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冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

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DOI：

10.3791/63923

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2022年7月12日

 ,  ,  , 
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å 的冷冻电子断层结构的逐步操作流程。

摘要

近年来，冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）发展迅速，尤其是在直接电子探测器、改进的自动化采集策略、拓展了冷冻电子断层扫描高分辨率成像能力的样品制备技术，以及新型亚断层平均软件相继问世之后。此外，数据采集流程日益简化，使越来越多的用户能够便捷地使用该技术。SARS-CoV-2 大流行进一步推动了全球许多机构远程进行冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据采集的发展，尤其是单颗粒冷冻电镜技术，使得在疫情期间用户仍能持续访问最先进的仪器设备。随着 Tomo5（用于三维电子断层扫描的软件）的最新进展，远程进行冷冻电子断层扫描数据采集已变得稳定且易于在全球任何地点操作。本文旨在提供详细的流程指南，从断层扫描软件中的数据采集设置开始，逐步介绍（远程）冷冻电子断层扫描数据采集会话的具体操作及详细故障排除方法。此外，本文还结合使用 apoferritin 作为示例，介绍了通过 emClarity 软件进行亚断层平均以实现近原子分辨率结构解析的工作流程，以进一步完善（远程）数据采集方案。

引言

冷冻电子显微镜（cryo-EM）被广泛认为经历了一次复兴，从而迅速发展成为结构生物学中一项核心且极为重要的工具。直接电子探测器1,2,3的发展与应用、显微镜和电子源的改进3,4,5、自动化与通量的提升6,7,8,9，以及单颗粒分析10,11,12,13,14和电子断层成像技术15,16,17在计算方法上的进步，共同促成了该技术近年来的成功。这些技术进步推动了cryo-EM在低温和近天然条件下解析生物大分子结构的能力。目前可常规达到的分辨率已足以支持原子级精度的结构建模，使该技术跃居结构生物学领域的前沿。长期以来，在大分子晶体学（MX）中，通过简化策略表达并纯化感兴趣的生物靶标，已被证明在基础生物学研究、药物发现和转化科学中行之有效。采用类似策略，cryo-EM如今已能够提供与高分辨率MX研究相媲美的结果。目前结构生物学中cryo-EM领域的主要成功应用被称为单颗粒分析（SPA），该方法通常对纯化的蛋白质样品获取二维投影图像18，从而获得生物大分子的数千个不同视角19。这些图像（1）包含了来自多个取向的信息，足以完整表征目标分子在三维空间中的所有取向；（2）记录了分子构象的异质性，后续可对其进行分离与深入分析。

获取生物样品这些二维投影图像的另一种方法是冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET），该方法甚至可在未纯化的情况下实现原位（in situ）成像。cryo-ET 通过机械旋转样品，从不同倾斜角度对同一对象采集一系列图像。因此，单颗粒分析（SPA）中所获得的、代表目标分子不同取向姿态的二维投影图像，本质上可作为 cryo-ET 成像实验的一部分被直接采集20。随后，将断层扫描倾斜系列图像重构为断层图（tomogram），其中包含所成像大分子复合物的三维结构信息。断层数据采集的特性在一定程度上降低了对二维图像进行平均处理以获得完整三维结构的依赖性。然而，由于当前样品台的设计限制，样品通常只能在 −60° 至 +60° 范围内倾斜，导致断层三维重构中存在信息缺失的“缺失楔形区”（missing wedge）21。

单个断层图中的三维重建存在信息缺失楔形区域以及信噪比较低的问题。可通过提取单个大分子作为子断层图并进行平均化处理来应对这一挑战。当每个子断层图中的大分子处于不同取向时，目标物体的缺失楔形区域在各个子断层图中的方向也各不相同，因此通过对大量拷贝进行平均化，可填补因缺失楔形区域造成的信息空缺。近年来的图像处理技术发展还尝试训练人工智能神经网络，以有意义的数据填补缺失楔形区域22。该平均化过程还能提高信噪比，类似于单颗粒分析中平均化的目标，从而提升重建的质量与分辨率。如果目标分子具有对称性，则可在平均化过程中定义并利用这种对称性，进一步提高重建分辨率。从断层图中提取大分子的三维体积形成一组子断层图，并对其进行后续处理的过程被称为子断层图平均化（subtomogram averaging, STA）23。由于每个子断层图代表所研究分子的一个独特拷贝，因此可利用STA工作流程探究任何结构异质性。与单颗粒分析（SPA）工作流程中常用的方法类似，分类技术也可应用于STA过程中，以解析目标复合物的构象状态。除了使冷冻电子断层扫描（cryo-ET）实现高分辨率重建外，该方法还使该技术成为研究大分子在其天然细胞环境中结构机制或那些通常难以适用于SPA的研究目标的有力工具24,25,26。

电子断层扫描技术长期以来一直用于在室温下测定细胞样本的三维超微结构27通过物理倾斜样品获取图像，可为细胞尺度下物体的三维重构提供足够的信息，尤其当细胞结构缺乏可用于平均化的规则性时，该方法尤为重要。此外，也可将细胞冷冻固定在基底上，用于细胞边缘区域的冷冻电子断层成像，这些区域的样品足够薄，能够达到电子透明。在此条件下，尽管要求样品足够薄以实现电子透明，仍可应用亚断层平均化技术（STA）来解析细胞环境中的大分子结构。28然而，当结合其他制样技术，包括冷冻关联光学与电子显微镜技术（cryo-CLEM）和聚焦离子束切削技术（cryo-FIB）时，冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）可用于在低温条件下对完整细胞内部进行成像29这结合了冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）研究细胞超微结构的能力与亚tomogram平均法（STA）解析大分子复合物结构的能力。 原位 同时确定其细胞定位30 并提供参与动态过程的复合物的快照31该技术在多个研究中对细胞样本进行成像并应用STA的能力，凸显了其在解析大分子结构方面的强大优势。 原位 即使在与单颗粒分析相当的分辨率下32另一个优势在于能够获知大分子的原始位置，该信息由断层图中最终分类得到的三维重构结果所呈现30因此，大分子结构可与细胞超微结构相关联。这种跨尺度的观察有望在功能研究背景下，将结构机制与细胞变化相关联，从而获得重要发现。

