小鼠脑中动脉闭塞诱导脑卒中后脑肌粘连血管病治疗模型

缺血性卒中是一种急性神经血管损伤，伴有毁灭性的慢性后遗症。在美国，大多数中风幸存者（每年 650，000 人）患有永久性功能残疾¹。没有一种可用的治疗方法在缺血性卒中的急性期后提供神经保护和功能恢复。急性缺血性中风后，直接和侧支血液供应减少，导致脑细胞和网络功能障碍，导致突发神经功能缺损^2，3。恢复缺血区域的血液供应仍然是中风治疗的首要目标。因此，增强血管生成以促进缺血区域的血液供应是一种有前途的治疗方法;然而，先前研究的促进卒中后血管生成的方法，包括促红细胞生成素、他汀类药物和生长因子，受到不可接受的毒性^或可转化性水平的限制4。

脑肌粘连血管病（EMS）是一种外科手术，可增强烟雾病患者的脑血管生成，烟雾病是一种经常导致中风的颅动脉狭窄的疾病。EMS 涉及患者颞肌的血管部分与颅骨部分分离，然后进行开颅手术并将肌肉移植到受影响的皮质上。该手术耐受性良好，可诱导脑血管生成，降低烟雾病患者缺血性卒中的风险^5，6。因此，该程序在这些患者中主要起到预防作用。在缺血性卒中的情况下，该手术带来的血管生成也可能在促进神经血管保护和恢复方面发挥作用。该报告支持这样的假设，即EMS带来的血管生成有可能扩大对脑缺血的理解和治疗选择。

除了EMS，还有几种药理学和手术方法来改善血管生成，但它们有几个局限性。由于一些限制，包括形成混乱、无序、渗漏和原始血管丛，已发现血管内皮生长因子 （VEGF） 给药等药理学方法不足甚至有害，其类似于在肿瘤组织中发现的血管丛^7，8 并且在临床试验中没有有益效果⁹.

手术方法包括直接吻合术，例如颞浅动脉-大脑中动脉吻合术，间接吻合术，例如脑-杜罗动脉-联合血管（EDAS），脑肌粘连血管病（EMS），以及直接和间接吻合的组合¹⁰。所有这些程序在小动物中都非常具有技术挑战性和要求，除了EMS。其他手术需要复杂的血管吻合术，而EMS需要相对简单的肌肉移植。此外，颞肌与皮层的接近使其成为移植的自然选择，因为它不需要完全切除或断开其血液供应，如果使用更远的肌肉进行移植，这是必要的。

EMS 已在大鼠^7，11 的慢性脑灌注不足模型中进行了研究。然而，使用颞肌移植的EMS从未在啮齿动物的急性缺血性卒中中中中得到研究。在这里，我们描述了通过大脑中动脉闭塞模型（MCAo ）在 缺血性中风后小鼠中EMS的新方案。本手稿描述了MCAo后小鼠EMS的这种新方法的方法和早期数据。

所有实验均由康涅狄格大学健康机构动物护理和使用委员会批准，并按照美国指南进行。以下协议应适用于任何种类或品系的啮齿动物。在这里，使用8至12周龄，年龄和体重匹配的C57BL / 6野生型雄性小鼠。小鼠随意喂食标准食物饮食 和水。标准住房条件保持在72.3°F和30%-70%相对湿度，光照/黑暗循环12小时。

1. 术前准备

1. 手术前通过高压灭菌对所有器械进行灭菌。用70%乙醇消毒操作表面，并用电加热垫将操作表面加热至37°C。
2. 使用诱导室用4%-5%异氟醚麻醉小鼠进行诱导。通过鼻锥 输送 1.5%-2.0%异氟醚进行维护，直到手术结束。在手术前，通过评估对坚定的后脚捏合缺乏反应以及姿势反应和矫正反射的丧失，确保小鼠得到适当的麻醉。
3. 将鼠标放在手术表面上的左侧，涂抹眼膏以保护双眼。
4. 用电剪在手术区域（即眼睛和耳朵之间的右外侧颅骨）剃毛。从手术部位中间向外以同心圆清洁手术区域，然后用70%乙醇和聚维酮溶液，并重复这些步骤2次。
   注意:由于手术部位靠近眼睛，因此可能无法切除手术部位周围 150% 的区域以避免对眼睛的刺激或意外伤害。
5. 通过皮下注射给予单剂量的0.25%布比卡因（高达8mg / kg体重），作为手术部位的术前镇痛。
6. 以4倍放大倍率设置手术显微镜。显微镜用于所有手术步骤。

