冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法
2022年7月12日
本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å 的冷冻电子断层结构的逐步操作流程。
本方案为进入日益流行但技术复杂的冷冻电子断层扫描领域提供了一条便捷途径。可对六种细胞样本进行成像，以接近天然的状态进行观察。
随后可利用CROW、ET和原子级平均技术，在天然细胞环境中以高分辨率解析微分子结构。首先从透射电子显微镜（TEM）服务器计算机启动Tomo five软件。在预设的“准备”选项卡中调整图像采集参数，以开始会话设置。
将图像采集参数复制到所有其他高倍率预设中。选择各个高倍率预设后，点击“Set”以将曝光设置应用至显微镜，或点击“Get”以获取所有其他高倍率的曝光设置。要采集图谱，请在“Atlas”选项卡中点击“New Session”。
设置会话参数。输入存储路径和输出格式，然后点击应用。选择“筛查”，并勾选所有需要获取的图谱。
选择关闭阀门。如果显微镜无人看管，这将关闭柱阀门。然后按开始按钮以启动筛选。通过点击会话设置左侧面板中的网格，检查单个或多个图谱中的目标。然后单击鼠标左键并拖动鼠标以移动，滚动鼠标中键以放大和缩小。
选择目标设置的网格。选中后，点击软件内的“加载样品”。要执行图像偏移校准，请在“自动功能”选项卡中将预设设为“等中心高度”，然后通过阶段倾斜导航至“自动等中心”，并按下开始按钮。
如果在定位过程中该特征仍保持居中，则跳过图像平移校准。否则，请转到“准备”选项卡，选择“校准图像平移”并点击开始。此操作将使低倍率图像与在曝光倍率下居中的特征对齐。
进行断层扫描设置时，在“Session Setup”（会话设置）中为生物样本新建一个会话。选择“Slab like”（类似薄片）作为样本类型，并选择“Batch”（批量）和“Low Dose”（低剂量）模式。然后选择输出格式和存储文件夹。可选地，添加电子邮件接收人，然后点击“Apply”（应用）以完成设置。要设置目标区域，请转到图谱箭头处，找到感兴趣区域，并通过右键单击弹出的选项进行移动和调整。
拍摄一张概览图像，以确认用于调整欧中心高度的合适位置。然后按下“autoeucentric”以运行通过载物台倾斜进行欧中心对准的程序，重新获取一张新的概览图像以更新欧中心高度。检查方形概览图像或已获取的搜索图。
移动至目标区域，然后点击“获取搜索图像”。如果目标区域未居中，请在所需位置右键单击，重复执行“将载物台移至此处”并重新获取图像。调整焦距和追踪区域。
左键单击以拖动跟踪和对焦区域。设置所有参数后，按“添加位置”按钮。要执行自动功能，请通过导航图谱至碳膜区域，在“自动功能”选项卡中检查设置，将该区域调整至消像散中心高度，并按照文本稿件中描述的顺序进行各项校正。
接下来，启动断层扫描标签页的自动采集。选择数据采集“slab out”并设置所需的参数。设置数据采集参数：倾斜步长、最大正角度、最大负角度、追踪方案。
然后为等心高度方案选择“关闭柱阀”。首先准备输入文件和目录。在“项目”文件夹下建立一个项目文件夹。
新建另一个文件夹“fixed stacks”，并准备输入文件：倾斜系列一“fixed tilt series 1.xf”和“tilt series 1.tlt”。
为计算离焦量，需使用透射电子显微镜及成像参数更新参数文件。将一个参数文件复制到项目文件夹中，并将其重命名为 param_CTF。
输入 M 并运行指定命令。接下来，检查 CTF 估计结果。对于每个堆栈，使用 3D mod 检查对齐后的堆栈，并确保标记小球被正确清除。
通过运行指定命令确保手性正确。然后检查离焦值，并确保其与理论CTF估计值相符。为定义子区域，需生成弯曲断层图像。
在项目文件夹中，运行指定的命令。通过选择六个点 Xmin、Xmax、Ymin、Ymax、Zmin 和 Zmax 来确定边界，在 bin10 文件夹下创建一个子区域，并运行指定的命令。接着，对每个子区域进行颗粒挑选。
对脱铁铁蛋白数据集，在第六个二倍体水平进行模板搜索。调整模板下划线角度。设置搜索参数，以确定面内或面外搜索的角度、范围和间隔（单位为度）。
在项目文件夹中运行指定命令。在 Convmap_wedge_Type2_bin6 文件夹下的 3D mod 中去除不正确的粒子。运行指定命令。
接下来，初始化项目。在项目文件夹中运行指定命令，以创建用于 EM clarity 的数据库 AppoF.mat。在进行子断层平均和对齐之前，先执行断层图重建，以在 bin4 下生成经 CTF 校正的子区域断层图，运行指定命令。