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）与亚层析平均法（STA）支持三种主要的数据采集工作流程：分子断层扫描、细胞断层扫描和薄片断层扫描。通过分子断层扫描，可利用冷冻电子断层扫描技术解析纯化的大型复合物的结构。当细胞足够薄时，在其细胞环境中直接测定蛋白质结构的过程可称为细胞断层扫描。近年来，随着低温靶向与切削技术的发展，相同技术也可应用于薄片断层扫描工作流程中，以在天然环境中深入细胞内部解析蛋白质结构，同时揭示这些蛋白质所处的细胞背景。数据采集策略的选择取决于可用的软件包，更重要的是取决于样本的具体需求。通常情况下，纯化蛋白在铜制透射电镜载网上形成的分子或非贴壁样品需要的操作较少，因此在理想情况下能保持平整且不受损伤。可在带孔碳膜载网上系统性地连续设置电子断层图，从而快速获取数十至数百个断层图。对于载网上蛋白质丰度较高的分子断层扫描样品，用户最简单的设置方式是使用 Tomo5（本研究中用于三维电子断层扫描的软件，参见材料表）。其他断层扫描软件如 Leginon9 和 serialEM6 也可使用；它们提供了更多自定义设置选项，适用于个性化的数据采集方案，但操作更为复杂，尤其对刚接触断层扫描的用户或远程访问会话的用户而言，学习和操作难度更高。对于拥有大量且多样化用户的设施而言，Tomo5 在远程环境中易于操作，也便于用户培训。对于贴壁细胞，载网通常需要更多的操作步骤，且必须使用更脆弱的金载网，因此在操作和数据采集策略上需要更加谨慎。为了便于定位感兴趣的细胞区域，并避免在高倾转角度下载网本身造成遮挡，使用更大网孔尺寸的载网是有利的，但其固有的脆弱性也随之增加。对于薄片样品，样品的脆弱性取决于薄片的质量，而薄片质量可能存在差异。这些因素增加了设置时间和注意事项，但 Tomo5 所具备的更高适应性和稳健性使其仍适用于此类数据采集。然而，每种工作流程中均存在特定的数据采集场景。BISECT 和 PACE-tomo（均在 SerialEM 中运行）引入了在断层扫描采集过程中通过脚本控制电子束-图像偏移的技术，以提高断层图采集速度28，尤其适用于分子断层扫描。SerialEM 中的中等放大倍率拼图（MMM）6,7,33 可在所有工作流程中更有效地识别并精确定位分子特征，尽管在撰写本文时，这些功能正逐步在 Tomo5 中实现。

与单颗粒分析（SPA）类似，随着采集软件的改进以及大量可用于亚断层平均（subtomogram averaging）的软件包的出现，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和亚断层平均技术正变得越来越易于获取16,17,32,34,35,36,37,38。此外，在疫情期间，实现对冷冻电镜设备的远程访问已成为英国钻石光源（Diamond Light Source, DLS）下属的电子生物成像中心（eBIC）等国家级设施持续运行的关键。这些进展使得希望使用该技术的研究人员能够更便捷、更可靠地开展冷冻电子断层扫描研究。数据采集完成后，亚断层平均是分析重复出现的结构以获得最高分辨率重构结果，并实现大分子异质性分类的关键工具。本实验方案旨在详细演示如何准备冷冻透射电镜以进行冷冻电子断层扫描数据采集，并以脱铁铁蛋白（apoferritin）的分子电子断层数据集为例，说明如何使用emClarity进行亚断层平均分析。emClarity（用于高分辨率冷冻电子断层扫描和亚断层平均的软件，参见材料表）需要通过命令行运行脚本，因此默认使用者具备一定的Linux/UNIX系统操作基础。

远程连接依赖于各机构/设施的网络环境。在eBIC，远程系统使用特定程序 ，可在Diamond同步辐射光源所采用的特定网络配置下实现远程数据采集。远程连接显微镜通过两个平台实现：NoMachine和TeamViewer（见材料表）。用户可通过NoMachine程序登录远程Windows桌面。该由NoMachine提供的远程Windows桌面与显微镜处于同一网络中，因此可作为显微镜的虚拟辅助计算机。用户随后可通过TeamViewer从该虚拟辅助计算机连接至显微镜，从而直接访问并控制运行TUI和Tomo软件的显微镜计算机。

本实验方案包含两个部分（步骤1和步骤2）。步骤1重点介绍使用Tomo5软件（用于三维电子断层扫描）进行远程冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据采集。该操作流程通过（远程）会话逐步提高放大倍数获取图像，最终使用户能够指导断层扫描软件定位样品区域，以进行断层数据采集。图1总结了此过程。步骤2详细描述了使用emClarity软件（用于高分辨率冷冻电子断层扫描及亚断层平均化）进行cryo-ET STA数据处理的过程。图9总结了此过程。

本方案适用于远程操作场景。假设在显微镜现场操作并加载样品的人员已完成直接对准，并完成了相机调谐和增益参考采集。本方案基于配备自动进样器的三聚光镜系统。有关断层扫描软件的详细操作指南，制造商提供的详细手册可通过运行该软件的 Windows 开始菜单获取。