2. 手术程序

注意:手术步骤如图 1所示。对于该协议，将三只小鼠分配给假手术组，三只小鼠单独用于EMS，12只小鼠分配给MCAo，23只小鼠分配给MCAo + EMS组。

1. MCAo手术
   注意:MCAo是啮齿动物缺血性中风的一个特征良好的模型，正如我们和其他人所描述的¹²，^13，14。此处简要描述了手术步骤。在异氟醚麻醉下，右MCAo在60分钟后再灌注7或21天，诱导局灶性短暂性脑缺血。
   1. 通过颈外动脉残端从颈内动脉分叉推进 10-11 mm 长的 6.0 硅橡胶涂层单丝，先切开腹颈中线切口，然后进行单侧右 MCAo。在假小鼠中，除了缝合线推进到颈内动脉外，进行相同的手术。
   2. 使用温度控制系统测量直肠温度，在手术过程中使用自动加热垫将温度保持在~37°C。
   3. 在缝合线插入之前，使用激光多普勒血流仪测量脑血流量，方法是将多普勒探头放在颅骨外侧（对应于MCA区域）并记录值⁸。要确认闭塞减少到基线脑血流量的 15%，请在缝合后使用相同的程序。要确认再灌注，请在拆线后使用相同的程序。
   4. 用湿醪喂养所有动物，直到处死和/或手术后 1 周，以确保慢性终点有足够的营养，因为动物在中风后有饲养缺陷。
2. 特快专递手术
   1. MCAo60分钟后，将小鼠随机分为仅MCAo或MCAo + EMS组。在MCAo（MCAo + EMS组）后4小时进行EMS，或对选定的实验进行假手术（仅EMS组）。手术前换上一副新的无菌手术手套。
      注意:小鼠在MCAo60分钟后从麻醉中恢复，并在EMS手术前重新麻醉。
   2. 对于接受 EMS（MCAo + EMS 或仅限 EMS 的组）的组，用剪刀做一个 10-15 毫米的皮肤切口，从 1-2 毫米的嘴部延伸到右耳，再到 1-2 毫米的尾部到右眼。
      注意:使用无菌剪刀来防止意外损坏下面的颞肌。
   3. 使用夹子收起皮瓣，目视识别颞肌和颅骨。
   4. 用剪刀和展开技术将颞肌从颅骨上直接解剖。沿肌肉尾缘进行 2-3 mm 腹侧肌切开术，以促进腹侧反射。
   5. 使用微型钻头在反射的颞肌下方的颅骨处进行直径~5毫米的开颅手术。
   6. 用镊子取出硬脑膜，露出大脑的表面。要格外小心，以免意外伤害大脑。
   7. 用6-0根单烯细丝将颞肌的背缘缝合到背侧皮瓣的皮下组织，使其与暴露的大脑皮层齐平。
   8. 用6-0单丝缝合线关闭皮肤切口。将鼠标放回笼子中并监测直到从麻醉中恢复。将鼠标放回其外壳设施。

3.术后注意事项

1. 每天监测小鼠的疾病和手术部位的感染。每日给予皮下生理盐水（按体重计体积为 1%）以支持补液。
2. 监测严重脱水（体重减轻>20%），直到手术后 7 天。如果体重减轻 >20%，则额外推注皮下注射 1% 体积（按体重计）的生理盐水。
3. 进行注射、生理监测和其他测试，无需特殊考虑。
   注意:在此程序中，避免使用阿片类药物或非甾体抗炎药（NSAIDs）治疗术后，因为这些药物对中风结局或梗死大小的已知影响与内部机构动物护理和使用委员会^协商15，^16，17，18。然而，强烈建议使用术后镇痛药进行其他型号的EMS手术。请咨询机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