接下来，为了进行子断层平均化和配准，使用从 bin4 开始的 CTF 校正后的子图像进行平均化操作。在项目文件夹中运行指定的命令。继续进行配准并执行该命令。
通过运行指定命令清除重叠的颗粒。通过合并两个半数据集进行最终重构。在项目文件夹中运行指定的命令。
细胞和分子断层成像的工作流程概览如图所示，适用于细胞和薄片样品，数据采集策略在很大程度上取决于样品本身以及成像研究的目标。此处展示了多个冷冻电子断层扫描（cryo-ET）研究中的采集参数。代表性分子样品的断层图包括脱铁铁蛋白、细胞的细长突起，以及通过聚焦离子束铣削制备的厚细胞样品薄片。
高分辨率结构分析有助于揭示药物靶点的结合位点，而断层扫描和亚断层平均技术也正在助力针对 SARS-CoV-2 的疫苗研发。
概述
本方案以脱铁铁蛋白为模型系统，详细阐述了高分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET）远程数据采集与处理的各个步骤。该工作流程实现了2.86 Å的cryo-ET结构分辨率，展示了从数据采集到子断层平均化的高效方法。
关键研究组成部分
研究领域
- 冷冻电子断层扫描
- 结构生物学
- 细胞成像
背景
- 冷冻电子断层扫描技术简介。
- 对细胞样本在其天然状态下进行成像的重要性。
- 利用脱铁铁蛋白进行方法学示例。
使用的方法
- 使用 Tomo5 软件进行远程数据采集。
- 利用 emClarity 进行子层析平均的处理方法。
- 生物系统中的高分辨率成像。
主要结果
- 成功实现高分辨率数据的采集与处理。
- 对脱铁铁蛋白进行具有显著分辨率的精细成像。
- 为未来的冷冻电子断层扫描研究提供经过验证的方法学基础。
结论
- 本研究为结构生物学中的高分辨率成像提供了系统性方法。
- 所述方法对推进冷冻电子断层扫描技术研究具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
采用远程数据采集和子层析图平均技术的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）可实现对近天然细胞环境中大分子的高分辨率结构分析。这一能力对于生物制药研发中的靶点验证、作用机制风险评估以及加快早期发现阶段的决策至关重要。通过整合稳定的远程工作流程，可确保持续访问先进的成像基础设施，支持项目组合的连续性以及跨站点协作。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够直接原位可视化分子复合物，支持功能靶点的验证。
- 通过揭示天然构象和相互作用，有助于降低机制性风险。
- 提高对靶点结合及通路解析的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游检测开发提供经过验证的结构化模板。
- 支持可重复、定量的成像输出，便于开展筛选工作。
- 实现跨项目样本制备和成像参数的标准化。
转化与临床前研究
- 将高分辨率成像与疾病相关系统相结合，推动转化生物标志物的发现。
- 通过保持天然状态下的结构保真度，确保从发现到临床前验证的连续性。
- 基于结构洞察支持经风险调整的推进决策。
流程与工作流整合
这种远程冷冻电子断层扫描工作流程通过提供可从任何位置访问的高分辨率、定量结构数据，连接了早期发现、先导物识别和临床前研究。
- 发现生物学：通过直接的分子可视化支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的成像结果，用于检测方法的标准化。
- 分析：实现对结构参数的可靠测量以及不同条件间的统计学比较。
- 转化研究：保持结构连续性，以支持生物标志物比对和疾病建模。
- 企业级复用：建立可扩展、支持远程访问的成像能力，为多个项目提供支持。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化成像工作流程，实现远程、可扩展的数据采集。
- 战略价值：支持科学的决策制定（推进或终止项目），并实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：促进基于风险调整的优先级排序以及跨职能的推进决策。
实施注意事项
- 需要具备冷冻电镜仪器操作和数据分析软件（Tomo5、emClarity）的专业知识。
- 需要强大的IT基础设施以支持远程访问和数据存储。
- 需要跨团队统一成像和分析流程的标准。
- 在不同类型样本间的应用可能需要对实验方案进行优化。
- 实际限制因素包括样本厚度、成像通量以及计算资源。