方案

本研究中使用的软件包部分可免费获得（参见材料表）。

1. 使用 Tomo5 进行远程冷冻电子断层扫描数据采集

  1. 如果软件未加载，请首先从透射电子显微镜（TEM）服务器计算机启动该软件（参见 材料表).
  2. 执行初步检查，并通过选择来配置成像条件 预设.
    1. 通过调整图像采集参数来开始会话设置 "准备" 标签下方 预设 (图 2A，B).
      1. 调节 "总览放大倍数" 根据网格大小和剂量调整以获得足够的计数。
        注意：如果未知网格类型的合适放大倍数，可在加载网格后返回此步骤。
      2. "居中高度" 和 "搜索放大倍数" 可以相同。点击 搜索 在 "断层扫描" 设置位置并确保放大倍数足以显示目标特征且适配视野 "暴露" 以及 "追踪/聚焦" 视野中的区域（图2C).
      3. 设置 "曝光放大倍数" 调整至所需的目标像素大小。如果该参数未知，则通过调节放大倍数，使视野范围恰好覆盖目标区域，从而确定目标像素大小。
    2. 将图像采集参数（曝光）复制到所有其他高倍率预设（Tracking、Drift、Focus、Thon Ring、Zero Loss）。操作方法为按下 设置 设置 "暴露" 连接到显微镜并 获取 以获得 "曝光设置" 在逐一选择后，应用于所有其他高倍镜。
      1. 调整曝光时间，尤其是对于 "聚焦" 和 "追踪" 以获得适当的计数，同时考虑60处的厚度°，即两者均在0时° 和 60°，以使足够数量的电子穿过样本，提供用于互相关的强信号。
        注意：作为估算，曝光时间对于 "追踪" 和 "聚焦" 等于 "暴露" 预设是一个良好的初步措施。以下是一个剂量计算的示例，用于 "暴露" 预设，参见 图3. 设置计算出的曝光时间 "暴露" 预设在 "准备" 表。
    3. 调节 "零损失预设" 使用更亮且更大的光斑尺寸（较大的光斑尺寸对应较小的数值），因为这需要更高的剂量。
      注意：此预设最适合用于校准显微镜上存在的能量过滤器狭缝。
  3. 按照以下步骤进行图谱采集。
    1. 要收集图谱，请点击 新会话 在 "图谱" 选项卡，设置会话参数，输入存储路径和输出格式，然后按下 应用选择 筛选 (图4）然后勾选所有要获取的图谱。选择 关闭色谱柱阀门 切勿无人看管显微镜；在所有选定的图谱收集完毕后，系统将自动关闭柱阀。要开始筛选，请按下 开始 按钮。
    2. 通过点击检查单个或多个图谱中的目标 网格 左侧面板下方 "筛选" (图4），然后单击鼠标左键并拖动以移动视图，使用鼠标中键滚轮进行缩放。选择 网格 目标设置时，选择它并点击 上样 从软件内部。
    3. 对于图像偏移校准，请继续使用图谱筛选选项卡在已加载的网格中导航。寻找一个在所有预设放大倍数下均可识别的特征，例如冰晶与孔洞边缘重叠的结构或其他可辨识的特征。图5）。通过鼠标右键单击移动到该方格，然后 "移动载物台至网格方格".
      注意：为正确执行图像偏移校准，载物台必须处于齐焦高度。
  4. 执行图像偏移校准。
    1. 在 "自动功能" 标签图6），将预设设置为 "居中高度"，导航至 "通过载物台倾斜实现自动欧几里得中心对齐"，然后按压 开始监控状态窗口，确保成功找到欧中心高度，并密切关注正负倾斜图像；二者必须相互对应。
      注意：从 Tomo 软件 5.8 版本开始，可修改接受同心高度的标准；默认值为 0.25 µm，并将其设定为0.5–0.8 µm 的取值提供了更大的灵活性。具体数值取决于显微镜的性能，但建议尽可能取较小值。
      1. 当处于欧中心高度且聚焦清晰时，将载物台上的某一特征置于视野中心。使用该状态采集预览图像。 "图谱" 预设。设置全部 "预设" 从 "准备" 随后，提高放大倍数至 概述 > 中心特征 > 预览，然后重复 "搜索放大倍数" 最后，" 曝光放大倍数".
    2. 如果在定位过程中该特征保持居中，则跳过图像平移校准。否则，进行图像平移校准，进入 "准备" 标签，选择 校准图像偏移，然后按压 开始 (图5）。这将迭代地将较低倍率图像与在曝光倍率下居中的特征对齐。
      注意：如果初始预设 "暴露" 此阶段未居中，重新居中时，软件将仅在此步骤使用载物台偏移。
      1. 按压 继续 对于 "暴露" 预设。接下来显示的图像将是 "搜索预设"为了校准预设之间的图像偏移，双击左侧 "搜索" 预览中心位置 "暴露" 预览，然后按 重新获取 (图5）。点击 继续 转到下一组预设。
        注意：如果在此次校准过程中应用了图谱放大倍率下的图像偏移，请在校准完成后重新采集图谱。选择所需的图谱并按下 重置已选内容 在上方面板中 "图谱" 确认并重新开始获取该图谱。
  5. 进行断层扫描设置。
    1. 创建断层扫描数据采集设置 "断层扫描" 表。
      注意：除非另有说明，所有操作均完全在 "断层扫描" 表。
    2. 开始 新会话。在 "实验设置" 用于生物样本，选择 板状 作为样本类型并选择 批次 和 低剂量，选择输出格式和存储文件夹，可选地添加电子邮件收件人，然后按下 应用.
      注意：A "批次位置" 菜单项 现在可获得（图7A当前加载的图谱会自动导入。 "概述" 和 "搜索图像" 可获取并重复查看，直至获取新图像。此外，从5.8版本开始，可获取3 x 3、4 x 4和5 x 5图块的搜索图 "获取搜索图谱" 以方便目标定位和设置。它们对应于中等放大倍数拼接图像的版本。
    3. 要设置目标，请前往 "图谱箭头"，找到感兴趣区域，通过右键单击弹出的选项移动至该位置。拍摄一张概览图像以确认适合进行齐焦高度调节的位置，然后按下 自动正交中心化；这将运行通过载物台倾斜实现的等中心校准程序。然后，重新获取一幅新的概览图像，以更新等中心高度。
      注意： "自动聚焦" 如果位置处于欧中心高度，则无需使用按钮。若欧中心高度的图像明显失焦，说明欧中心高度可能不正确，需要重新调整（有关欧中心高度的故障排除，请参见讨论部分）。
    4. 使用以下方法检测目标 "概述" 在设置第一个位置之前进行预设；选择 "概述" 预设并倾斜载物台以 ±60° 检查可设置位置与网格条之间的距离（图8）。通过将所需倾斜角度值输入到 "设置倾斜度" 窗口图8A).
