Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Модель лечения энцефаломиосинангиоза после инсульта, вызванного окклюзией средней мозговой артерии, у мышей

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Протокол направлен на предоставление методов энцефаломиосинангиоза - пересадки сосудистого височного мышечного лоскута на пиальную поверхность ишемизированной мозговой ткани - для лечения немоямоя острого ишемического инсульта. Эффективность подхода в увеличении ангиогенеза оценивается с использованием модели транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у мышей.

Abstract

Для большинства пациентов, страдающих ишемическим инсультом, нет эффективного лечения, что делает разработку новых терапевтических средств обязательной. Способность мозга к самовосстановлению после ишемического инсульта ограничена недостаточным кровоснабжением в пораженной области. Энцефаломиосинангиоз (ЭМС) – это нейрохирургическая процедура, которая достигает ангиогенеза у пациентов с моямой болезнью. Он включает в себя трепанацию черепа с размещением сосудистого височного мышечного трансплантата на ишемической поверхности мозга. ЭМС никогда не изучалась в условиях острого ишемического инсульта у мышей. Гипотеза, лежащая в основе этого исследования, заключается в том, что EMS усиливает церебральный ангиогенез на кортикальной поверхности, окружающей мышечный трансплантат. Протокол, показанный здесь, описывает процедуру и предоставляет исходные данные, подтверждающие осуществимость и эффективность подхода EMS. В этом протоколе после 60 мин транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) мыши были рандомизированы для лечения MCAo или MCAo + EMS. ЭМС проводили через 3-4 ч после окклюзии. Мышей приносили в жертву через 7 или 21 день после лечения MCAo или MCAo + EMS. Жизнеспособность темпорального трансплантата измеряли с помощью анализа никотинамидадениндинуклеотида с восстановленной тетразолиумредуктазой. Массив ангиогенеза мыши количественно определял экспрессию ангиогенного и нейромодулирующего белка. Иммуногистохимия использовалась для визуализации связи трансплантата с корой головного мозга и изменения плотности сосудов. Предварительные данные здесь свидетельствуют о том, что привитая мышца оставалась жизнеспособной через 21 день после ЭМС. Иммуноокрашивание показало успешную имплантацию трансплантата и увеличение плотности сосудов вблизи мышечного трансплантата, что свидетельствует об усилении ангиогенеза. Данные показывают, что EMS увеличивает фактор роста фибробластов (FGF) и снижает уровень остеопонтина после инсульта. Кроме того, EMS после инсульта не увеличивала смертность, предполагая, что протокол безопасен и надежен. Эта новая процедура эффективна и хорошо переносится и может предоставить информацию о новых вмешательствах для усиления ангиогенеза после острого ишемического инсульта.

Introduction

Ишемический инсульт представляет собой острую нейрососудистую травму с разрушительными хроническими последствиями. Большинство выживших после инсульта, 650 000 в год, в США страдают от постоянной функциональной инвалидности1. Ни один из доступных методов лечения не обеспечивает нейропротекцию и функциональное восстановление после острой фазы ишемического инсульта. После острого ишемического инсульта как прямые, так и коллатеральные запасы крови уменьшаются, что приводит к дисфункции клеток и сетей мозга, что приводит к внезапному неврологическому дефициту 2,3. Восстановление кровоснабжения ишемической области остается первостепенной целью терапии инсульта. Таким образом, усиление ангиогенеза для стимулирования кровоснабжения на ишемической территории является перспективным терапевтическим подходом; однако ранее изученные методы стимулирования постинсультного ангиогенеза, включая эритропоэтин, статины и факторы роста, были ограничены неприемлемыми уровнями токсичности или транслируемости4.