本研究共使用了41只小鼠。在三次死亡后，一次在MCAo中，两次在MCAo + EMS中，总共使用38只小鼠来获得所示结果。

统计学
每个实验的数据以平均±标准差（S.D.）表示。使用未配对学生的t检验来比较两组，或者使用单因素方差分析来确定两组以上的显著性，并使用Newman-Keuls事后检验来校正多重比较。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原）-四唑还原酶（NADH-TR）染色
进行这种染色是为了评估移植肌肉的长期活力，如Turoczi等人19。简而言之，在处死时，小心地切除移植的肌肉瓣，用4%多聚甲醛固定30分钟，并在-80°C的最佳切割温度（OCT）介质中冷冻保存。 对几个 12 μm 厚的颞肌组织冷冻切片进行染色，以进行 NADH-TR 酶-组织化学反应。将载玻片在37°C下在硝基蓝四唑（1.8mg / dL）和NADH（15mg / dL）的溶液中在0.05M Tris缓冲液（pH 7.6）中孵育30分钟。使用增加然后降低丙酮浓度除去未使用的四唑试剂。对以40倍放大倍率拍摄的肌肉图像进行NADH-四唑染色肌肉的定量评估。

免疫染色研究
免疫染色用于可视化肌肉移植与肌肉和皮层交界处的皮层和血管密度的结合20，21。为了可视化肌肉与脑组织的结合，这里使用了接受过EMS手术的小鼠。在每个相应时间点结束时，用阿弗丁注射液（50mg / kg体重）麻醉小鼠，然后用含有5mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1x PBS灌注并用4%多聚甲醛固定。头骨被仔细切割，以防止颞肌（TM）移植物从大脑皮层意外分离。然后将大脑皮层上方的TM移植物与剩余的颞肌分离。小心地取出大脑并在4%多聚甲醛中过夜后固定。然后将固定的大脑在1x PBS中用30%蔗糖脱水，直到大脑沉入小瓶底部（约1-3天）。用冷冻切片机切割30μm大小的组织切片并安装在载玻片上。

为了对同侧脑皮层中的血管进行免疫染色，处死MCAo和MCAo + EMS小鼠，灌注，固定并如上所述进行处理。将30μm大小的脑切片在冷冻切片机上并安装在玻璃侧。使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，切片与封闭缓冲液一起孵育，然后与一抗，抗α骨骼肌肌动蛋白1:200和凝集素-Dy59421，22孵育过夜。从布雷格玛取每只小鼠的三个冠状脑切片（n = 5只小鼠/组;总共= 15个切片）在0.45mm至0.98mm之间，染色，并在缺血核心和半影区域交界处以20倍放大倍数可视化定量。盲法观察者使用 ImageJ 软件量化脑实质中的凝集素阳性血管密度。

EMS 后 21 天肌肉移植仍然可行
这种手术成功的一个先决条件是移植的颞肌的长期存活能力。TM移植显示移植肌肉与对照肌肉在术后7天肌肉细胞短暂损伤（71.32%的肌肉细胞存活率±16.64%对97.19%±3.81%）。然而，移植肌肉和对照肌肉之间的差异消失了，肌肉在手术后21天完全恢复（98.22%±3.965±96.87%2.27%; 图2A）。

肌肉移植与脑组织形成松散的结合
成功将颞肌移植到大脑皮层表面是该模型成功的首要要求。在EMS + MCAo和仅EMS模型中，颞肌移植物在EMS后21天粘附在皮质表面，表明手术成功，移植物植入和粘合（图1B和图2B）。

EMS后病灶周围皮层血管密度增加
急性卒中导致脑血流量急剧减少、侧支血管募集受阻、血管发芽异常和血管生成功能障碍，从而导致卒中结局不佳23。EMS显著增加卒中后病灶周围皮层的血管表面积和综合密度（p < 0.05 vs 仅 MCAo; 图3）。

血管生成和神经调节蛋白分析
根据制造商的说明，使用小鼠血管生成阵列比较MCAo后7天和21天在仅MCAo与MCAo + EMS小鼠中血管生成和神经调节蛋白的表达24。ImageJ软件用于量化蛋白质点印迹的每个数据点的像素密度。数据记录为每种分析蛋白质的密度与每个印迹标准品的平均密度之比。

EMS 后成纤维细胞生长因子 （FGF） 酸性上调，骨桥蛋白下调
蛋白质阵列结果显示，中风后 21 天，MCAo + EMS 组 FGF 酸性蛋白质水平显着升高（0.677 ± 0.007 vs. 0.585 ± 0.014，p = 0.045），骨桥蛋白水平降低，骨桥蛋白水平降低，骨桥蛋白是一种在炎症条件下表达的多功能分子（0.692 ± 0.007 vs. 0.758 ± 0.014，p = 0.048），表明血管生成和神经保护得到改善（图 4A）。

