Summary
Konstruerede klapper kræver et indbygget funktionelt vaskulært netværk. I denne protokol præsenterer vi en metode til fremstilling af en 3D-printet vævsklap indeholdende et hierarkisk vaskulært netværk og dets direkte mikrokirurgiske anastomoser til rotte lårbensarterie.
Abstract
Engineering implanterbare, funktionelle, tykke væv kræver design af et hierarkisk vaskulært netværk. 3D-bioprinting er en teknologi, der bruges til at skabe væv ved at tilføje lag på lag af printbare biomaterialer, såkaldte bioinks og celler på en ordnet og automatisk måde, hvilket giver mulighed for at skabe meget indviklede strukturer, som traditionelle vævstekniske teknikker ikke kan opnå. Således er 3D-bioprinting en tiltalende in vitro-tilgang til at efterligne den oprindelige vaskulaturkompleksstruktur, der spænder fra millimetriske kar til mikrovaskulære netværk.
Fremskridt inden for 3D-bioprinting i granulære hydrogeler muliggjorde ekstrudering af ekstracellulære matrixbaserede bioinks med høj opløsning. Dette arbejde præsenterer en kombineret 3D-bioprinting og offerformbaseret 3D-printtilgang til fremstilling af manipulerede vaskulariserede vævsflapper. 3D-bioprinting af endotel- og støtteceller ved anvendelse af rekombinant kollagen-methacrylatbioink i et gelatinestøttebad anvendes til fremstilling af et selvsamlet kapillærnetværk. Denne trykte mikrovaskulatur er samlet omkring et mesoskala karlignende porøst stillads, fremstillet ved hjælp af en offer 3D-trykt form og er podet med endotelceller.
Denne samling inducerer endotelet i mesoskalabeholderen til anastomose med det omgivende kapillærnetværk, hvilket etablerer et hierarkisk vaskulært netværk inden for en konstrueret vævsklap. Den konstruerede klap implanteres derefter direkte ved kirurgisk anastomose til en rotte lårbensarterie ved hjælp af en manchetteknik. De beskrevne metoder kan udvides til fremstilling af forskellige vaskulariserede vævsflapper til brug i rekonstruktionskirurgi og vaskulariseringsundersøgelser.
Introduction
Alvorlige vævsdefekter er forårsaget af traumatiske skader, medfødte defekter eller sygdom, og den nuværende guldstandard til behandling af disse defekter er ved hjælp af autologe transplantater, vaskulariserede vævsflapper og mikrovaskulære frie klapper som vævserstatninger. Disse muligheder har imidlertid ulemperne ved begrænset donorstedsvæv og donorsteds sygelighed1. Der er således en stigende efterspørgsel efter alternative vævserstatninger, der kan bruges til at rette op på disse defekter2. Tykkelsen af de konstruerede vævskonstruktioner er begrænset af diffusion af næringsstoffer og gasser mod cellerne, og derfor er et ordentligt vaskulært netværk afgørende for at generere store, tykke og korrekt nærede stilladser.
Der er anvendt flere metoder til at fremme vaskularisering af konstruerede implantater3, herunder in vivo-rekruttering af vaskulær støtte fra værten, levering af vækstfaktorer og cytokiner i stilladserne, prævaskularisering af implantater, generering af et perfusabelt forgreningsmikroskib ved hjælp af mikropatterningsteknikker4, anvendelse af offermaterialer til vaskulær kanal/ netværksdannelse5 , samt oprettelse af kanaler inden for 3D bioprintede konstruktioner 5,6. Vaskularisering af tykke væv kræver inkorporering af et hierarkisk vaskulært netværk bestående af makroskala og mikrokapillærskala fartøjer. Makroskalakarrene fordeler blod effektivt gennem hele konstruktionen og tillader mikrokirurgiske anastomoser med værtsblodkarrene, mens mikrokapitalskalakarrene giver mulighed for næringsdiffusion.
Bioprinting har fået stor opmærksomhed i de senere år på grund af de fordele, det giver i forhold til konventionelle vævstekniske metoder. Væv og organer er komplekse og indviklede 3D-objekter med en bestemt arkitektur. 3D-bioprinting med dets evne til at deponere lag af biomaterialer i høj opløsning gør det muligt at skabe komplekse vævs- og organsubstitutter (f.eks. nyre, lunge, lever)7. Flere udskrivningsteknologier er blevet tilpasset til bioprinting, herunder ekstruderingsbaseret, inkjet8, laserassisteret deposition 9,10 og stereolitografibaseret11,12 bioprinting. De ekstruderingsbaserede teknologier er afhængige af ekstrudering af materialet gennem en dyse ved at lægge pres på materialets bulkoverflade modsat dysen.
Fri form reversibel indlejring af suspenderede hydrogeler (FRESH) er en bioprintteknik13,14, der bruger et granulært støttemateriale, hvor det ekstruderede materiale deponeres og fastgøres på plads af støttebadet. Støttebadet giver mekanisk støtte til den ekstruderede, forkrydsede bioink indtil dens tværbinding. Den største fordel ved denne teknik er, at støttebadet giver mulighed for ekstrudering af materialer med lav viskositet, der ikke kan opretholde deres form efter ekstrudering og før tværbinding15. Dette udvider puljen af tilgængelige materialer, der kan bruges som bioinks.