Энцефаломиосинангиоз (ЭМС) - это хирургическая процедура, которая усиливает церебральный ангиогенез у людей с болезнью моямоя, состоянием суженных черепных артерий, которое часто приводит к инсульту. EMS включает в себя частичное отслоение сосудистого отдела височной мышцы пациента от черепа с последующей трепанацией и пересадкой мышцы на пораженную кору. Эта процедура хорошо переносится и индуцирует церебральный ангиогенез, снижая риск ишемического инсульта у пациентов с моемой болезнью 5,6. Таким образом, процедура выполняет в значительной степени профилактическую роль у этих пациентов. Ангиогенез, вызванный этой процедурой, также может играть роль в содействии нейрососудистой защите и восстановлению в условиях ишемического инсульта. Этот отчет поддерживает гипотезу о том, что ангиогенез, вызванный EMS, может расширить понимание и терапевтические возможности ишемии головного мозга.

Помимо EMS, существует несколько фармакологических и хирургических подходов к улучшению ангиогенеза, но они имеют несколько ограничений. Фармакологические подходы, такие как введение фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), оказались недостаточными или даже вредными из-за ряда ограничений, включая образование хаотичных, дезорганизованных, протекающих и примитивных сосудистых сплетений, которые напоминают те, которые обнаружены в опухолевых тканях 7,8 и не оказывают благотворного влияния в клинических испытаниях9.

Хирургические подходы включают прямой анастомоз, такой как анастомоз поверхностной височной артерии-средней мозговой артерии, непрямой анастомоз, такой как энцефало-дуро-артерио-синангиоз (ЭДАС), энцефаломиосинангиоз (ЭМС) и комбинации прямого и непрямого анастомоза10. Все эти процедуры очень технически сложны и требовательны у мелких животных, за исключением EMS. В то время как другие процедуры требуют сложного сосудистого анастомоза, EMS требует относительно простого мышечного трансплантата. Более того, близость височной мышцы к коре делает ее естественным выбором для пересадки, так как ее не нужно полностью иссекать или отключать от кровоснабжения, как это было бы необходимо, если бы для пересадки использовалась более отдаленная мышца.

EMS был изучен в моделях хронической церебральной гипоперфузии у крыс 7,11. Тем не менее, EMS с использованием трансплантата височной мышцы никогда не изучался при остром ишемическом инсульте у грызунов. Здесь мы описываем новый протокол ЭМС у мышей после ишемического инсульта с помощью модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAo). Эта рукопись служит описанием методов и ранних данных для этого нового подхода EMS у мышей после MCAo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию UConn Health и проводились в соответствии с руководящими принципами США. Следующий протокол должен работать у любого вида или штамма грызунов. Здесь использовались самцы мышей дикого типа C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель, возраст и вес. Мышей кормили стандартной диетой чау и водой ad libitum. Стандартные жилищные условия поддерживались на уровне 72,3 ° F и относительной влажности 30-70% с циклом 12 часов света / темноты.

1. Предоперационная подготовка

  1. Стерилизуйте все инструменты путем автоклавирования перед операцией. Продезинфицируйте рабочую поверхность 70% этанолом и прогрейте рабочую поверхность до 37 °C с помощью электрической грелки.
  2. Используйте индукционную камеру для обезболивания мыши 4%-5% изофлураном для индукции. Доставляют 1,5%-2,0% изофлурана через носовой конус для поддержания до конца операции. Убедитесь перед операцией, что мышь должным образом обезболена, оценив отсутствие реакции на твердое защемление задней ноги и потерю постуральной реакции и корректирующего рефлекса.
  3. Поместите мышь на левую сторону на операционную поверхность и нанесите глазную мазь для защиты обоих глаз.
  4. Брейте волосы над хирургическим полем (т.е. правым боковым черепом между глазом и ухом) с помощью электрических машинок для стрижки. Очистите хирургическое поле концентрическими кругами наружу от середины хирургического участка, с 70% этанолом, за которым следует раствор повидона, и повторите эти шаги 2 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за того, что место операции находится близко к глазу, удаление 150% области, окружающей хирургический участок, может быть невозможным, чтобы избежать раздражения или случайной травмы глаза.
  5. Вводят однократную дозу 0,25% бупивакаина (до 8 мг/кг массы тела) путем подкожной инъекции в качестве предоперационной анальгезии в месте операции.
  6. Настройте хирургический микроскоп с 4-кратным увеличением. Микроскоп используется для всех хирургических этапов.

2. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы операции представлены на рисунке 1. Для этого протокола три мыши были выделены в фиктивную группу, три мыши для одной только EMS, 12 мышей для MCAo и 23 мыши для группы MCAo + EMS.

  1. Хирургия MCAo
    ПРИМЕЧАНИЕ: MCAo является хорошо охарактеризованной моделью ишемического инсульта у грызунов, как описано нами и другими 12,13,14. Этапы операции кратко описаны здесь. Фокальная транзиторная церебральная ишемия индуцировалась 60-минутным правым MCAo под изофлурановой анестезией с последующей реперфузией в течение 7 или 21 дня.
    1. Сделайте вентральный разрез шеи средней линии с последующим односторонним правым MCAo, продвигая монофиламент из внутренней сонной артерии длиной 10-11 мм длиной 6,0 силиконового покрытия от бифуркации внутренней сонной артерии через культю наружной сонной артерии. У фиктивных мышей выполняют идентичные операции, за исключением продвижения шва во внутреннюю сонную артерию.
    2. Измеряйте ректальную температуру с помощью системы контроля температуры, поддерживая температуру на уровне ~ 37 ° C во время операции с помощью автоматической грелки.
    3. Используйте лазерную допплеровскую флоуметрию для измерения мозгового кровотока перед введением шва путем размещения допплеровского зонда против бокового черепа (соответствующего территории MCA) и регистрации значения8. Чтобы подтвердить снижение окклюзии до 15% от исходного мозгового кровотока, используйте ту же процедуру после того, как шов будет выдвинут. Чтобы подтвердить реперфузию, используйте ту же процедуру после снятия шва.
    4. Кормите всех животных влажным пюре до жертвоприношения и / или через 1 неделю после операции, чтобы обеспечить адекватное питание для хронических конечных точек, так как животные имеют дефицит выращивания после инсульта.
  2. Хирургия EMS
    1. После 60 минут MCAo рандомизируйте мышей в группы только MCAo или MCAo + EMS. Выполняйте EMS через 4 ч после MCAo (группа MCAo + EMS) или фиктивную операцию для отдельных экспериментов (группа только EMS). Перед операцией переодевайтесь в новую пару стерильных хирургических перчаток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши восстановились после анестезии после 60 минут ПРИЕМА MCAo и были повторно обезболены перед операцией EMS.
    2. Для групп, получающих EMS (MCAo + EMS или EMS-только группы), сделайте разрез кожи 10-15 мм ножницами, простирающийся от 1-2 мм рострального до правого уха до 1-2 мм каудального правого глаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные ножницы использовались для предотвращения случайного повреждения височных мышц под ними.
    3. Втягивайте кожные лоскуты с помощью зажимов и визуально идентифицируйте височную мышцу и череп.
    4. Тупо рассекните височную мышцу от черепа с помощью ножниц с помощью техники распространения. Выполняют миотомию 2-3 мм, направленную вентрально вдоль каудальной границы мышцы для облегчения вентрального отражения.
    5. Выполните трепанацию черепа диаметром ~ 5 мм под отраженной височной мышцей с помощью микродресла.
    6. Удалите твердую мозговую оболочку пинцетом, чтобы обнажить пиальную поверхность мозга. Соблюдайте крайнюю осторожность, чтобы избежать случайного повреждения головного мозга.
    7. Пришить дорсальную границу височной мышцы к подкожной клетчатке дорсального кожного лоскута с 6-0 монокриловыми нитями, делая ее приливной к открытой коре головного мозга.
    8. Закройте разрез кожи 6-0 монофиламентным швом. Поместите мышь обратно в клетку и следите за восстановлением после анестезии. Верните мышь в ее корпус.

