며 많은 사람들이 "소화하기 쉬운"것으로 간주합니다. Caco-2 세포 생물 분석법을 사용한 최근 연구에 따르면 특정 품종의 노란 콩은 다른 색상 등급에 비해 Fe 생체 이용률이 높을 수 있습니다 (그림 2). 이 연구에서 Manteca 품종은 흰색 및 빨간색 얼룩덜룩 한 색상 클래스의 참조 대조군에 비해 Fe 생체 이용률이 높은 것으로 확인되었습니다. 또한 결과는 2 년 연속 수확 연도에 걸쳐 일관되었습니다. 이러한 비교는 동물 및 인간 실험의 높은 비용과 훨씬 낮은 처리량으로 인해 다른 모델, 특히 생체 내 모델에서는 실현 가능하지 않습니다.
Fe 생체 이용률에 대한 식품 가공 효과 평가
Caco-2 세포 생물학적 분석은 Fe 생체 이용률에 대한 식품 가공 효과를 평가하는데도 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 그림 3 의 결과는 여러 색상 등급의 콩 및 콩 기반 파스타를 분석한 결과입니다. 결과는 콩을 밀가루로 가공하여 흰색(스노든, 알페나, 사무라이) 및 노란색(카나리오) 콩 품종에서 Fe 생체 이용률을 증가시키는 방법을 보여줍니다. 크랜베리 (Etna), 적색 신장 (Red Hawk) 및 흑색 (Zenith) 품종의 경우, Fe 생체 이용률은 파스타 가루 제제에서 감소했다. 관련 분석에 따르면 콩을 밀가루로 가공하면 콩의 자엽 세포벽이 파괴되어 세포 내 Fe가 흡수 될 수 있습니다. 흰색과 노란색 콩 파스타에서 철 흡수가 증가했는데, 이는 이러한 품종의 종자 코트가 Fe 생체 이용률을 억제하는 폴리 페놀 화합물을 포함하지 않았기 때문입니다. 대조적으로, 크랜베리, 적신장, 검은콩의 종자 코트에는 높은 수준의 억제성 폴리페놀이 포함되어 있어 Fe 흡수가 감소합니다. 이러한 결과는 Fe의 영양 품질에 영향을 미칠 수있는 요인을 노출시키는 데있어 모델의 유용성을 분명히 나타냅니다.
그림 1: Caco-2 세포 Fe 흡수를 위한 삽입 링 설정. (A) Caco-2 세포의 이미지와 투석막이 부착된 삽입 링. (b) 멀티웰 플레이트의 단일 웰 내에서 Caco-2 세포 Fe 흡수와 결합된 시험관내 소화를 위한 전체 절차의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 노란 콩 패널에서 담그지 않고 조리된 전체 종자 유전자형의 철 생체 이용률 점수. (A) 필드 시즌 2015; (B) 필드 시즌 2016. 값은 유전자형(n = 6)당 2개의 필드 반복실험에서 삼중 측정의 평균(표준 편차)입니다. 유전자형은 요리 클래스별로 x축으로 분류되며, 가장 빠른 요리 유전자형부터 가장 느린 요리 항목까지 순위가 매겨집니다. *다른 YBP 항목보다 유의하게 낮은(p < 0.05) 철 생체 이용률 점수. **다른 YBP 유전자형보다 유의하게 높은(p < 0.05) 철 생체이용률 점수. 이 수치는32에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 콩 품종 및 해당 콩 기반 스파게티의 Caco-2 세포 페리틴 형성(세포 단백질 밀리그램당 페리틴 나노그램)으로 표시되는 철 생체 이용률. (A) 3 가지 흰 콩 품종과 그에 상응하는 콩 기반 스파게티; (B) 4 가지 색상의 콩 품종과 그에 상응하는 콩 기반 스파게티. 값은 각 품종에서 6개 측정값의 평균(± 표준 편차)입니다. 파란색 하이픈으로 연결된 선은 콩 기반 스파게티와 동일한 방식으로 압출, 조리 및 가공된 강화되지 않은 듀럼 밀 파스타 제어의 철 생체 이용률을 나타냅니다. * 요리 후 전체 콩보다 유의하게 (p ≤ 0.05) 더 높은 Caco-2 세포 페리틴 형성. ** 요리 후 전체 콩보다 유의하게 (p ≤ 0.05) 낮은 Caco-2 세포 페리틴 형성. 이 수치는33에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
처음부터 Caco-2 세포 생물학적 분석에 대한이 방법을 설명하는 수많은 연구가 발표되었습니다. 기본 조건은 1998 년 최초 출판 이후 상대적으로 변경되지 않았습니다18. 그러나 지난 20 년 동안 수많은 기술적 세부 사항이 개선되고 표준화되어 생물학적 분석의 반응에서 전례없는 일관성을 산출했습니다. 세포 배양 및 체외 소화 조건에 대한 신중하고 정확한 준수는 생물학적 분석의 일관되고 민감한 반응의 핵심입니다.
