冷冻电子断层扫描远程数据收集和断层扫描平均
July 12th, 2022
本协议描述了使用Tomo5的高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集以及使用emClarity的后续数据处理和子断层图平均。以载铁蛋白为例，说明实现 2.86 Å 分辨率冷冻电子断层扫描结构的详细分步过程。
该协议为进入日益流行但复杂的冷冻电子断层扫描世界提供了一种简单的访问途径。可以对六个细胞标本进行成像。在接近原生状态的研究所。
然后，通过使用CROW，ET和亚原子平均法，可以在其天然细胞环境中以高分辨率解析微分子。首先从TEM服务器PC启动Tomo five软件。通过在预设下的准备选项卡中调整图像采集参数来启动会话设置。
将图像采集参数复制到所有其他高放大倍率预设。按设置"设置对显微镜的曝光，按获取"在单独选择所有其他高放大倍率后获得所有其他高放大倍率的曝光设置。要收集地图集，请单击"新会话"在地图集"选项卡中。
设置会话首选项。输入存储路径和输出格式，然后按应用。选择筛选"并勾选所有要获取的图集。
选择关闭呼叫阀"如果显微镜无人监督，这将关闭柱阀。然后要开始筛选，请按开始按钮。通过单击左侧面板中的网格来检查单个或多个目标图集会话设置"然后左键单击并拖动鼠标以四处移动，中键滚动以放大和缩小。
为目标设置选择网格。选择它并单击 加载样本"从软件内部。要执行图像偏移校准，请在"自动功能"选项卡中将预设设置为"真心高度"导航到自动同心"通过载物台倾斜，然后按开始。
如果特征在定位期间保持居中，请跳过图像偏移校准。否则，请转到"准备"用于校准图像偏移的选项卡选择校准图像偏移"，然后按开始。这会将较低的放大倍率与以曝光放大倍率为中心的特征对齐。
对于断层扫描设置，请在会话设置中启动新会话"对于生物样本。选择板坯喜欢"作为样品类型并选择批量"和低剂量"然后选择输出格式和存储"文件夹。（可选）添加电子邮件收件人并按"应用"要设置目标，请转到图集箭头，找到感兴趣的区域，然后选择右键单击弹出的选项进行移动。
拍摄概览图像以确认以Eucent高度调整的良好位置。然后按自动共心"要通过载物台倾斜例程运行真心，请重新获取新的概览图像以更新共心高度。检查方形概览或获取的搜索地图。
移动到感兴趣的区域，然后按获取搜索。然后检查搜索图像，如果感兴趣区域未居中，右键单击所需位置并在此处重复"移动阶段"并获取图像。调整焦点和跟踪区域。
左键单击以拖动跟踪和焦点区域。设置完所有参数后，按添加位置"要执行自动功能，请检查设置以通过自动功能"选项卡通过将图集导航到碳区域来执行对齐。使该区域达到以真为中心的高度，并遵循文本手稿中描述的对齐顺序。
接下来，开始自动采集断层扫描选项卡。选择数据采集"板并设置所需的参数。设置数据采集参数:倾斜步长、最大正角、最大负角、跟踪方案。
然后选择关闭柱阀"对于以心为中心的高度方案。从准备输入文件和目录开始。在项目"文件夹下建立一个项目文件夹。
使另一个新文件夹固定堆栈并准备输入文件。倾斜系列一 固定倾斜系列 1.XF 和倾斜系列 1.tlt.
要计算散焦，请使用显微镜和成像参数更新参数文件。将参数文件复制到项目文件夹。将其名称更改为param_CTF。
M 并运行指示的命令。接下来，检查 CTF 估计结果。对于每个堆栈，使用 3D mod 检查对齐的堆栈，并确保正确擦除基准珠。
通过运行指示的命令确保惯用手正确。然后检查散焦值，并确保其与理论CTF估计值相匹配。要定义子区域，请生成折弯断层扫描。
在项目文件夹中，运行指示的命令。通过选择六个点 Xmin Xmax Ymin、Ymax、Zmin 和 Zmax 来确定边界，要在文件夹 bin10 下创建一个子区域，请运行指示的命令。接下来，为每个子区域运行粒子拾取。
对于载铁蛋白数据集，请在箱六处进行模板搜索。修改模板下划线角度。搜索参数，用于确定平面内或平面外搜索的角度、范围和间隔（以度为单位）。
在项目文件夹中运行指示的命令。使用文件夹下的 3D mod 删除不正确的粒子。Convmap_wedge_Type2_bin6。运行指示的命令。
接下来，初始化项目。在项目文件夹中，运行指示的命令以创建 EM 清晰度的数据库 AppoF.mat。在子断层平均和对齐之前执行断层影像重建，以在 bin4 生成 CTF 校正的子区域断层图，运行指示的命令。
接下来，要执行子 tomo 平均和对齐，请使用从 bin4 开始的 CTF 校正子报文执行平均。在项目文件夹中，运行指示的命令。继续执行对齐并运行命令。
通过运行指示的命令清理重叠的粒子。通过组合两个半数据集来执行最终重建。在项目文件夹中运行指示的命令。
此处显示了细胞和薄片样品的细胞和分子断层扫描工作流程概述，数据收集策略在很大程度上取决于样本和成像研究的目标。此处显示了几项冷冻电子断层扫描研究的收集参数。此处显示了分子样品（例如载铁蛋白、薄细胞过程和厚细胞标本的聚焦离子束铣削薄片）的代表性断层扫描图。
高分辨率结构分析有助于揭示药物靶标的结合位点，断层扫描和断层下平均也有助于开发针对SARS-CoV-2的疫苗。
概述
本协议概述了高分辨率冷冻电子层析断层扫描（cryo-ET）远程数据采集和处理的详细步骤，以apoferritin为模型系统。该工作流实现了2.86 Å的cryo-ET结构分辨率，展示了从数据收集到子层析图平均的高效方法。
关键研究组成部分
研究领域
- 冷冻电子层析断层扫描
- 结构生物学
- 细胞成像
背景
- 冷冻电子层析断层扫描技术简介。
- 以原始状态成像细胞样本的重要性。
- 使用apoferritin进行方法学说明。
使用的方法
- 使用Tomo5软件进行远程数据采集。
- 使用emClarity进行子层析图平均处理方法。
- 生物系统中的高分辨率成像。
主要结果
- 成功展示了高分辨率数据收集和处理。
- 实现了具有显著分辨率的apoferritin详细成像。
- 验证了未来cryo-ET研究的方法学。
结论
- 本研究为结构生物学中的高分辨率成像提供了系统方法。
- 概述的方法对于推进冷冻电子层析断层扫描研究相关。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