3. Послеоперационные соображения

  1. Ежедневно контролируйте мышей на наличие болезни и место хирургического вмешательства на предмет инфекции. Ежедневно давайте подкожно нормальный физиологический раствор (1% объема от массы тела) для поддержки гидратации.
  2. Следите за сильным обезвоживанием (потеря массы тела >20%) до 7 дней после операции. Вводят дополнительный болюс подкожного нормального физиологического раствора 1% объема по массе тела, если >20% потери веса.
  3. Приступайте к инъекциям, физиологическому мониторингу и другим испытаниям без особых соображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре использование опиоидов или нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) для лечения после операции было исключено из-за известного воздействия этих агентов на исход инсульта или размер инфаркта в консультации с внутренним институциональным комитетом по уходу за животными и его использованию 15,16,17,18. Тем не менее, использование послеоперационной анальгезии настоятельно рекомендуется для хирургии EMS с другими моделями. Пожалуйста, обратитесь к Институциональному комитету по уходу за животными и их использованию (IACUC) для этого.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В общей сложности для этого исследования была использована 41 мышь. После трех смертей, одной в MCAo и двух в MCAo + EMS, в общей сложности 38 мышей были использованы для получения показанных результатов.

Статистика
Данные каждого эксперимента представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (S.D.). Значимость определяли с помощью либо непарного t-теста студента для сравнения двух групп, либо одностороннего ANOVA для более чем двух групп, с пост-специальным тестом Ньюмана-Кеулса для коррекции нескольких сравнений.

Окрашивание никотинамидадениндинуклеотида (восстановленного)-тетразолиумредуктаза (NADH-TR)
Это окрашивание было сделано для оценки долгосрочной жизнеспособности привитой мышцы, как в Turoczi et al.19. Вкратце, во время жертвоприношения привитый мышечный лоскут тщательно иссекали, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин и криоконсервировали в среде оптимальной температуры резания (ОКТ) при -80 °C. Несколько криосекций височной мышечной ткани толщиной 12 мкм были окрашены для ферментно-гистохимической реакции фермента NADH-TR. Слайды инкубировали в течение 30 мин при 37 °C в растворе тетразолия нитроблю (1,8 мг/дл) и NADH (15 мг/дл) в буфере 0,05 М Триса (рН 7,6). Неиспользованный тетразолиевый реагент удаляли с помощью увеличения с последующим снижением концентрации ацетона. Количественная оценка мышц, окрашенных NADH-тетразолием, проводилась на снимках мышц, сделанных при 40-кратном увеличении.

Иммуноокрашивающие исследования
Иммуноокрашивание использовалось для визуализации связи мышечного трансплантата с корой и плотностью кровеносных сосудов на стыке мышц и коры20,21. Для визуализации мышечной связи с мозговой тканью здесь использовались мыши, перенесшие операцию EMS. В конце каждой соответствующей точки времени мышей анестезировали инъекцией авертина (50 мг/кг массы тела), за которой следовала перфузия 1x PBS, содержащим 5 мМ этилендиаминеттрауксусной кислоты (ЭДТА), и фиксация 4% параформальдегидом. Череп был тщательно разрезан, чтобы предотвратить случайное отслоение трансплантата височной мышцы (ТМ) от коры головного мозга. Затем трансплантат ТМ над корой головного мозга отделяли от оставшейся височной мышцы. Мозг осторожно удаляли и постфиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи. Затем неподвижный мозг обезвоживали 30% сахарозы в 1x PBSтолько мозг погружался на дно флакона (примерно 1-3 дня). Участки тканей размером 30 мкм разрезали замерзающими микротомами и монтировали на слайды.