    5. 检查方格 "概述" 或获得的 "搜索地图"，移动到目标区域，然后按下 获取搜索. 检查 "搜索" 图像。如果目标区域未居中，可在所需位置单击右键，然后重复操作 移动载物台至此处 和 获取图像. 设置倾斜度（Tilt）°将角度设置为 0.00（或载物台可处理的任何其他起始角度），以定义断层图的起始角度。
      1. 对于第一个断层图像，输入 名称 所需的断层图命名规范以及 离焦 为每个断层图像设置所需的离焦值。
      2. 可选地，从 Tomo 版本 5.8 开始，可一次性系统性地更改所有离焦值；为此，请点击 选择位置，选择要更改的位置，或勾选复选框以选择所有位置，然后点击 更新离焦量 并调整参数（图7A).
    6. 调节 "聚焦" 和 "追踪" 面积 (图2C）。单击左键拖动追踪和对焦区域（黄色和蓝色圆圈）。确保追踪/对焦区域位于碳膜或其它合适的追踪特征上（主要部分），即与目标区域相似的结构特征；避免裂纹、冰污染、过厚区域以及 空孔
      1. 在选择缺乏明显追踪特征的空白碳膜时，应选择足够高的剂量进行聚焦和追踪，以确保在断层扫描进行到一半时，该区域开始缓慢燃烧，尤其是在较高倾角下逐渐烧蚀样品。 有助于保持追踪准确性。确保追踪/对焦区域不暴露后续采集区域。
        注意：需谨慎观察靠近光束区域的物体及其可能进入光束路径的部分。应避免包含会影响追踪和/或曝光的结构区域，包括网格条。
    7. 按压 添加位置 所有参数设置完毕且选定感兴趣的区域后 "聚焦" 和 "追踪" 已定义。针对新靶点重复上述步骤。
      注意：为了验证已设置的批次位置的eucentric高度是否已正确校准，有多种可用策略。建议根据所执行的断层扫描会话类型（分子级、细胞级、薄片级）选择相应的方法。
    8. 对于分子断层成像，假设载网较为平整且每个含有目标位置的方格中心已进行过等中心高度校准，则跳过 "优化全部" （或如果已选择位置，则选择“优化所选”） 图7A）程序。如果 Tomo 在通过台面倾斜进行自动对中时遇到困难，可尝试点击 跳过欧心对中.
      1. 对于细胞或薄层样品，每个批次的位置可能处于不同的 z 轴高度。可选择使用 "优化全部" 谨慎操作或不要勾选 "跳过欧心调节" 选项
        注意： "优化全部" 将遍历所有已设置或通过选定的断层扫描图像 "选择位置"；优化欧中心高度，并在数据采集前进行追踪和聚焦。此步骤可揭示下一断层扫描聚焦/追踪区域可能存在的重叠曝光情况图7B），在继续操作前应予以考虑。
      2. 检查并重新访问未通过优化的方格。使用鼠标右键点击 失败位置 查看选项。如果欧中心高度调整失败，寻找 "通过载物台倾斜实现自动居中" （步骤 1.4.1），获取一个新的 "搜索" 图像以更新 z 轴高度，并 "添加位置". 删除失败/先前已初始化的位置。单击 跳过欧心调节 选项，已对此进行过处理 "优化所有".
        注意：如果 "优化全部" 不运行，则 "跳过欧心调节" 不得勾选。Tomo5 将在每次采集断层图像前运行偏心校正；通过这种方式，无法通过偏心校正的位置将被跳过。
  6. 按照以下步骤执行自动功能。
    1. 检查设置以执行比对 通过 的 "自动功能" 通过在图谱中导航至碳区域，将该区域移至正焦中心高度，并按以下顺序进行校准。
      1. 运行 自动欧几里得中心化 通过倾斜载物台 "欧中心高度" 预设
      2. 运行 自动对焦程序 与 "聚焦" 预设
      3. 运行 自花授精 常规与 "血小板环" 预设
      4. 运行 Autocoma 常规与 "索恩环" 预设
      5. 插入所需的目标光阑（图6B），可能是100 µm孔径，在提高样品对比度和仅轻微截断高分辨率信号之间达到了良好平衡。
      6. 重复该步骤 自花授精 插入光圈后的常规操作。
        注意：在像素尺寸约为3的放大倍数下 Å 以及较低的分辨率， Autocoma 常规操作可能会失败；此时应检查并校准 断层扫描旋转中心 在……之下 直接比对 在透射电子显微镜用户界面中。
    2. 检查 自动零损失 将常规操作集中在您的样本上。使用 "零损失" 预设为相对较高的剂量（步骤 1.2.3）时，自动功能中的常规程序更有可能成功。
  7. 进行数据采集。
    1. 开始自动采集 "断层扫描" 标签，选择 数据采集 分段浇注并设置所需参数（图7C）。设置数据采集参数：倾斜步长（°），最大正角度（°），最大负角度（°），追踪方案（推荐：选择 采集前追踪/聚焦）。选择 关闭层析柱阀门 用于等心高度方案。
      注：很少使用的参数为 "调整曝光时间", "调节 ZLP", "使用相位板"，以及 "倾斜后暂停".
      1. 使用 调整曝光时间 对于不用于亚层析平均（STA）的断层扫描图像，在较高倾角下以指定比例增加曝光时间。
      2. 的 调节 ZLP 该选项将在每个断层图像采集后运行ZLP精修，无论设定的周期如何。此过程较慢，偶尔会因无明显原因而失败，并跳过该位置的图像采集。然而，对于非常窄的狭缝宽度（例如，在Selectris(X)滤光片上为3–5 eV）的情况，该选项可能具有实用价值。
      3. 使用相位板 由于引入了带能量过滤器的DED，该方法已很少使用。
      4. 倾斜后暂停 暂停采集，但不允许在软件中进行任何更改。
    2. 仔细检查数据采集参数（在 "准备" 选项卡），确认剂量计算和期望的倾斜方案，指定数量 组分（编号） 在 "暴露" 预设参数，然后开始采集。
      注意：分步收集的份数取决于样品、采集参数以及计划进行的后续处理步骤（例如，单颗粒分析与形态学分析），且必须保持在足以保证运动校正和CTF估计获得足够信号的范围内。通常4-10份是一个合理的估计值，其中较厚的样品适合取4份，而较薄的分子样品则适合取10份。
      1. 然后，单击 开始 开始数据采集，并监控首个断层图的获取过程，以确保断层图按预期获得。
        ​注意：近期的断层扫描软件版本在 Movie Player 中新增了 slab-out 功能 "断层扫描" 可在此标签页中查看获取的断层图像。加载过程中请耐心等待。