Dette papir præsenterer en protokol til generering af en vaskulariseret klap, der kombinerer mikroskala og mesoskala vaskulaturer. For at opnå dette genereres bioprintede, selvsamlende, mikrovaskulære netværk i rekombinant human kollagenmethacrylat (rhCollMA) hydrogel, som derefter forbinder til det indre af et større, implanterbart, vaskulært stillads, hvilket resulterer i en fuldt konstrueret vævsklap16. For at etablere hurtig og direkte perfusion af manipulerede væv kræves en direkte mikrokirurgisk anastomose til værtsfartøjer. Det vaskulære stillads har ikke tilstrækkelig suturretentionsstyrke til at blive anastomoseret ved hjælp af traditionel mikrokirurgisk karvægsuturering. Derfor beskriver vi en "manchet"17,18,19 metode til at opnå en anastomose med en rottes fælles lårbensarterie. I denne metode sikres fartøjets ender med perifere suturer uden behov for at perforere karvæggen.
Selvom den foreslåede protokol er udarbejdet for at studere hierarkisk vaskulatur i rhCollMA-miljøet, kan denne tilgang udvides og anvendes på en række nye applikationer. Protokollen kan anvendes til bioprinting af forskellige vævsspecifikke celler i forskellige bioinks. Desuden kan konstruktionernes geometri og størrelse let ændres, så de passer til specifikke krav, såsom rekonstruktion af stort væv eller biologiske undersøgelser.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt og udført under tilsyn af Technion Pre-Clinical Research Authority (PCRA Technion, etisk godkendelse nr. 058-05-20). Mandlige Sprague-Dawley rotter (275-350 g) blev brugt til disse undersøgelser. Se materialetabellen for detaljer relateret til alle materialer, udstyr og software, der bruges i denne protokol.
1. Fremstilling af vaskulær stillads
- Opret en 3D-computermodel af den ønskede vaskulære stilladsform ved hjælp af CAD-software (Computer Aided Design), eller download en 3D-fil med en ønsket vaskulær struktur fra online repositories.
- Opret en cylinder med en indvendig diameter på 0,9 mm, en ydre diameter på 2 mm og en højde på 18 mm. Tilsæt radiale fenestrationer med en diameter på 0,22 mm langs cylindervæggen.
- Opret en form til stilladset ved hjælp af 3D-designsoftwaren, og eksporter den som en . STL-fil. Tilføj derefter en tragt til designet for at lette påfyldningen af formen senere.
- Importer . STL-fil i udskæringssoftwaren til den smeltede aflejringsmodellering (FDM) 3D-printer. Skær modellen i skiver med en laghøjde på 0,1 mm, og eksporter den som .gcode, eller send den direkte til 3D-printeren.
- 3D-print formen på en FDM 3D-printer udstyret med en 0,25 mm dyse ved hjælp af vandopløselig buten-diol vinylalkoholcopolymer (BVOH) filament. Opbevar de trykte forme i et vakuumkammer indtil brug.
FORSIGTIG: Undgå at håndtere BVOH-filamentet med bare hænder, da det er fugtfølsomt. Derudover anbefales det at opbevare filamentet i et vakuumkammer for at undgå udsættelse for fugt. - Der fremstilles en polymeropløsning af en 1:1 blanding af poly-L-mælkesyre (PLLA) og polymælke-co-glycolsyre (PLGA) i 1,4-dioxan.
- Afvej 350 mg PLLA og 350 mg PLGA, og overfør til et hætteglas med 20 ml glas.
- Der måles 10 ml 1,4-dioxan, og det overføres til hætteglasset med glas ved hjælp af en glaspipette. Tilsæt en lille magnetisk rørestang til hætteglasset med glas.
FORSIGTIG: 1,4-dioxan er et farligt organisk opløsningsmiddel. Brug passende personligt sikkerhedsudstyr og arbejd inde i en røghætte. - Hætteglasset med glas anbringes i et varmtvandsbad opvarmet til 70 °C, og bland indholdet natten over, indtil alle polymererne er helt opløst. Opløsningen opbevares i en lufttæt glasbeholder indtil brug.
- Fyld BVOH-formene med PLLA: PLGA-opløsningen.
- Brug en positiv forskydningspipette til at måle 30 μL af polymeropløsningen og udfylde formen.
BEMÆRK: Det volumen, der er nødvendigt for at fylde formen, ændres i henhold til volumenet af den designede beholder. Fortsæt med at tilsætte polymeropløsningen, indtil formens tragt er helt fyldt. - Centrifuger formen ved 100 × g i 2 min. Fyld formen op med yderligere 20 μL polymeropløsning for at sikre fuldstændig påfyldning.
- Brug en positiv forskydningspipette til at måle 30 μL af polymeropløsningen og udfylde formen.
- De fyldte forme fryses ved -80 °C i mindst 30 minutter for at sikre, at hele polymeropløsningen fryser. Fjern opløsningsmidlet fra formene ved at fryse dem natten over.
BEMÆRK: Farven på polymeren i formen skal vende fra klar til hvid efter frysetørringsprocessen. - For at fjerne offerformmaterialet overføres formene efter frysetørringsprocessen til et 5 L deioniseret vandbad under skånsom omrøring. Udskift vandet i badet, når det bliver overskyet. Når al BVOH opløses, lufttørres stilladserne og opbevares i et vakuumkammer indtil brug.
2. Belægning af vaskulærstilladset med fibronectin
- Desinficer PLLA:PLGA vaskulære stilladser ved at nedsænke dem i 70% ethanol i 30 min.
- Vask stilladserne 3x 5 min med PBS.
- Der fremstilles en fortynding på 50 μg/ml human fibronectin i PBS, og stilladserne overfyldes.
- 500 μL fibronectinopløsning (1 mg/ml) blandes med 9,5 ml PBS.
- De desinficerede vaskulære stilladser nedsænkes i denne fibronektinopløsning, og de inkuberes ved 37 °C i 60 minutter for at muliggøre proteinadsorption.
- Efter inkubation skylles stilladserne med PBS for at fjerne det ubundne fibronectin. Opbevar disse coatede stilladser ved 4 °C i op til 1 uge.