Для иммуноокрашивания кровеносных сосудов в ипсилатеральной коре головного мозга мышей MCAo и MCAo + EMS приносили в жертву, перфузировали, фиксировали и обрабатывали, как указано выше. Срезы мозга размером 30 мкм были разделены на замерзающем микротоме и установлены на стеклянной стороне. Извлечение антигена проводилось с использованием цитратного буфера (рН 6,0), а срезы инкубировали с блокирующим буфером с последующим инкубацией в течение ночи с первичными антителами, анти-альфа-актином скелетных мышц 1:200 и Лектин-Dy59421,22. Три корональных участка мозга на мышь (n = 5 мышей на группу; всего = 15 секций) были взяты между 0,45 мм и 0,98 мм от брегмы, окрашены и визуализированы для количественного определения при 20-кратном увеличении на стыке областей ишемического ядра и полутени. Слепой наблюдатель количественно оценил положительную плотность сосудов лектина в паренхиме мозга с помощью программного обеспечения ImageJ.

Мышечный трансплантат остается жизнеспособным через 21 день после EMS
Одной из предпосылок успеха этой операции является долгосрочная жизнеспособность привитой височной мышцы. Трансплантат ТМ показал преходящее повреждение мышечных клеток через 7 дней после операции в трансплантированной мышце по сравнению с контрольной мышцей (71,32% выживаемости мышечных клеток ± 16,64% против 97,19% ± 3,81%). Однако эта разница между привитой и контрольной мышцами исчезла, и мышцы полностью восстановились через 21 день после операции (98,22% ± 3,965 против 96,87% ± 2,27%; Рисунок 2А).

Мышечные трансплантаты создают свободные связи с мозговой тканью
Успешная пересадка височной мышцы на поверхность коры головного мозга является главным требованием для успеха этой модели. Как в модели EMS + MCAo, так и только в модели EMS, трансплантаты височной мышцы прилипали к кортикальной поверхности через 21 день после EMS, что свидетельствует об успешной операции, имплантации трансплантата и связывании (рисунок 1B и рисунок 2B).

Плотность кровеносных сосудов увеличивается в перилезионной коре после EMS
Острый инсульт приводит к острому снижению мозгового кровотока, затруднению набора коллатеральных сосудов, аномальному прорастанию сосудов и дисфункциональному ангиогенезу, которые способствуют плохим исходам инсульта23. EMS значительно увеличивает площадь поверхности кровеносных сосудов и интегральную плотность в перилезионной коре после инсульта (p < 0,05 по сравнению с MCAo-only; Рисунок 3).

Анализ ангиогенных и нейромодулирующих белков
Массив ангиогенеза мышей использовался для сравнения экспрессии ангиогенных и нейромодулирующих белков через 7 дней и 21 день после MCAo у мышей только MCAo и MCAo + EMS в соответствии с инструкциями производителя24. Программное обеспечение ImageJ использовалось для количественной оценки плотности пикселей для каждой точки данных белкового точечного пятна. Данные регистрировались как отношение плотности каждого анализируемого белка к усредненной плотности эталонов для каждого блотта.

Фактор роста фибробластов (FGF)-кислотный повышается, а остеопонтин понижается после EMS
Результаты белкового массива показали значительное повышение уровня белка FGF-кислотного (0,677 ± 0,007 против 0,585 ± 0,014, p = 0,045), мощного ангиогенного фактора и снижение уровня остеопонтина, многофункциональной молекулы, экспрессируемой при воспалительных состояниях (0,692 ± 0,007 против 0,758 ± 0,014, p = 0,048) в группе MCAo + EMS через 21 день после инсульта, что свидетельствует об улучшении ангиогенеза и нейропротекции (рисунок 4A).