이 방법을 사용하여 수많은 개인을 훈련 한 경험에서 가장 일반적인 투쟁은 Caco-2 세포의 적절한 배양입니다. 건강한 단층의 일관된 배양은 건강하고 반응성이 뛰어난 Caco-2 세포 단층의 핵심입니다. 세포 단백질 수준이 웰에서 웰까지 매우 일관되지 않고 프로토콜에 나열된 세포 단백질의 범위 내에 있지 않은 경우, 조사자는 프로토콜에서 벗어난 세포 배양 조건을 재검사해야 합니다. 대안적으로, 낮은 수준의 미생물 오염이 존재할 수 있거나, 세포 배양 인큐베이터가 제대로 작동하지 않거나, 세포 배양 배지가 적절하게 제형화되지 않을 수 있다.
체외 소화 과정은 잠재적인 문제의 또 다른 원인입니다. 소화 효소에서 오염 물질 Fe를 제거하는 것이 중요합니다. 제조업체의 주장에도 불구하고 효소의 Fe 농도를 주기적으로 확인하고 Fe 제거 공정 (프로토콜 참조)이 효과적인지 확인하는 것이 현명합니다. Fe 오염이 소화 효소에 존재하는 경우, 기준 소화 품질 관리는 권장 범위를 초과하는 세포 페리틴 값을 산출합니다.
숙련되고 훈련된 조사자는 한 번의 생물학적 분석으로 20개의 실험 샘플과 품질 관리를 분석할 수 있어야 합니다. 따라서 생물학적 분석의 각 실행에 대해 약 12개의 6웰 플레이트가 필요합니다. 생물학적 분석당 더 많은 수의 샘플은 분해 과정에서 pH 적정 타이밍이 너무 길어서 샘플 분해 시간 사이에 잠재적인 불일치가 발생할 수 있으므로 권장되지 않습니다.
이 모델의 단점은 상대적으로 적습니다. 이를 위해서는 세포 배양에 고도로 숙련되고 세부 사항과 프로토콜에 정밀하게 주의를 기울일 수 있는 연구자가 필요합니다. 실험실 공간은 Fe 오염원이 없어야 하며 시약 및 기타 물질은 Fe 오염에 대해 정기적으로 모니터링해야 합니다. 따라서, 사용자는 Fe 농도의 측정을 위한 기기 또는 접근 능력을 가져야 한다. 이 모델은 상대적 또는 반 정량적 측정 일뿐입니다. 그러나 기준 대조군을 적절하게 사용하면 모델은 Fe 흡수의 정량적 추정치를 제공 할 수 있습니다. 실제로, 대조군 대 시험 물질의 흡수 비율의 변환 방정식이 생성되었다19.
생물학적 분석은 다음 원리에 따라 작동합니다 : Caco-2 세포는 세포 Fe 농도의 증가에 반응하여 더 많은 페리틴 단백질을 생성합니다. 따라서 Fe 생체 이용률은 Caco-2 세포 페리틴 생산의 증가에 비례합니다. 이러한 증가는 소화된 샘플에 노출된 후 총 Caco-2 세포 단백질(총 세포 단백질의 밀리그램당 페리틴의 나노그램)에 대한 세포 페리틴의 비율로 표현된다(19). 페리틴 측정은 이 생물학적 분석에서 반응을 테스트한 ELISA 키트(재료 표 참조)를 사용하여 이루어집니다. 총 세포 단백질 농도는 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화됩니다. 앞서 언급했듯이, 이 방법에 사용된 조건 하에서, 6-웰 플레이트에서의 전형적인 Caco-2 세포 단백질 수준은 웰당 세포 단백질의 2.0 mg 내지 2.6 mg 범위이다. 이 범위를 벗어난 값은 건강에 해로운 세포 배양, 세포의 과증식 가능성 또는 잘못된 세포 파종 기술을 나타냅니다. 주어진 생물학적 분석 실행 내에서 값은 웰당 최대 0.2mg까지만 변해야 합니다. 더욱이, 이 방법론에 사용된 파종 밀도 및 배양 조건 하에서, 파종 후 13일에 상당한 브러시 경계 효소 활성이 있으며, 이는 세포 단일층28,29,30의 전부는 아니더라도 대부분의 성숙을 나타낸다. 사용 전 13일 동안 세포 단층을 모니터링하여 액포 형성 또는 단층 형성의 틈과 같은 오염 또는 스트레스에 대해 모니터링합니다. 이러한 조건이 명백한 경우, 세포는 생물학적 검정에 사용하기에 유효한 것으로 간주되어서는 안됩니다.