卒中后 EMS 的死亡率结局
MCAo和EMS都是侵入性手术技术，可能导致小鼠死亡。在该实验中，MCAo手术后21天的小鼠死亡率在10%-11%之间，这是接受60分钟MCAo 14的小鼠的可接受死亡率。在MCAo后对小鼠进行EMS并没有增加死亡率（图4B），这表明即使在MCAo之后对EMS手术的耐受性。

图1.大脑中动脉闭塞（MCAo）后的逐步EMS程序: （A）步骤1。在大脑右中动脉区域做一个皮肤切口。皮肤和皮下组织被反射，暴露颅骨和颞肌。第 2 步。颞肌从颅骨上解剖并反射到腹侧。第 3 步。进行开颅手术（4-5毫米），轻轻切除硬脑膜。第 4 步。颞肌直接放置在大脑表面以覆盖暴露的皮层。第5步。颞肌的背缘缝合到背侧皮瓣的皮下组织，与脑表面齐平。第 6 步。切口关闭，将小鼠从麻醉中取出并返回其笼子。这部分图已从25修改而来。（B）MCAo诱导的脑肌粘连血管病（EMS）治疗的概念图。缩写:FGF = 成纤维细胞生长因子。 请点击此处查看此图的大图。

图2.免疫染色研究。 （A）颞肌移植物保持活力。缺血性皮层组织上的颞肌移植物（EMS）保持高活力。（左）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原）-四唑还原酶染色肌肉组织细胞的代表性图像来自对照组（对侧的幼稚肌）和移植肌肉在大脑中动脉闭塞（MCAo）+脑肌粘连血管病（EMS）手术后7天。黑色箭头 （） 表示受损的细胞。（右）活/死肌肉细胞的定量。EMS后7天的肌肉细胞显示出一些轻微的损伤（p < 0.1;t检验），在21天时完全恢复。（n = 5只小鼠/时间点=该组中总共10只小鼠）数据平均值± S.D. 比例尺 = 20 μm。 （B）EMS手术后21天移植的颞肌与脑皮层的结合。用抗α骨骼肌肌动蛋白（绿色）和凝集素-Dy594（红色;血管标志物）抗体（n = 3只小鼠）染色的EMS组织。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:脑肌粘连血管病 （EMS） 手术会增加中风后 21 天缺血病变的血管密度。 （A）经受（左）大脑中动脉闭塞（MCAo）或（右）MCAo + EMS的小鼠的冠状脑切片的代表性图像，并用L. esculentum（番茄）凝集素-Dy594染色，其与内皮细胞基底膜中的糖蛋白结合。图形是量化区域。MCAo + EMS小鼠使用血管分数面积（B）和积分密度（C）等参数显示出更高的内皮网络。**p < 0.01（未配对的t检验），而仅MCAo小鼠在缺血病变附近显示出损伤（虚线）。N = 5只小鼠/组= 总共10只小鼠。数据是平均值± S.D. 比例尺 = 100 μm。 缩写:对立=对侧;Ipsi =同侧。请点击此处查看此图的大图。

图4:脑肌粘连血管病调节中风后血管生成蛋白 。 （A）使用小鼠血管生成阵列（ARY015）同时评估来自病灶周围皮层的脑组织裂解物中大脑中动脉闭塞（MCAo）和MCAo + EMS（MCAo后第21天）后53种小鼠血管生成相关蛋白的相对水平。定量分析表明，与同侧MCAo相比，EMS手术可显着降低骨桥蛋白并增加脑卒中后成纤维细胞生长因子（FGF）-酸性蛋白（*p < 0.05或**p < 0.01）。数据是平均± S.D.;n = 3只小鼠/组/时间点=总共15只小鼠。（B）EMS没有增加中风后死亡率（MCAo）。Kaplan Meier生存曲线显示，与单独使用MCAO相比，EMS + MCAO没有改变卒中后死亡率（p = 0.54）。对于 EMS n = 3;对于 MCAo n = 11;对于 MCAo + EMS n = 21。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有利益冲突需要披露。