Исходы смертности при ЭМС после инсульта
И MCAo, и EMS являются инвазивными хирургическими методами, которые могут вызвать некоторую смертность у мышей. В этом эксперименте смертность у мышей составляла от 10% до 11% через 21 день после операции MCAo, что является общепринятым коэффициентом смертности для мышей, подвергшихся 60 мин MCAo14. Выполнение EMS на мышах после MCAo не увеличивало смертность (рисунок 4B), что свидетельствует о переносимости операции EMS даже после MCAo.

Figure 1
Рисунок 1. Пошаговая процедура EMS после окклюзии средней мозговой артерии (MCAo): (A) Шаг 1. Над правой средней мозговой артерией делается разрез кожи. Кожа и подкожные ткани отражаются, обнажая череп и височную мышцу. Шаг 2. Височная мышца рассечена от черепа и отражается вентрально. Шаг 3. Выполняется трепанация черепа (4-5 мм) и аккуратно удаляется твердая мозговая оболочка. Шаг 4. Височная мышца помещается непосредственно на поверхность мозга, чтобы покрыть открытую кору. Шаг 5. Дорсальный край височной мышцы пришивается к подкожной клетчатке дорсального кожного лоскута, смывается с поверхностью мозга. Шаг 6. Разрез закрывают, а мышь извлекают из наркоза и возвращают в клетку. Эта часть рисунка была изменена с25. (B) Концептуальная схема лечения энцефаломиосинангиоза (EMS) MCAo-индуцированного инсульта. Сокращения: FGF = фактор роста фибробластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Иммуноизоляционные исследования. (A) Височно-мышечные трансплантаты сохраняют жизнеспособность. Трансплантаты височной мышцы (EMS) на ишемической ткани коры сохраняют высокую жизнеспособность. (Слева) Репрезентативное изображение никотинамидадениндинуклеотида (восстановленных)-тетразолиумредуктаз-окрашенных клеток мышечной ткани из контроля (наивная мышца с контралатеральной стороны) и привитой мышцы через 7 дней после окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) + энцефаломиосинансиоза (EMS). Черная стрелка () показывает поврежденные клетки. (Справа) Количественная оценка живых/мертвых мышечных клеток. Мышечные клетки через 7 дней после EMS показывают некоторые легкие повреждения (p < 0,1; t-тест), которые полностью восстанавливаются через 21 день. (n = 5 мышей/временных точек = всего 10 мышей в этой группе) Данные являются средними ± S.D. Шкала bar = 20 мкм. (B) Связывание привитой височной мышцы с корой головного мозга через 21 день после операции EMS. Ткани EMS окрашены анти-альфа-актином скелетных мышц (зеленый) и антителом Lectin-Dy594 (красный; маркер кровеносных сосудов) (n = 3 мыши). Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Операция энцефаломиосинангиоза (ЭМС) увеличивает плотность кровеносных сосудов при ишемических поражениях через 21 день после инсульта. (А) Репрезентативные изображения корональных отделов мозга у мышей, подвергшихся (левой) окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) или (правой) MCAo + EMS и окрашенных L. esculentum (Tomato) Lectin-Dy594, который связывается с гликопротеинами в базальной мембране эндотелиальных клеток. Графики — это количественные области. Мыши MCAo + EMS показали более высокую эндотелиевую сеть с использованием параметров, а именно области сосудистой фракции (B) и интегральной плотности (C). **p < 0,01 (непарный t-тест), в то время как мыши только MCAo показали повреждения, близкие к ишемическому поражению (пунктирная линия). N = 5 мышей/группа= всего 10 мышей. Данные являются средними ± S.D. Шкала бар = 100 мкм. Сокращения: Contra = контралатеральная сторона; Ipsi = ипсилатеральная сторона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Энцефаломиосинангиоз модулирует ангиогенные белки после инсульта. (A) Массив ангиогенеза мыши (ARY015) был использован для одновременной оценки относительных уровней 53 белков, связанных с ангиогенезом мыши, после окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) и MCAo + EMS (день 21 после MCAo) в лизатах ткани мозга из перилезионной коры. Количественный анализ показывает, что операция EMS значительно снизила остеопонтин и повышенный фактор роста фибробластов (FGF)-кислый белок после инсульта (*p < 0,05 или **p < 0,01) по сравнению с ipsilateral MCAo. Данные являются средними ± S.D.; n = 3 мыши/группа/точка времени = всего 15 мышей. (B) EMS не увеличивала смертность после инсульта (MCAo). Кривая выживаемости Каплана Мейера показывает, что EMS + MCAO не изменили постинсультную смертность по сравнению с MCAO в одиночку (p = 0,54). Для ЭМС n = 3; для MCAo n = 11; и для MCAo + EMS n = 21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает успешную процедуру EMS в мышиной модели MCAo-индуцированного инсульта. Данные показывают, что трансплантированная ткань остается жизнеспособной и может образовывать связи с корой головного мозга еще долго после операции EMS. Эти результаты подтверждают обоснование использования трансплантата мышц головного мозга для постепенного развития богатой сосудистой трофической среды в месте инсульта. EMS является многообещающей терапией для потенциального восстановления инфарктной мозговой ткани в той же среде.