2. 使用 emClarity 对脱铁铁蛋白进行冷冻电子断层扫描亚单位平均分析

注意：此处使用 emClarity 软件17 演示通过 STA 进行冷冻电子断层扫描结构解析的过程。图9 总结了该流程。以载铁蛋白（apoferritin，EMPIAR-10787）的六个倾转系列数据为例，应用八面体对称性，最终获得分辨率为 2.86 Å 的三维结构图，该结果仅基于 4,800 个颗粒，接近奈奎斯特频率（2.68 Å）。

  1. 确保已下载并安装 emClarity 软件包39（参见材料表）。为软件处理安装 IMOD40。
    注意：需要具备 Linux 命令的基本知识。更详细的教程可参考文献41，该文献以核糖体数据集（EMPIAR-10304）为例，描述了逐步操作流程。对于不同类型的蛋白质样品，也可参考已发表的报告42。
  2. 准备输入文件和目录。
    注意：原始帧已通过 MotionCor2（5 × 5 补丁）进行运动校正43（参见材料表）。经运动校正的图像使用 newstack（IMOD）堆叠生成倾转系列，并使用 Etomo（参见材料表）通过补丁追踪进行手动对齐，随后交由 emClarity 处理。为获得更好的对齐效果，建议在 Etomo 中执行偏移和倾转补偿。六个倾转系列重命名为 TS1 至 TS6。以下以第一个倾转系列（TS1）为例，说明具体操作步骤和命令。
    1. 建立项目文件夹。
      注意：该软件的最新版本为 1.5.3.11。所有相关软件日志均可在本地项目文件夹（.../logFile/emClarity.logfile）中找到。
    2. 在项目文件夹下新建一个名为“fixedStacks”的文件夹，并准备输入文件：TS1.fixed、TS1.xf 和 TS1.tlt。
      注意：TS1.fixed：原始倾转系列，也称为 Etomo 中的 TS1.st。TS1.xf：此文件包含 Etomo tiltalign 后的变换坐标。TS1.tlt：此文件包含倾转角度。
  3. 按照以下步骤估算离焦量。
    1. 计算离焦量。根据补充表 1更新显微镜和成像参数的参数文件。将参数文件复制到项目文件夹中，将其重命名为 param_ctf.m，然后运行：emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1。
      注意：参数文件模板可在补充文件 1或本地软件安装目录（…/emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/）中找到。
  4. 检查每个堆栈的 CTF 估算结果。
    1. 使用 3dmod 检查对齐后的堆栈（例如，aliStacks/TS1_ali1.fixed），确保标记珠（fiducial beads）已正确擦除。
    2. 确保日志文件报告的手性正确，该信息可在 logfile/emClarity.logfile 中找到（图 9）。
    3. 检查离焦值（例如，fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf），并确认其与理论 CTF 估算值一致。
  5. 定义子区域。
    1. 生成降采样断层图。在项目文件夹中运行：sh recScript2.sh -1。
      注意：每个堆栈将生成一个较小尺寸的断层图，并存储在新文件夹“bin10”中。为加快处理速度，可在 bin10 断层图中定义一个或多个子区域的坐标。脚本文件位于本地软件安装目录（…/emClarity_1.5.3.11/docs/）中。
    2. 通过选择六个点 xmin、xmax、ymin、ymax、zmin 和 zmax 来创建一个子区域。在“bin10”文件夹下运行：3dmod TS1_bin10.rec。
      注意：若在一个倾转系列中创建四个子区域，则需选择 6 × 4 = 24 个点。每个堆栈在“bin10”文件夹下必须有一个模型文件（*.mod）。
    3. 将模型文件转换为 emClarity 格式。这将创建一个新文件夹 recon，并将每个子区域的所有坐标存储在此文件夹下。在项目文件夹中运行：sh recScript2.sh TS1。
  6. 挑选颗粒。
    1. 寻找用于颗粒挑选的脱铁铁蛋白模板。从电子显微镜数据库（EMD-10101）44 下载模板。确保模板的像素尺寸与原始数据匹配。在项目文件夹中运行：emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu。
    2. 生成用于颗粒挑选的 CTF 校正断层图。在项目文件夹中运行：emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch。
    3. 对每个子区域执行颗粒挑选。对于脱铁铁蛋白数据集，在 bin6 下执行模板搜索。修改 Tmp_angleSearch 参数（θout、Δout、θin、Δin）以确定平面内或平面外搜索的角度范围和间隔（单位为度）。在项目文件夹中运行：emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1。
      注意：此步骤将生成一个名为“convmap_wedge_Type2_bin6”的文件夹。该文件夹下的 csv 文件（例如，TS1_1_bin6.csv）包含所有挑选出的颗粒信息。
    4. 使用 3dmod 删除错误的颗粒。在“convmap_wedge_Type2_bin6”文件夹下运行：3dmod ../cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod。
      注意：在碳边缘或冰污染区域附近常会出现错误颗粒。对错误点执行右键单击，然后按键盘上的Backspace键删除。此步骤中应确保大多数假阳性点被移除（图 10）。
    5. 将文件夹名称“convmap_wedge_Type2_bin6”更改为“convmap”，因为后续步骤中 emClarity 将在 convmap 下查找子区域信息。
  7. 初始化项目。在项目文件夹中运行：emClarity init param0.m，以创建 emClarity 的数据库 ApoF.mat。
  8. 在 STA 和对齐之前执行断层图重建。为在 bin4 下生成 CTF 校正的子区域断层图，运行：emClarity ctf 3d param0.m。
    注意：CTF 校正的断层图（例如， cache/TS1_1_bin4.rec） 将在新文件夹“cache”中生成。
  9. 执行 STA 和对齐。
    1. 使用 bin4 下的 CTF 校正子断层图开始平均化处理。在项目文件夹中运行：emClarity avg param0.m 0 RawAlignment。
    2. 继续执行对齐并运行：emClarity alignRaw param0.m 0。
      注意：平均化步骤生成一个参考图，emClarity 在此步骤中将使用该参考图对颗粒进行对齐。可修改 Raw_angleSearch 参数（θout、Δout、θin、Δin）以设置每轮循环的角度范围和步长。由于大多数错误颗粒已在数据库中被移除（步骤 2.6.4），这些对齐的角度设置可从相对较小的角度开始。
    3. 更新 Raw_angleSearch 参数并再运行若干轮循环（步骤 2.9.1 和 2.9.2）。为加快处理速度，可分别执行平面内和平面外对齐。
      注意：对于每个降采样级别，建议运行多个循环并逐步减小角度设置。对于 ApoF 数据集，在 bin4 下又进行了五轮循环，更多细节见补充表 2。对于 cycle001，在项目文件夹中运行：emClarity avg param1.m 1 RawAlignment，随后运行 emClarity alignRaw param1.m 1。
    4. 清除重叠颗粒。在项目文件夹中运行：emClarity removeDuplicates param5.m 5。
  10. 使用 tomoCPR 执行倾转系列优化。
    注意：此步骤为可选。
    1. 运行 tomoCPR 以优化堆栈几何结构。在项目文件夹中运行：emClarity tomoCPR param5.m 5。
    2. 生成新对齐的堆栈并更新几何文件。在项目文件夹中运行：emClarity ctf update param6.m。
      注意：确保新几何文件（例如，fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt）和新对齐的堆栈（例如，aliStacks/TS1_ali2.fixed）已正确生成。
    3. 在 bin2 下创建新的子断层图。在项目文件夹中运行：emClarity ctf 3d param6.m。
      注意：接下来将在 bin2 下进行若干轮平均化和对齐（步骤 2.9.1、2.9.2 和 2.9.3）、重复颗粒清除（步骤 2.9.4）以及可选的 tomoCPR（步骤 2.10）。由于具有高度对称性，脱铁铁蛋白在 bin2 下又进行了五轮循环。每轮循环需更新 Raw_angleSearch 参数。
  11. 执行最终重建。
    1. 继续在 bin1 下运行若干轮循环及 tomoCPR（步骤 2.9 和步骤 2.10）。对于脱铁铁蛋白数据集，在 bin1 下又进行了 10 轮循环。有关命令和参数的更多细节见表 2。
    2. 通过合并两个半数据集执行最终重建。在项目文件夹中运行：emClarity avg param21.m 21 RawAlignment，随后运行 emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment。
      注意：将生成最终图谱（例如，B 因子为 10 的 cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc），图 11。

结果

对于细胞和薄层样品，数据采集策略在很大程度上取决于样品本身以及成像研究的目的（图1）。靶向策略取决于分子靶标是否为 原位 或从纯化的生物大分子复合物制备用于高分辨率重构的含分子靶标的样品。对于在有孔（碳膜）载网上进行玻璃化冷冻的纯化复合物，靶向可直接基于在（碳膜）支撑膜孔洞中的成像。对于 原位 在该工作中，靶向定位方法需要基于相关数据或已知的低倍率细胞标志物来确定分子实体的位置。理想的细胞标志物应在获取概览图像时即可识别，若足以粗略定位感兴趣区域，则可通过搜索图像快速确认靶标身份。然而，若可观察事件较为罕见，则可能需要中等倍率的搜索图像来确认靶标是否正确。搜索图谱是搜索图像的中等倍率拼接图，因此可在目标特征可见的放大倍数下获取，从而显著简化靶标定位过程。随后可对搜索图谱进行筛查，以发现并设定靶标批量成像位置。对于包含用于超微结构重建的细胞特征的样品，其靶向方法类似，但同样依赖于细胞事件在不同放大倍数下的可见性及其在样品中的出现频率。

数据采集策略也必须加以考虑；在所有情况下，研究目标在很大程度上决定了数据的采集方式。对于细胞超微结构的重建，较低的放大倍数（20–5 Å/px）和较大的视场可能是合适的，但要重建分子级别或高分辨率细节（5–1 Å/px），则需要更高的放大倍数。在理想条件下以 1.5 Å/px 采集的数据集，其物理上仅能产生奈奎斯特频率为 3.0 Å/px 的重构结果；然而实际上，许多因素（包括但不限于样品厚度、尺寸和异质性）都会影响最终获得的重构质量。具体的成像参数还需根据研究目标，在放大倍数与视场范围之间进行权衡，以确保包含足够的信息量。本文展示了一个达到 2.86 Å 分辨率的子断层平均化案例，但为了说明针对不同研究目标所采用的采集参数，表1中还列出了其他若干研究17,42,43,44,45作为参考17,42,45,46。

一旦建立了用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的靶向工作流程和数据采集方案，便可对多种不同类型的样品进行数据采集。本文展示了多种样品的代表性断层图：包括分子样品（如脱铁铁蛋白，视频 1）、较薄的细胞突起（视频 2）以及通过聚焦离子束（FIB）铣削制备的较厚细胞样品薄片（视频 3）。

细胞断层成像示意图；流程：图谱、搜索图、靶向、曝光。分子成像。
图1：断层成像工作流程的概述。 本方案中描述的冷冻电子断层成像（cryo-ET）工作流程以流程图形式展示。图中显示了在细胞和分子工作流程中预期获取的图像。所采用的命名方式遵循Tomo5规范，尽管大多数断层成像采集软件在获取这些图像时均遵循相似的基本原理。请点击此处查看该图的放大版本。

曝光和追踪选项的显微镜成像设置面板，以及样本上的聚焦区域示意图。
图2：准备选项卡及预设条件搜索。（A）整个选项卡的概览图像。在此选项卡中设置成像条件预设，“校准图像偏移”和“图像滤镜设置”可在“任务”下拉菜单中找到。（B）“预设”下拉菜单的放大图，可在此处为各个成像条件选择相应的预设。（C）图像显示了合适的放大倍数，以便在视野中同时容纳曝光区域和“聚焦与追踪”区域。请点击此处查看此图的放大版本。

平行照明的曝光时间计算、公式与方法，显微镜实验。
图3：剂量计算。 针对可能的断层扫描采集方案进行的示例性剂量计算，其中剂量率已在真空条件下测得。这两种计算方法用于确定每次倾斜所需的曝光时间（s），分别对应于设定每幅倾斜图像的最佳剂量或整个倾斜系列的总最佳剂量。在亚断层平均（subtomogram averaging）中，通常将每幅倾斜图像的剂量目标设定在3.0–3.5 e-/Å2范围内。在这两种情况下，“分帧数（Fractions (Nr.)）”均设为6，以使每个倾斜角度的电影帧（movie frame）接收约0.5 e-/Å2的剂量，从而获得足够的信号用于运动校正。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示交叉光栅采集的光谱会话任务面板；数据设置界面。
图 4：图谱标签页。 “图谱”标签页的概览图像。该图像已裁剪以避免显示空的网格位置区域。“任务”菜单包含会话设置偏好、用于单独选择所有已登记网格的网格选择区域，以及在将样品盒从自动进样器中移除后采集单张图谱的选项。已选中的网格可被重置并重新采集。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示用于纳米级分析的电子显微镜图像及校准设置的断层扫描示意图。
图 5：校准后的图像偏移。 图像展示了一张曝光图像和一张搜索图像。搜索图像中的红色十字是经过偏移校正的标记，用于修正曝光图像与搜索图像之间的偏移量。每次会话开始时或更改成像条件预设后，应重新进行图像偏移校准。 请点击此处查看此图的放大版本。

电子显微镜界面设置；实验装置中的自动对焦、光阑和透镜状态。
图6：自动功能与光阑。（A）“自动功能”选项卡显示了“预设”下拉菜单和“任务”选择。“Thon Ring”预设（蓝色下划线标注）是执行“自动消像散”（Autostigmate，同样以蓝色下划线标注）和“自动彗差校正”（Autocoma）所必需的。应为每项任务选择相应的预设，然后点击 开始 按钮。（B）在透射电子显微镜（TEM）用户界面中可找到光阑。在完成自动功能操作后，选择所需的“物镜光阑”，并在此光阑插入状态下运行“自动消像散”。请点击此处查看此图的放大版本。

冷冻电子显微镜载网设置、断层扫描软件界面、样品定位方法。
图7：断层扫描选项卡概览。 图像展示了 Tomo 5.8 的用户界面。(A) 批量位置。图像中显示的最新功能包括“采集搜索图”选项；断层图位置在图谱视图中显示，并带有放大选项；右上角高亮显示“选择位置”；下方已选中全部四个位置以更新离焦参数。(B) 在搜索图上选中了三个位置，分别标记为1、2和3。当运行“全部优化”时，位置1不会产生问题。然而，如果处于高目标密度设置下（例如选择切片位置时），如位置2和位置3所示，则“全部优化”将在位置2的“曝光”区域执行“追踪”和“对焦”程序，从而在采集断层图之前暴露目标区域。载网类型为 R1.2/1.3。比例尺 = 1.2 µm。(C) 数据采集。在“批量位置”中设置的选定位置现在可逐一进行采集。请点击此处查看该图的放大版本。