Caco-2 생물학적 분석의 반응성을 모니터링하려면 생리적으로 균형 잡힌 식염수와 위장 효소만 포함된 빈 다이제스트를 포함한 여러 품질 관리로 각 실험을 실행해야 합니다. 이러한 제어는 생물학적 분석에 Fe 오염이 없음을 보장합니다. 블랭크 다이제스트에 노출된 Caco-2 세포의 페리틴 값은 일반적으로 페리틴/mg 세포 단백질의 1ng 내지 6ng 범위이다. 이 범위의 기준선 페리틴은 또한 세포가 상대적으로 낮은 Fe 상태에 있고, 따라서, 이용가능한 Fe에 대해 최대 감도를 나타내야 함을 나타낸다.
사용 초기 15년 동안 추가 품질 관리에는 1) FeCl3(66μM)를 사용한 블랭크 다이제스트 및 2)FeCl3(66μM)의 블랭크 다이제스트와 1.3mM 아스코르브산 첨가가 포함되었습니다. FeCl3 소화에 대한 페리틴 값은 전형적으로 페리틴/mg 세포 단백질의 30-50 ng 범위에 있었고, 아스코르브산을 사용한FeCl3 소화는 페리틴/mg 세포 단백질의 250-400 ng 범위에 있었다. 최근 몇 년 동안 블랭크 다이제스트는 품질 관리로 남아 있습니다. 그러나 우리는 아스코르브산이 있거나 없는 식품 샘플을 20:1의 비율로 사용하는 것으로 전환했습니다. 사용 된 식품 샘플은 약 65 μg Fe / g의 샘플을 포함하는 흰 콩가루였습니다. 이러한 품질 관리는 더 좁고 일관된 반응 범위를 제공하여 흰 콩가루의 경우 20-30ng의 페리틴/mg의 세포 단백질을, 흰 콩가루와 아스코르브산염의 경우 70-150ng의 페리틴/mg의 세포 단백질을 생성합니다. 새로운 값 범위는 재료 표의 참조 키트에서 가져온 것으로, 지금은 없어진 Ramco ELISA 키트보다 약간 낮은 경향이 있습니다. 이 원고의 출판 시점에서, 참조 키트로 2-3 개월의 데이터 만 획득되었습니다.
생물학적 분석의 유효하지 않거나 차선의 실행을 나타내는 결과 및 세포 배양 조건을 인식하는 것이 중요합니다. 첫째, 방법에 명시된 바와 같이, 블랭크 분해 조건에서 세포 페리틴 농도가 제안 된 범위보다 높은 경우 이는 세포 배양 배지, 소화 효소 또는 투석막의 Fe 오염을 나타낼 수 있습니다. 세포 배양 배지 및 소화 효소에 허용되는 Fe 농도는 <20 μg Fe / mL입니다. 다른 품질 관리의 범위를 벗어난 값, 특히 낮은 쪽에 있는 경우 결과의 유효성이 의심스럽다는 것을 나타냅니다.
요약하면,이 모델은 세포 배양 조건이 낮은 Fe 상태의 세포를 생성하도록 설계되었으므로 생체 이용 가능한 Fe에 매우 민감합니다. 따라서, Fe 흡수에 대한 그들의 메커니즘은 고도로 상향 조절된다. 높은 처리량을 처리할 수 있는 견고한 모델입니다. 인간에게 먹일 수있는 모든 음식이나식이 요법이이 모델에서 평가 될 수 있으므로 생물학적 분석은 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 식물 육종가는이 모델을 사용하여 주식의 Fe 생체 이용률을 측정하여 Fe 생체 이용률에 영향을 미치는 특성과 염색체 영역을 식별 할 수 있습니다. 식품 과학자는 모델을 적용하여 최적의 제형을 결정하고 적절한 Fe 생체 이용률을 보장하기 위해 가공 효과를 평가할 수 있습니다. 영양사는이 모델을 사용하여 개별 식품, 식품 조합 및 다이어트 계획에서식이 Fe 생체 이용률을 평가하고 모니터링 할 수 있습니다. 인체 실험에 대해 철저히 검증되어 모든 응용 분야에서 효과의 방향과 크기를 정확하게 예측합니다. 따라서 모의 소화와 장 상피 세포 Fe 흡수를 결합함으로써이 모델은 Fe 흡수 과정에서 중요한 첫 번째 단계를 나타내며 따라서 식품에서 Fe의 전달 또는 생체 이용률을 예측할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Yongpei Chang과 Mary Bodis의 기술적 노력에 깊이 감사드립니다. 영양 분야에서이 모델을 매우 성공적으로 적용한 것은 전문 지식과 세부 사항에 대한 관심의 직접적인 결과입니다. 이 모델의 개발은 전적으로 미국 농무부, 농업 연구 서비스에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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