Критические шаги протокола включают шаг 2.2.4: этот шаг вызывает неизбежную травму ТМ, что может снизить ее способность связываться с корой и высвобождать трофические факторы. Позаботьтесь о том, чтобы ограничить травму ТМ, насколько это возможно. Альтернативная стратегия уменьшения травмы тканей заключается в том, чтобы тупо рассекнуть ТМ от черепа только на его дорсальной границе и отказаться от миотомии. В этом случае ТМ будет поднята от черепа (а не полностью отражена), и трепанация черепа будет выполнена с помощью трелевки черепа под мышцей. Это уменьшает количество пространства, доступного для выполнения этого шага, но опять же может уменьшить травму ТМ. Кроме того, на этапах 2.2.5 и 2.2.6 необходима чрезвычайная осторожность и практика для предотвращения повреждения основной коры головного мозга во время трепанации черепа и манипуляций с твердой мозговой оболочкой.

Эта модель EMS является естественным дополнением к устоявшейся модели MCAo. Поскольку модель MCAo близко имитирует патофизиологию ишемии и повреждения сосудистой сети, что часто встречается у пациентов с человеческими пациентами, модель MCAo + EMS, вероятно, будет иметь высокий уровень переводимости для людей. Представленная здесь модель EMS является первым терапевтическим вмешательством, которое было изучено для ишемического инсульта в доклинических условиях, которые полагаются только на аутологичную ткань. Более того, поскольку трансплантат ТМ является органическим и аутологичным, он может демонстрировать паракринные сигнальные взаимодействия с соседним поврежденным мозгом, которые служат для регулирования высвобождения трофических факторов до оптимальных уровней в различные моменты времени.

В то время как инсульт создает проангиогенную среду и стимулирует сам ангиогенез26, внутренняя постинсультная реакция недостаточна для улучшения сосудистого снабжения в поврежденной области из-за подпороговых уровней ангиогенных факторов. Здесь EMS еще больше усилила экспрессию FGF-кислого белка по сравнению с животными, перенесшими инсульт. Этот белок косвенно контролирует неоваскуляризацию в сочетании с другими факторами роста. FGF-кислотный также работает как нейротрофический фактор, способствуя нейропротекции и нейрогенезу27,28. Некоторые из нейропротекторных эффектов FGF-кислоты опосредованы активацией путей AKT и MAPK/EPK29. В дополнение к FGF также наблюдалась сниженная экспрессия белка остеопонтина. Остеопонтин является провоспалительным, плеотропным цитокином, который все чаще признается за его роль в множественных невропатологиях и процессах ремоделирования тканей, среди других функций. Роль остеопонтина при инсульте до сих пор неизвестна30. Тем не менее, недавние исследования на людях указывают на то, что остеопонтин является плохим прогностическим фактором после инсульта. Снижение уровня остеопонтина в сыворотке крови после инсульта было показано в одном исследовании для прогнозирования благоприятных исходов (модифицированный балл по шкале Ранкина < 2 через 90 дней) у пациентов с инсультом31. Другое исследование показало дозозависимую связь между более высокими уровнями остеопонтина в плазме и исходами смерти и инвалидности у пациентов после инсульта32. В соответствии с этими клиническими исследованиями данные здесь свидетельствуют о том, что снижение остеопонтина после EMS может способствовать противовоспалительной среде для увеличения образования неосудорождений. В целом, дифференциальная экспрессия FGF-кислоты и остеопонтина указывает на механизмы, управляющие ангиогенезом после EMS в этой мышиной модели, и увеличивает вероятность того, что процедура, которая также может вызвать нейропротекцию и нейрорегенерацию в дополнение к ангиогенезу.