显微成像对齐；表面扫描，自动定位系统，实验装置。
图8：定义最大倾斜角度。 本图展示了确定断层扫描成像最大倾斜范围的逐步方法。（A）0°下的整体概览图，以及位于载网方格中心的搜索图。为测试倾斜范围，可在断层扫描软件中通过输入期望值后点击“Set”按钮，使用“Set Tilt (°)”功能设定倾斜角度。（B）载物台已倾斜至−60°，显示搜索图的一个角落在−60°时将无法被完全采集。（C）载物台已倾斜至60°。通过统计在±60°时消失的孔洞数量，可估算出该载网方格的倾斜范围。比例尺 = 2.5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜图像处理工作流程；包括对齐、离焦、颗粒挑选和最终重构。
图9：emClarity 流程图。 该流程图描述了冷冻断层图子区域平均化的各个步骤。比例尺 = 50 nm。 请点击此处查看此图的放大版本。

冷冻电镜显微照片分析；颗粒识别、自动追踪、聚类结果示意图。
图10：使用emClarity进行模板匹配。（A）载有脱铁铁蛋白的石墨烯包被载网的典型显微照片。欠焦值：−3.430 µm。（B）模板搜索后叠加模型点的断层图切片。（C）和（D）分别为模型点的顶视图和侧视图，显示为单层平坦分布的单分散脱铁铁蛋白颗粒。比例尺 = 50 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜结构分析示意图：病毒颗粒、分辨率图表 2.86 Å、分子结构细节
图11：脱铁铁蛋白的冷冻电子断层扫描亚层析对齐分析（Cryo-ET STA）。（A）经过21轮亚层析图对齐后的最终三维重构图。（B）最终三维图的傅里叶壳层相关（FSC）曲线图，报告分辨率为2.86 Å，包含38个锥形FSC。（C）代表性密度图（与PDB模型6s6147拟合）。请点击此处查看该图的高清版本。

样品冷冻电子断层成像类型Å/像素倾转角度范围（±）倾转步长（°）欠焦范围（µm）总剂量（e⁻/Ų）分辨率原始数据参考文献
脱铁铁蛋白纯化样品/分子（亚层析平均）1.346031.5 – 3.51022.86EMPIAR-1078717 及本文
HIV-1 Gag纯化样品/分子（亚层析平均）1.356031.5 – 3.961203.1EMPIAR-1016417
核糖体纯化样品/分子（亚层析平均）2.16032.2 – 4.31207EMPIAR-1030442
SARS-CoV-2 刺突蛋白薄片样品/分子（亚层析平均）2.135432 – 712016EMPIAR-1075345
神经元轴突结构细胞水平（超微结构）5.466023.5 – 590未测定（N.D.）EMPIAR-1092247

表1：多项冷冻电镜断层扫描研究的采集参数。 从纯化或部分纯化的样本中重建分子细节的研究 原位 蛋白质，相较于旨在解析和分割超微结构细胞特征的研究。

视频 1：载有脱铁铁蛋白样品的常规电镜载网，使用配备超高清相机及兼容滤光片的冷冻透射电镜成像所得的断层扫描图。 倾斜系列图像在电子断层扫描软件中采用剂量对称方案采集，倾斜范围为 54°，总电子剂量为 134 e-/Å2。比例尺 = 50 nm。请点击此处下载该视频。

视频 2：在电镜载网上培养的原代神经元，使用配备超高清分辨率相机及兼容滤光片的冷冻透射电子显微镜直接成像所得的断层图像。倾斜系列图像在电子断层成像软件中采用剂量对称方案采集，倾斜范围为 60°，总剂量为 120 e-/Å2。比例尺 = 100 nm。请点击此处下载该视频。

视频 3：一种蓝细菌在电镜载网上经聚焦离子束切片后，使用配备高速相机和兼容滤光片的冷冻透射电镜成像所得的断层图像。倾转系列图像在电子断层成像软件中采用剂量对称方案采集，倾转范围为 50°，总剂量为 120 e-/Å2。比例尺 = 87.2 nm。请点击此处下载该视频。

补充文件1：用于估计离焦量的参数文件模板。 请点击此处下载该文件。

补充表1：数据采集和显微镜设置详细信息。 请点击此处下载该表格。

补充表2：按执行顺序排列的命令列表。 请点击此处下载该表格。

讨论

Tomo5
断层扫描软件的工作流程描述展示了一种潜在且最简化的（远程）批量断层扫描会话设置方法。尽管该软件对初学者而言易于使用，但具备一定的冷冻电镜经验以及基础的断层扫描知识将有助于完成设置。本方案中已标出关键步骤，即使采用不同的设置方式，这些步骤也有助于排查问题。软件的不断进步将简化（远程）数据采集过程，并使冷冻电子断层扫描技术为更广泛的用户群体所用。 以下介绍一些有助于解决常见问题的技巧和建议。

需要讨论的一个重要问题是载网的选择，因为在将样品倾斜至±60°时，高倾角下载网的栅条可能会遮挡视野（图8）。透射电镜载网上，网目数（mesh size）指的是单位长度内载网方格的数量。网目数越大，单位长度内的方格数量越多，方格密度越高，单个方格尺寸越小；例如，400目载网的方格比200目载网更小。对于断层扫描而言，较合适的选择是200目或300目载网。如图8所示，随着载网倾斜角度的增加，可用于采集图像的区域会减小。在±60°倾角下，300目载网可用于完整断层成像的视野范围较小。200目载网的优点在于其较大的方格可加快分子断层成像的设置速度，并且由于单个方格面积更大，通常一个方格即可满足过夜采集的需求。其缺点是200目载网更为脆弱，因此在操作和夹装时需要更加精细的技巧。

此外，如果在电镜载网上使用带孔支撑膜（参见材料表），则必须考虑孔洞间距，以便合理设置曝光区域对应的对焦和追踪区域。理想情况下，在目标放大倍数下，电子束直径应足够小，仅覆盖沿倾斜轴方向曝光区域附近相邻的碳膜区域，以实现最佳且快速的设置。这样可确保获取每个孔洞中潜在的兴趣区域。

由于当前软件的等中心高度校准程序不如serialEM程序稳定，以下建议可帮助解决该问题。如果使用“等中心高度”预设无法完成等中心高度的确定，可改用“概览”预设，然后重新运行“通过样品台倾斜自动校准等中心”；当等中心高度与0相差较大时，此方法可解决相关问题。若此步骤成功，可再次使用“等中心高度”预设重新运行“通过样品台倾斜自动校准等中心”，以提高精度。若仍失败，可先使用“等中心高度”预设运行“通过电子束倾斜自动校准等中心”，然后重新运行“通过样品台倾斜自动校准等中心”，或在透射电镜用户界面的“样品台”设置中，手动设置“通过电子束倾斜自动校准等中心”所确定的z轴高度。若使用具有重复孔洞图案的载网，可能会导致无法识别单一的互相关峰。此时可尝试将等中心高度预设中的离焦偏移量设为更小的值（例如−25 µm）和/或缩短曝光时间，以减少孔洞图案带来的互相关干扰。另一方面，若使用 lacey 载网或薄片样品，可能因信号不足而难以获得明显的互相关峰。此时可尝试将等中心高度预设中的离焦偏移量设为更大的负值（例如−75 µm）和/或延长曝光时间，以增强互相关峰。另一种选择是调整图像滤波设置，该设置位于“制样”选项卡中。可针对低倍率（概览/网格方格）、中等倍率（等中心高度）和高倍率（追踪/聚焦）分别调整滤波参数，以在各预设条件下获得最佳的互相关峰。该过程需要输入两张图像，即0°和5°倾转角下的图像，随后点击比较以对比两张图像。推荐的最长波长起始值为图像标尺长度的四分之一，最短波长起始值为标尺长度的四十分之一。如果互相关峰未能被稳健识别，可不断优化 设置，直至获得清晰可信的峰值。无需每次更改后都重新采集图像，仅需点击“比较”即可。若TOMO仍无法自动确定等中心高度，可采用手动等中心高度校准方法。操作时应在“制样”选项卡的概览倍率下，将一个尺寸适中的冰晶置于视野中心，然后进入透射电镜用户界面的“样品台控制”模块，将倾转角α设为−30°，并通过调节样品台z轴位置，利用荧光屏图像重新将冰晶置于视野中心。在透射电镜用户界面中选择“高分辨率”和“高对比度”模式将有助于简化该操作（位于荧光屏窗口底部的按钮）。此外，若具备支持实时成像模式的相机，也可利用该设备确定等中心高度，其操作将比使用荧光屏更为便捷。

Tomo5 在 5.8 版本之前存在的主要局限包括缺乏中等放大倍数的拼接图像、缺乏剂量对称方案，以及与寻找等中心高度相关的问题。而 serialEM 作为一款免费软件，具有快速的开发迭代和社区支持，具备稳健的等中心高度校准程序，并支持脚本化操作，例如可自定义剂量对称方案。从 Tomo5 5.8 版本开始，已通过引入设置等中心高度接受标准的选项，解决了在寻找等中心高度过程中最常遇到的问题，即无法成功围绕目标 z 值进行循环校准的问题。然而，针对不同的载网和样品类型，强烈建议调整图像滤波设置，以反映每次实验独特的成像条件，从而获得尽可能清晰的互相关峰，确保在断层扫描数据采集过程中能够可靠地完成等中心高度校准、聚焦及追踪区域的定位。

总体而言，许多研究机构在疫情期间已迅速适应了远程操作。Tomo5 软件为断层扫描提供了便捷且用户友好的操作途径，非常适用于远程运行。该软件所取得的进步无疑将继续推动远程数据采集以及断层扫描技术在科研领域中的广泛应用和普及。

emClarity
由于 emClarity 采用基于模板的颗粒挑选方法，因此需要为目标对象提供一个模板。颗粒挑选（步骤 2.6）对最终结构极为敏感且至关重要。在进行平均和对齐（步骤 2.9）之前，必须仔细检查并手动剔除假阳性颗粒。当缺乏可用模板时，emClarity 可能较难使用，但可以借助其他软件（例如 Dynamo37 和 PEET48）生成初始模型。

对于异质性样品，emClarity 配备了一种分类方法，使用户能够重点关注具有不同尺度的特定特征。在分类前先进行若干轮对齐，并在较高的合并倍数（例如 bin 4 或 bin 3）下运行，将有助于提高效果。

与初始版本（V1.0）相比，该软件的最新版本（V1.5.3.11）进行了多项重要更新17。这些更新包括但不限于：在CTF估计过程中增加手性检查（步骤2.3）；支持多种对称性用于图像比对（CX、I、I2、O）；计算每颗粒的三维采样函数（3DSF）；切换至MATLAB 2019a以提高兼容性与稳定性；以及使用原始投影图像进行重构（cisTEM）。该软件将持续针对各类样品不断优化，最新的公告可在线获取（见材料表）。

致谢

我们感谢钻石光源（Diamond Light Source）为我们提供英国国家电子生物成像中心（eBIC）的冷冻电镜设施使用权限并给予支持，该中心由惠康基金会（Wellcome Trust）、英国医学研究理事会（MRC）和生物技术和生物科学研究理事会（BBRSC）资助。我们还要感谢 Andrew Howe 提供脱铁铁蛋白断层图（影片 1），Ishika Kumar 制备并获取神经元断层图（影片 2），以及 Craig MacGregor-Chatwin 提供蓝细菌切片断层图（影片 3）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
软件
断层扫描赛默飞世尔科技5.9.0内部术语：文档中的 Tomo5
TEM 服务器赛默飞世尔科技7.10.1
短暂性脑缺血发作赛默飞世尔科技5.10.1
DigitalMicrographGatan3.44
emClarity开源软件1.5.3.11用于高分辨率冷冻电子断层扫描与子断层平均化的软件
IMOD开源软件4.11用于显微镜图像三维重建与建模的建模、显示及图像处理程序，特别侧重于电子显微镜数据
MotionCor2学术用途免费1.1.0一种用于校正记录的束流诱导样品运动的多GPU程序
分剂量电影堆栈
ETomo开源软件4.11ETomo 是一个用于运行 IMOD 和 PEET 部分命令的接口。 
NoMachineNoMachine，免费软件7.9.2远程桌面软件
TeamViewerTeamViewer AG-远程访问与远程控制计算机软件
材料
Quantifoil（带孔支撑膜）透射电镜载网Quantifoil-具有预定义孔径尺寸、形状和排列的碳薄膜
仪器设备
Titan Krios 电镜赛默飞世尔科技Titan Krios G2
K3相机和GIB能量过滤器Gatan-
Falcon 4 相机与 Selectris X 能量过滤器赛默飞世尔科技-
网站
网站 1：https://github.com/bHimes/emClarity/--下载 emClarity 软件包的链接
网站 2：https://bio3d.colorado.edu/imod/--下载 IMOD 的链接
网站 3：https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial--emClarity 在线教程链接
网站 4：https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software--下载 MotionCor2 的链接
网站 5：https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki--emClarity 更新与错误修复最新公告链接

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