3. rhCollMA bioink forberedelse
- Forbered en fosfatbuffer til neutralisering af den sure rhCollMA bioink-bestand.
- Der fremstilles en 10x beholdning af fosfatbuffer ved at opløse 5,495 g Na2HPO4, 1,55 g NaH2PO4 og 30 mg NaCl i 50 ml deioniseret vand.
- Forbered en 10 gange fortynding af 10x lagerphosphatbufferen ved at kombinere 1 del 10x phosphatbuffer med 9 dele deioniseret vand.
- Kombiner 900 μL lager rhCollMA-opløsning med 100 μL 10x phosphatbuffer for at neutralisere den sure rhCollMA-opløsning.
- Den neutraliserede rhCollMA-opløsning fortyndes til den ønskede koncentration på 10 mg/ml ved at blande den med den krævede mængde 1x phosphatbuffer.
BEMÆRK: Bestandskoncentrationen af rhCollMA varierer mellem partier. Derfor vil volumenet af 1x phosphatbuffer, der er nødvendig for at nå den ønskede koncentration, variere. - Forbered porogen-fotoinitiatoropløsningen (PEO-LAP), der skal kombineres med den fortyndede neutrale rhCollMA.
- Der fremstilles en 1,6% (w/v) opløsning af poly(ethylenoxid) (PEO) i phenol rødfri DMEM ved at opløse 160 mg PEO i 10 ml DMEM.
- Der tilsættes 20 mg lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) til denne opløsning for at opnå 0,2 % (w/v) LAP i opløsningen. Fra dette tidspunkt skal du dække opløsningen med aluminiumsfolie eller opbevare den på et mørkt sted for at beskytte den mod lys.
- Steriliser PEO-LAP-opløsningen ved at føre den gennem et 0,22 μm filter. Opløsningen opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- Før bioprint blandes den fortyndede neutrale rhCollMA-opløsning med PEO-LAP-opløsningen i forholdet 1:1 for at opnå den endelige bioinkopløsning. Brug pipettering i stedet for en hvirvel til at blande opløsningerne, mens du undgår luftbobler.
- Hvis der indføres mange bobler i opløsningen, centrifugeres den ved 2.000 × g i 30 s. Efter centrifugering blandes bioinkopløsningen igen for at sikre homogenitet.
4. Granulær forberedelse af støttebad
- Forbered gelatine granulært støttemateriale.
- I et biologisk sikkerhedsskab opdeles indholdet af et 2 g rør med frysetørret støttemateriale i to sterile 50 ml koniske rør, der hver indeholder ca. 1 g.
- Der tilsættes 40 ml kold (4 °C) phenolrød fri DMEM til hvert rør, og hvirvel kraftigt, indtil alt det frysetørrede støttemateriale opløses.
- Lad den resulterende opslæmning sidde ved 4 °C, så støttematerialet kan rehydrere.
- Afgas støttematerialet i et vakuumkammer i 30 minutter for at reducere bobler.
- Centrifuger støttematerialet ved 2.000 × g i 5 min. Sørg for, at materialet er i bunden af røret, og at supernatanten er klar.
- Aspirer supernatanten, mens du er forsigtig med ikke at aspirere støttematerialet i bunden.
BEMÆRK: Støttematerialet må ikke flyde, mens røret skråner efter fjernelse af supernatanten. Hvis materialet flyder, centrifugeres det igen ved hjælp af de samme indstillinger, men uden at tilføje nyt supernatant.
- Overfør ca. 4 ml af det forberedte, komprimerede støttemateriale til hver brønd i en 12-brønds plade ved hjælp af en positiv forskydningspipette. Tryk på brøndpladen på en hård overflade for at tvinge støttematerialet til at sprede sig jævnt i brønden.
BEMÆRK: Den minimale anbefalede mængde støttemateriale er 3x volumenet af den konstruktion, der vil blive trykt i den. - Brøndpladen med støttematerialet anbringes på et afkølet bioprintertrin eller ved 4 °C, indtil den anvendes for at forhindre gelatinepartiklerne i at smelte.
5. Inkorporering af endotelceller og støtteceller med bioink
- Forbered endotelcellemedium i henhold til producentens anvisninger ved at blande basalmediet med dets tilsvarende medium kit-komponent, herunder en antibiotisk opløsning, føtalt bovint serum og endotelcellevæksttilskud.
- Forbered tandmasse stamcellemedium ved at kombinere 500 ml DMEM med lavt glukoseindhold, 58 ml føtalt bovint serum, 5,8 ml ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 5,8 ml glutaminerstatning, 5,8 ml 1 M HEPES og 5,8 ml penicillin-streptomycin-nystatinopløsning.
- Forbered en suspension indeholdende 2 × 106 ZsGreen1-udtrykkende humane fedtmikrovaskulære endotelceller (HAMEC-ZsGreen1) og 6 × 106 dental pulp stamceller (DPSC'er) i 10 ml endotelcellemedium.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 200 × g i 4 minutter for at opnå en cellepellet. Aspirere supernatantmediet.
- Cellepilleten resuspenderes i 1 ml rhCollMA-bioink, der er fremstillet tidligere (indeholdende PEO-LAP), for at opnå en bioink med en samlet cellekoncentration på 8 × 106 celler pr. 1 ml bioink.
FORSIGTIG: Når du har kombineret bioink med cellerne, skal du straks gå videre til næste trin. Hvis celler efterlades i suspensionen i lang tid, vil cellerne synke til bunden af røret, og deres levedygtighed vil forringes. For eksperimenter, der ikke involverer celler, skal du enten springe trin 5.1-5.5 over eller inkorporere fluorescerende perler med bioink i stedet for celler for forbedret mikroskopisk visualisering af de trykte konstruktioner. - Overfør celle-bioink-blandingen til udskrivningspatroner.
- Monter en kanyle med indvendig diameter på 0,22 mm på en 3 ml gul printerpatron, og anbring patronen i et 50 ml konisk rør.
- Overfør 1 ml af celle-bioink-blandingen til udskrivningspatronen ved at fylde den fra toppen ved hjælp af en positiv forskydningspipette for at reducere bobler.
- Installer udskrivningspatronen i det relevante værktøj på bioprinteren.
6. Bioprinting af mikrovaskulære netværk ved hjælp af rhCollMA bioink
- Opret et 3D CAD-design til det bioprintede mikrovaskulære netværk.
- Skitse et 2D-mønster af en 4 mm firkant indeholdende en cirkulær kanal med en diameter på 2 mm i midten. Skitsen ekstruderes med 4 mm for at opnå en terning på 4 mm x 4 mm x 4 mm med en central kanal. Eksporter dette objekt som en . STL-fil.
- Importer en 12-brønds plade . STL-skabelon i den solide modelleringsfane i bioprinteropskæringssoftwaren, og placer den i det udpegede område af den virtuelle printseng.
- Importer . STL-fil af terningformen i den solide modelleringsfane i bioprinterudskæringssoftwaren. Klik på afkrydsningsfeltet Brug ekstern udsnitsværktøj | konfigurer udsnit under afsnittet objektegenskaber . I pop op-vinduet skal du vælge et retlinet mønster til fyldmønsteret og skrive 30% i fyldtætheden. Klik på Acceptér.
- Placer en kopi af terningformen i hver ønsket virtuel brønd ved at klikke på terningen og flytte den ved hjælp af musen.
- Opret nye materialeindstillinger for rhCollMA bioink i fanen Materialer i bioprintersnitssoftware ved at klikke på knappen Tilføj materiale . Vælg materialets indstillinger til udskrivning. For tryk, skriv 2 psi i den tilsvarende boks. For hastighed skal du skrive 20 mm/s i den tilsvarende rubrik.
BEMÆRK: Hvert bioinkmateriale har sine egne forskellige udskrivningsindstillinger, der kan gemmes på materialelisten i applikationen. - Tildel værdierne for linjebredde og linjehøjde til 0,24 mm og accelerationsværdien til 400 mm/s2 ved at skrive disse værdier i de tilsvarende felter.
- I den solide modelleringsfane skal du klikke på terningobjektet og derefter klikke på rhCollMA-materialet fra materialeafsnittet for at tildele det til terningformen. På fanen biomontering skal du klikke på knappen Send udskriftsjob for at sende udskriftsjobbet til bioprinteren.
- Læg udskrivningspatronen, der er fyldt med den cellulære bioink, i det 3 ml omgivende pneumatiske dispenserværktøj på den 3D-ekstruderingsbaserede bioprinter.
- Indstil printlejetemperaturen til 4 °C ved at klikke på køleknappen under fanen Kontrol-opvarmning/køling på skærmen i bioprinterinterfacet. Læg pladen med støttebadet på printerlejet.
BEMÆRK: Materialets indstillinger for tryk og hastighed kan ændre sig på grund af forskelle i omgivelsestemperatur eller variation i bioinkbatchen. For eksempel er der på koldere dage behov for et højere tryk eller langsommere hastighed for at ekstrudere den samme mængde materiale. - I udskrivningsfanen på skærmen med bioprintergrænsefladen skal du klikke på udskriftsjobbet, der blev sendt i trin 6.7. , og klik på start | gå for at starte udskriftsjobbet.
- Efter udskrivning udsættes brøndpladen for en 405 nm lyskilde med en intensitet på 3 mW/cm2 i 30 s for at starte tværbindingen af rhCollMA-bioink.
- Efter tværbinding inkuberes brøndpladen ved 37 °C og 5 % CO2 i mindst 20 minutter, indtil hele støttebadet smelter.
- Aspirer forsigtigt det flydende støttebad og udskift det med endotelcellemedium. Konstruktionerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 , indtil de anvendes i yderligere trin.
BEMÆRK: På grund af sammentrækningen af konstruktionen efter udskrivning anbefales det at udføre monteringstrin 7 samme dag som trin 6.
7. Montering af det bioprintede mikrovaskulære netværk med vaskulærstilladset for at opnå den konstruerede vaskulariserede klap
- Umiddelbart efter fjernelse af støttemateriale af det bioprintede mikrovaskulære netværk anbringes et fibronektinbelagt PLLA: PLGA vaskulært stillads i hovedkanalen i den bioprintede struktur.
- Inkuber de samlede konstruktioner ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 dage.
- Beklæd lumen i vaskulærstilladset med endotelceller.
- Der fremstilles en cellesuspension af tdTomato-ekspressive humane fedtmikrovaskulære endotelceller (HAMEC-tdTomato) i en koncentration på 1 × 107 celler/ml.
- Placer en 20 μL dråbe af denne cellesuspension på en hydrofob overflade (dvs. en ikke-vævskultur [nonTC] 10 cm skål).
- Placer forsigtigt de vaskulære stilladser oven på dråben, således at stilladsets lumen i den ene ende kommer i kontakt med celledråben.
- Aspirer dråben fra den modsatte ende af stilladset (dvs. den ende, der ikke kommer i kontakt med dråben), og fyld dens lumen med celleophænget.
- Placer det podede stillads i et mikrocentrifugerør og læg det i en rotator inde i en befugtet inkubator i 60 min. Overfør derefter stilladset til en 12-brøndplade og tilsæt 2 ml endotelcellemedium.
- Kultur de konstruerede klapper i 7 dage, mens du udskifter mediet hver 2. dag med frisk endotelcellemedium.
8. Konfokal mikroskopi og immunfluorescensfarvning af de konstruerede klapper
- Efter 4 dage og 7 dages dyrkning skal du udføre levende cellebilleddannelse af de samlede stilladser ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop.
- Definer fluorescenskanalerne for ZsGreen1 og tdTomato fluorescerende proteiner på mikroskopets billedoptagelsessoftware.
- Vælg et 5x/0,16 objektivobjektiv med 0,5x zoom (pixelstørrelse 5 μm), og definer en Z-stak med 22 udsnit med en tykkelse på 41 μm hver.
- Definer en 3 x 2 flisescanning for at afbilde og fange hele konstruktionen.
- Juster laserintensiteten og forstærkningsværdierne for at opnå et klart fluorescerende signal uden mætning og minimal baggrund, og få billederne.
- Udfør en maksimal intensitetsprojektion af den erhvervede Z-stak for at opnå et enkelt 2D-billede ved hjælp af mikroskopbilledoptagelsessoftwaren eller lignende billedanalysesoftware.
- Udfør billeddannelse med højere forstørrelse af et område af interesse.
- Skift til et 10x/0,3 objektivobjektiv med 0,5 zoom (pixelstørrelse 1,25 μm), og definer en Z-stak med 9 skiver tykkelser på 41 μm.
- Udfør trin 8.2.-8.3.
- Efter 7 dages kultur fikseres de konstruerede klapper ved at nedsænke dem i 4% paraformaldehyd i 20 minutter.
- Vask konstruktionerne 3x 5 min med PBS.
- Der tilsættes 0,3% (v/v) Triton-X i PBS til konstruktionerne og inkuberes i 15 min ved stuetemperatur for at permeabilisere cellerne.
- Vask konstruktionerne 3x 5 min med PBS.
- Der fremstilles en blokerende opløsning ved at opløse 5 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Tilsæt blokeringsopløsningen til de konstruerede klapper og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered den primære antistofopløsning ved at fortynde muse-anti-glat muskel actin (anti-SMA) 1:50 antistof i 5% BSA-opløsningen, der tidligere er fremstillet til at plette de SMA-ekspressive støtteceller.
- Stilladserne inkuberes i den primære antistofopløsning natten over ved 4 °C.
- Vask 3x 5 min med PBS.
- Den sekundære antistofopløsning fremstilles ved fortynding af Cy3-konjugeret gede-antimus IgG 1:400-antistof og 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 2,5 μg/ml) i PBS.
- Påfør den sekundære antistofopløsning på stilladserne og inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur.
- Vask 3x 5 min med PBS.
- Konstruktionerne opbevares ved 4 °C i PBS i op til 1 måned.
- Forestil dig de farvede stilladser ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop.
- Definer de tre fluorescenskanaler (DAPI, ZsGreen og Cy3) på mikroskopets billedoptagelsessoftware.
- Definer en Z-stak med en sektionstykkelse på 2 μm, der spænder over en samlet tykkelse på 50 μm. Definer derefter en feltscanning for at afbilde større områder af konstruktionen.
- Juster anskaffelsesparametrene for at opnå et klart fluorescerende signal uden mætning og minimal baggrund.
- Få billederne ved hjælp af 20x / 0.8 mål med 1.0x zoom (pixelstørrelse 0.31 μm).
- Udfør en maksimal intensitetsprojektion af den erhvervede Z-stak for at opnå et enkelt 2D-billede ved hjælp af mikroskopbilledoptagelsessoftwaren eller lignende billedanalysesoftware.
9. Anastomosering af den konstruerede klap direkte til en rottes lårbensarterie ved hjælp af en manchetteknik
- Forbered og steriliser (autoklave) følgende kirurgiske værktøjer: Nr. 15 skalpel, et par fintandede tang og et lille par ringhåndtagede sakse. Derudover skal du forberede og sterilisere følgende mikrokirurgiske værktøjer: en lige fin spids nr. 3 juvelertang, en vinklet juvelers tang, en rundhåndet nåleholder med buede kæber, et par kardilatatorer, dissekeringssaks, adventitia saks samt karklemmer med deres applikator.
- Der fremstilles en opløsning af 100 IE/ml hepariniseret saltvand ved fortynding af 5 ml stamheparinopløsning med 195 ml saltvand.
- Skær og steriliser polyimidmanchetter.
- Skær 2,5 mm sektioner af et polyimidrør under et dissekeringsmikroskop.
- I den ene ende af hver sektion skal du lave et 1,25 mm snit i rørets væg for at opnå et manchethåndtag. Lav et vinklet snit i den anden ende af røret for at lette fartøjets eversion.
- Nedsænk manchetterne i 70% ethanol efterfulgt af to vaske med hepariniseret saltvand.
- Forbered en mandlig Sprague-Dawley rotte (275-350 g) til operation.
- Syv dage før operationen skal du begynde at administrere en subkutan daglig dosis cyclosporin (10 mg kg-1) for at opnå immunundertrykkelse.
- Før operationen bedøves dyret ved hjælp af 3% isofluranindånding i henhold til institutionel SOP ved hjælp af et induktionskammer. Bekræft dyb anæstesi ved at klemme begge fødder og kontrollere for reflekser.
- Administrer en subkutan dosis smertestillende buprenorphin (0,03 mg kg-1) og antikoagulerende heparin (200 IE kg-1).
- Påfør en smørende øjensalve på dyrets øjne for at forhindre dehydrering.
- Barber det kirurgiske område af rotten og desinficer stedet med jod og derefter 70% ethanol. Fastgør dyrets lemmer til bordet ved hjælp af tape.
- Udsæt og isoler den fælles lårbensarterie.
- Lav et 2 cm langt, skråt snit gennem huden langs konkavitet mellem benet og maven.
- Brug pincet og stump saks, frigør huden fra det underliggende væv for at visualisere den inguinale fedtpude.
- Brug saks og tang til at skære lige gennem fedtpuden omkring de øvre, mediale og nedre margener. Vær opmærksom på ikke at skære store kar under fedtpuden.
- Reflekter fedtpuden sideværts, og lad de epigastriske kar være intakte. Læg en våd gasbind på den reflekterede fedtpude for at forhindre tørring og fastgør den på plads. Sørg for, at de fælles lårbensfartøjer er synlige.
BEMÆRK: Fedtpuden vil senere blive brugt til at påføre blødt tryk på anastomoserne. - Udsæt lårbensarterien fra lyskebåndet proximalt til den epigastriske arterieforgreningspunkt distalt ved at udtrække den fra sin kappe.
FORSIGTIG: Der er normalt en gren af lårbensarterien, der løber under den, almindeligvis kaldet Murphys gren. Vær opmærksom på ikke at beskadige denne vanskelige at se gren. - Del Murphys gren ved at ligatere den, og ligat derefter lårbensarterien med to ligaturer i midten af arterien med en afstand på 1 mm fra hinanden. Hold den ene ende af ligatursuturen lang for senere at bruge til at trække karenden gennem manchetten.
- Skær arterien mellem de to ligaturer ved hjælp af adventitia saks.
FORSIGTIG: Der bør ikke være nogen blødning, når du udfører dette snit. Hvis den arterielle ende bløder, skal du klemme arterien og anvende en ligatur igen. - Brug den lange ende af ligatursuturen til at indsætte hver beholderende i en polyimidmanchet, som forberedt i det foregående trin, således at de to manchetters håndtag peger væk fra hinanden.
- Efter isætning påføres en klemme samtidigt på manchethåndtaget og beholderen, og fastgør manchetten på plads.
- Forbered en hepariniseret saltopløsning i en sprøjte udstyret med en 27 G nål.
- Træk i den ligerede karende og skær den tæt på ligaturen. Vask straks karenden grundigt med den hepariniserede saltvand, indtil der ikke er noget blod synligt i lumen.
FORSIGTIG: Sørg for, at karenden vaskes godt, da alt blod, der efterlades indeni, danner en blodprop, som vil blive introduceret til blodbanen, når proceduren er afsluttet. Dette kan føre til okklusion af fartøjet og tab af perfusion til benet. - Udvid fartøjets lumen ved at holde det ved dets kappe med den ene hånd og udvide dets lumen med kardilatatoren med den anden hånd.
- Placer en løs 6-0 polypropylen omkreds sutur rundt om manchetlegemet. Evert fartøjet slutter ved hjælp af to kardilatatorer over manchetlegemet og fastgør det på plads ved at stramme omkredssuturen.
BEMÆRK: Hvis der lækker blod gennem den fastspændte beholder under manipulationerne, skal du vaske lumen grundigt med hepariniseret saltvand. - Skyl den konstruerede klap med hepariniseret saltvand, og indsæt derefter den karforede manchet i lumen på det vaskulære stillads. Fastgør stilladset på plads ved at placere en omkreds 6-0 polypropylen sutur rundt om stilladset og manchetlegemet. Gør dette trin for begge sider af vaskulærstilladset.
- Pak et 0,2 μm polystyrenmembranfilter rundt om anastomosestedet for at isolere den konstruerede klap fra det omgivende væv.
- Slip den distale klemme først; Slip derefter den proksimale klemme for at genoprette blodgennemstrømningen gennem karret.
- For at stoppe enhver blødning gennem anastomoserne skal du reflektere fedtpuden tilbage over lårbenskarrene og anvende et blidt tryk ved hjælp af en steril gasbind i 3 minutter.
- Sutur fedtpuden tilbage på plads ved hjælp af 6-0 polypropylen; sutur derefter huden ved hjælp af 5-0 PGA absorberbare suturer.
- Rengør sårområdet med saltvand og påfør jodopløsning.
- Til postoperativ smerte og dyreforvaltning skal du forberede en 0,1% (v / v) tramadol i drikkevand. Desuden administreres en daglig dosis heparin (200 IE kg-1) og cyclosporin (10 mg kg-1).
- Placer dyret i et rent bur i sig selv placeret under en varmelampe. Fortsæt med at overvåge dyret, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
Representative Results
Denne protokol beskriver fremstillingen af en konstrueret klap sammensat af et vaskulært stillads (figur 1Ai) og en bioprintet mikrovaskulatur (figur 1Aii), som blev samlet for at opnå mesoskala og mikroskala vaskulaturer (figur 1Aiii). Efter protokollen blev BVOH-forme af vaskulærstilladset designet og 3D-printet (figur 1B, C). De opnåede trykte strukturer blev visuelt inspiceret for små tråde af BVOH, som kunne findes i formenes tomme rum (figur 1D). Disse tråde indikerer normalt forkerte materialeindstillinger, eller at BVOH har absorberet fugt. Disse tråde skal fjernes, da de kan føre til ufuldstændig påfyldning af formen og strukturelle defekter i det resulterende vaskulære stillads. Derefter blev formene fyldt med PLLA: PLGA-opløsning efterfulgt af frysetørringsprocessen og vasketrinnene som beskrevet i protokollen. Det opnåede PLLA: PLGA vaskulære stillads blev visuelt inspiceret for at verificere beholderens vægintegritet og lumenpatency (figur 1E).
En neutraliseret rhCollMA bioink i en koncentration på 10 mg/ ml blev fremstillet og kombineret i et forhold på 1: 1 med PEO: LAP-opløsningen. Humane fedtmikrovaskulære endotelceller mærket med Zs-Green1 og tandmasse stamceller blev resuspenderet med rhCollMA bioink, og opløsningen blev indlæst i en udskrivningspatron og på printeren. Kasseformer med en central kanal med et retlinet mønster (figur 1D) blev bioprintet inde i gelatinestøttebadet. Efter udskrivning blev konstruktionerne tværbundet, og støttebadet blev opløst og vasket. Efter 4 dages kultur blev konstruktionerne live-imaged for at kontrollere for mikrovaskulær netværks selvmontering. Figur 1D viser et eksempel på et højt udviklet HAMEC-ZsGreen1 mikrovaskulært netværk i den bioprintede konstruktion.
Dernæst blev et fibronectinbelagt vaskulært stillads indsat i den centrale kanal i den trykte konstruktion (figur 2A). De samlede konstruktioner blev dyrket i 2 dage, hvor cellerne kontraherer gelen og fastgør den fast til vaskulærstilladset. Derefter blev det vaskulære stillads foret med HAMEC'er, der udtrykte tdTomato, ifølge protokollen. Efter 7 dages kultur blev konstruktionerne rettet og afbildet. Figur 2B viser et sidebillede af de samlede konstruktioner, hvor endotelcellerne i den bioprintede mikrovaskulatur er afbildet med grønt, mens endotelforingen på det vaskulære stillads er afbildet med rødt. Billedet viser en grøn mikrovaskulær selvsamling i den bioprintede gel, mens det vaskulære stillads er foret med røde endotelceller. Ved højere forstørrelse ses spirer, der stammer fra den røde endotelforing, spire og anastomosere med det bioprintede mikrovaskulære netværk (figur 2C). Dernæst blev konstruktionerne farvet til α-glat muskel actin (SMA) som en markør for tandmasse stamceller. Efter immunostaining blev konstruktionerne afbildet ved hjælp af et laserscanning konfokalt mikroskop (figur 2D).
Endelig, efter 7 dages kultur, blev de konstruerede klapper mikrokirurgisk anastomoseret til en rottes lårbensarterie, som beskrevet i protokollen. En video af en repræsentativ procedure kan ses i Supplerende video S1. Figur 2E viser et repræsentativt billede af en afsluttet anastomose før fjernelse af klemme, og figur 2F viser et repræsentativt billede af anastomosestedet efter fjernelse af klemme og hæmostase. Der må ikke være nogen synlig blødning før sårlukning.
Figur 1: Repræsentative billeder af de fremstillede meso- og mikroskalabeholdere. (A) Skematisk oversigt over protokollens trin. Gengivet med tilladelse16. (B) CAD-design til offerformen på vaskulærstilladset. (C) Sidebillede af en repræsentativ 3D-printet offerform (skalabjælke = 0,5 mm). (D) Øverste visning af offerform (skalastang = 0,5 mm) (E) Repræsentativ vaskulært stillads fremstillet ved hjælp af beskrivelsesprotokollen (skalabjælke = 5 mm). (F) CAD-design til det 3D bioprintede rhCollMA mikrovaskulære netværk. Gitterlinjer = 1 mm. (G) Repræsentativt billede af et højt udviklet bioprintet vaskulært netværk, der viser HAMEC-ZsGreen1 i grønt. Skala bar = 200 μm. Forkortelser: CAD = computerstøttet design; rhCollMA = rekombinant humant kollagenmethacrylat; HAMEC = humane fedtmikrovaskulære endotelceller; PLLA = poly-L-mælkesyre; PLGA = polymælke-co-glycolsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder af den samlede vaskulariserede klap. (A) Et fotografi af en repræsentativ samling af bioprintet mikrovaskulatur og vaskulærstilladset. Skalabjælke = 1 mm. (B) Sidebillede af en repræsentativ konstrueret klap afbildet 4 dage efter endotelforing af vaskulærstilladset. Den bioprintede mikrovaskulatur er vist i grønt (HAMEC-ZsGreen1), mens endotelforingen er vist med rødt (HAMEC-tdTomato). Skalabjælke = 1 mm. (C) Repræsentativt billede af anastomoser mellem den bioprintede vaskulatur i grønt og endotelforingen i rødt. Skala bar = 200 μm. (D) Repræsentativt billede af immunostaining for glat muskel actin (rød), kerner (blå) og endotelceller (grøn) efter 7 dages inkubation. Skalabjælke = 0,1 mm. (E) Repræsentativt billede af en færdig anastomoser af den konstruerede klap med en rottes lårbensarterie før klemmefjernelse og (F) efter fjernelse af klemme. Forkortelser: HAMEC = humane fedtmikrovaskulære endotelceller; SMA = glat muskel actin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video S1: Repræsentativ mikrokirurgisk procedure til anastomosering af vaskulærstilladset til en rottes lårbensarterie. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Engineering vaskulariserede væv er en af de største udfordringer ved vævsteknik20. Nuværende metoder til fremstilling af konstrueret vaskulært væv fokuserer på at skabe selvsamlet mikrovaskulatur21,22,23 eller fremstilling af mesoskala vaskulære stilladser24,25 og ikke på genskabelse af et system af hierarkisk vaskulatur, som kan perfunderes straks og direkte ved implantation26 . I dette arbejde beskriver vi en protokol, der gør brug af to 3D-printmodaliteter til at fremstille et hierarkisk fartøjsnetværk sammensat af mikroskala og mesoskala vaskulaturer. Protokollen kombinerer et 3D bioprintet, selvsamlet mikrovaskulært netværk med et mesoskala vaskulært stillads, der opnår en implanterbar, vaskulariseret klap. Desuden præsenterer dette papir en protokol til direkte anastomosering af denne klap til en rottes lårbensarterie.
3D-bioprinting har fået interesse i de senere år på grund af dets alsidighed over traditionelle vævstekniske teknikker. Mens denne protokol beskriver dannelsen af et mikrovaskulært netværk i rhCollMA bioink, kan de anvendte metoder anvendes med få ændringer på mange andre bioinks fra overfloden af studerede og nye bioinks og støttebade27,28. Vi valgte at bruge rhCollMA som bioink på grund af overfloden af type I kollagen i den humane ECM, hvilket giver et passende miljø til cellebinding. Desuden produceres det rekombinant i planter og modificeres yderligere med methacrylatgrupper, hvilket muliggør fotopolymerisering og dannelse af stabile 3D-hydrogeler29,30. Photocrosslinking blev opnået ved tilsætning af fotoinitiatoren LAP, som har vist sig at være giftfri og aktiveres ved udsættelse for 405 nm blåt lys, hvilket reducerer den mulige fototoksicitet af UV-lys. Anvendelsen af lysfølsomme bioinks nødvendiggør imidlertid anvendelse af et phenolrødfrit kulturmedium til fremstilling af bioink og støttematerialet. Desuden beskriver protokollen brugen af gelatinestøttemateriale, som muliggør ekstrudering af bioinks såsom rhCollMA med høj nøjagtighed. Det er således afgørende at sikre brugen af koldt medium under dets forberedelse og afkøling af printerlejet. Overdreven opvarmning kan forekomme på grund af den lyskilde, der bruges til tværbinding eller fra forhøjede omgivelsestemperaturer.
En ekstruderingsbaseret bioprinter er blevet brugt her til at skabe det bioprintede mikrovaskulære netværk, og der er i øjeblikket mange kommercielt tilgængelige bioprintere, der kan generere lignende konstruktioner. Desuden kan de foreslåede metoder let ændres og anvendes til at studere forskellige geometrier, størrelser og udfyldningsmønstre. I dette arbejde blev der valgt et retlinet udfyldningsmønster for at skabe sammenkoblede porer, og dette kan udskrives relativt hurtigt med høj troskab.
Luftbobler introducerer en betydelig udfordring i ekstruderingsbioprint, især inden for støttematerialer. Derfor er det afgørende at minimere tilstedeværelsen og dannelsen af disse bobler ved at anvende positive forskydningspipetter til overførsel af støttematerialet, fremstilling af bioinkcellesuspensionen og deres overførsel til trykpatronerne.
I dette arbejde blev humane fedtafledte endotelceller og tandmasse stamceller anvendt som støtteceller på grund af deres relativt lette isolering fra patienter. Desuden blev der valgt en samlet cellekoncentration på 8 x 106 celler / ml, da denne koncentration har vist sig at etablere de mest udviklede vaskulære netværk16. Mens denne protokol kan anvendes til at generere mikrovaskulatur ved hjælp af forskellige celletyper og kilder samt forskellige bioinks, skal der foretages en kalibrering af cellekoncentration for at etablere de bedste betingelser for udviklingen af det mikrovaskulære netværk. Desuden kan vævsspecifikke celler (dvs. myoblaster eller osteoblaster) inkorporeres i bioink for at opnå vævsspecifikke vaskulariserede klapper.
Formen til det porøse vaskulære stillads blev fremstillet ved hjælp af 3D-printet vandopløseligt materiale på en kommercielt tilgængelig ekstruderings-3D-printer. Dette resulterer i en omkostningseffektiv teknik baseret på rapid prototyping platforme, således at mange forskellige geometrier og størrelser af vaskulære stilladser kan studeres og screenes hurtigt31. Ikke desto mindre er en begrænsning af denne metode opløsningsgrænsen for de fleste 3D-printere32. Men med den hurtigt udviklende industri omkring additiv fremstilling forventes disse grænser at blive forbedret over tid. Anvendelsen af organiske opløsningsmidler til fremstillingsprocessen er en anden begrænsning af protokollen, da de fleste organiske opløsningsmidler er giftige for celler, hvilket forhindrer evnen til at kombinere bioprintproceduren med vaskulær stilladsfremstillingsprocessen.
Den beskrevne metode til såning af stilladsets lumen ved hjælp af aspiration i modsætning til at skubbe cellesuspensionen har store virkninger på lokaliseringen af de podede celler. Brug af undertryk muliggør endotelisering af stilladsets indre lumen, samtidig med at enhver spild af celleophænget minimeres gennem perforeringerne på stilladsets væg16.
Den beskrevne "manchet" -metode til mikrokirurgiske anastomoser kan let ændres og tilpasses forskellige vaskulære stilladsmaterialer eller størrelser samt til forskellige arterier og vener i en bred skala af dyremodeller. Tilpasningerne til protokollen ville omfatte forskellige polyimidrørstørrelser og suturstørrelser. Denne metode kræver ikke perforering af stilladsvæggen, hvilket kan føre til udvikling af defekter. Dette arbejde præsenterer en protokol, der kan udvides til mange applikationer. De kritiske aspekter af denne protokol, som omfatter fremstilling af meso- og mikroskala vaskulatur og deres samling og implantation, repræsenterer kritiske aspekter af konstruerede klapper både til rekonstruktive applikationer samt vaskulære og andre vævstekniske undersøgelser.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 818808). rhCollMA blev generøst leveret af CollPlant (Rehovot, Israel). Forfatterne takker Technions prækliniske forskningsmyndighed for hjælpen med dyrepleje samt Janette Zavin, Galia Ben David og Idan Redenski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G.
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