Существуют некоторые потенциальные ограничения этой процедуры. Измерение мозгового потока из-за увеличения плотности кровеносных сосудов является сложной задачей в этой процедуре, так как обычно используемые процедуры лазерного допплера или лазерного спекл-флоуметра зависят от наличия височной мышцы в верхней части коры, которые препятствуют истинному измерению крови на кортикальной поверхности. Таким образом, эта процедура может потребовать более сложного, но редко доступного МРТ-сканирования мелких грызунов, если требуется измерение потока в режиме реального времени. Тем не менее, использование измерения плотности кровеносных сосудов косвенно поддерживает успех процедуры EMS в улучшении ангиогенеза, как предполагают наши данные. Другим ограничением является инвазивный характер вмешательств EMS поверх MCAo, который сам по себе является инвазивной процедурой. Хотя в этом исследовании не было повышенной смертности при ЭМС по сравнению только с MCAo, потребность в гемикраниэктомии может ограничить ее будущую переводимость для всех типов инсульта. Однако в клинической практике >10% пациентов с большим ишемическим инсультом нуждаются в гемикраниэктомии для управления повышенным внутричерепным давлением23, и эта модель EMS может иметь трансляционное значение для этой подгруппы пациентов с инсультом в частности. Наконец, точка времени 4 ч после MCAo для выполнения EMS была выбрана, чтобы попасть в стандартное окно лечения rT-PA для большинства пациентов с человеком, хотя будущие исследования будут использовать более поздние временные точки для оценки терапевтического окна для EMS.

В целом, модель EMS обеспечивает хорошо переносимый вариант индуцирования ангиогенеза после ишемического инсульта, и в дополнение к его потенциальной клинической трансляции может быть использована в будущих исследованиях, изучающих патофизиологию инсульта и ангиогенеза.

Модель EMS, описанная здесь, предлагает безопасный метод достижения церебрального ангиогенеза для доклинического исследования, устраняя необходимость в фармакологических вмешательствах, которые часто приводят к нежелательным побочным эффектам или неконтролируемому ангиогенезу. Многие пациенты с большими ишемическими инсультами нуждаются в гемикраниэктомии во время их клинического течения, чтобы справиться с повышением внутричерепного давления. Эта процедура EMS, которая также включает гемикраниэктомию у мышей для пересадки мышц, может обеспечить доклиническое доказательство концепции трансляционного применения EMS при ишемическом инсульте. Таким образом, эта модель имеет потенциал для расширения знаний о нейрососудистом восстановлении после ишемического инсульта и для содействия развитию инноваций, которые являются потребностью часа, в терапии для выживших после инсульта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Программой передового опыта исследований - UConn Health (для Кетана Р. Булсара и Раджкумара Вермы) и стартапом UConn Health (для Раджкумара Вермы).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Tags

Неврология выпуск 184
Модель лечения энцефаломиосинангиоза после инсульта, вызванного окклюзией средней мозговой артерии, у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter