使用福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的质谱成像扩展肿瘤微环境的理解

克隆性肿瘤群体周围众多细胞类型的重要性是癌变分类的关键因素。在建立基于免疫的疗法作为癌症治疗武器库的一部分之后，对阐明这种肿瘤微环境（TME）组成和相互作用的兴趣不断上升。因此，治疗策略已从以肿瘤为中心的方法转变为以TME为中心的方法¹。

近年来，阐明免疫细胞在肿瘤监测和癌症发展中的作用的努力急剧增加^2，3.在医学研究中，大量的方法，包括基于细胞术的方法以及单重和多重成像技术，作为破译TME多种元素独特相互作用的尝试的一部分， 出现了。

流式细胞术（20世纪60年代发明）、荧光活化细胞分选和质量细胞术等开创性方法主要集中在鉴定和定量TME组分⁴上。尽管基于细胞术的定量技术允许免疫景观表型分析，但确定细胞空间分布是不可能的。相反，诸如标准单重免疫组织化学之类的方法保留了组织结构并使研究人员能够分析细胞分布，尽管单个组织切片中靶标数量的减少是这些方法的局限性^5，6。在过去几年中，用于单细胞分辨率的多重成像技术（如多重免疫荧光，条形码荧光成像和成像质谱）已成为使用相同的组织切片⁷获取同时标记染色信息的综合策略。

在这里，我们介绍了一种将金属标记抗体和二次离子质谱耦合的技术，并使用福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）和新鲜冷冻（FF）组织样品^8，9实现单细胞分辨率定量，标记物共表达（表型）和空间分析。FFPE样品是用于组织存档样品的最广泛使用的材料，并且比新鲜冷冻样品¹⁰更容易获得多重成像技术。此外，该技术还提供了在几个月后重新获取图像的可能性。在这里，我们讨论了使用FFPE组织样品的染色和图像处理方案。

根据德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会，出于研究目的获得了组织样本，并且样本进一步去鉴定。

1. 抗体选择

1. 定义研究问题以选择最佳可用的抗体克隆。使用人类蛋白质图谱、已发表的研究和抗体制造商网站作为研究资源。
   注意:选择足够的人体组织质控品和相同的人体组织质控品在不同步骤中染色对于确保标记物在正确的位置和正确的细胞区室中正确染色至关重要。始终建议使用包括正常组织和肿瘤组织在内的小组织微阵列（TMA）进行染色验证。
2. 仅使用无载体抗体来设计试剂盒。
   注意:如果没有商业无载体抗体，则需要使用无载体抗体制剂;纯化试剂盒可用于将抗体调整到正确的配方。已知蛋白质添加剂（如牛血清白蛋白）会降低偶联能力。
3. 使用标准色原性免疫组化测试和滴定每种抗体，以确定标记物表达的亚细胞模式;膜，细胞质或核染色;并在对照组织中的特定细胞中表达。
   注意:但是，每种抗体必须在pH 6柠檬酸盐和pH 9乙二胺四乙酸（EDTA）中进行测试，并且必须确定面板是否用pH 6柠檬酸盐或pH 9 EDTA染色。建议使用pH 9 EDTA来获得良好的信号，特别是在使用这种方法时。
4. 根据阳性对照中的表达模式选择最佳染色浓度。
5. 根据免疫组化标记丰度、亚细胞定位和细胞与其他靶标的共表达，将每种抗体分配给一种可用的金属同位素。
6. 用相应的指定金属染色抗体，并与先前使用的相同对照组织中的表达进行比较。
   注意:抗体金属偶联从抗体制备、还原和随后的偶联开始（补充文件1）。每个金属负载的聚合物管足以标记100μg抗体。

2. 抗体组合设计

1. 创建小批量抗体染色。在鸡尾酒中测试最多五个标记。
   注意:使用免疫组化分批测试已经偶联和分析的抗体有助于早期识别通道干扰，并提供与另一种金属重新结合抗体的机会。它还提供了评估足够的标记共表达的机会。
2. 用四种不同的抗体浓度（0.05微克/毫升、0.2微克/毫升、1微克/毫升和4.0微克/毫升）对每小批抗体进行染色。
   注意:比较不同的滴度，确定抗体浓度，从而以最小的背景染色（最佳信噪比）获得正确的位置和最高的表达。

3. 切片

1. 选择镀金载玻片（专门用于此目的），并将它们靠近切片机。通过将新刀片插入支架来准备切片机。将截面厚度设置为4-5μm。
2. 切片前将FFPE块放在冰上。通过将蒸馏水或去离子水（diH₂O）加热至40-45°C来制备组织浮浴。
   注意:使用 diH₂O 或蒸馏水可降低污染的可能性。
3. 开始切片。使用镊子将组织切片放入水中，使其变平。使用载玻片从水中取出组织切片。
4. 将载玻片放入载玻片架中，让它们在室温下干燥过夜。

4. 氟丙烯丙烷抗体染色

注意:染色过程在两个不同的天进行。

注意:本方案中使用的溶液具有潜在的腐蚀性，对皮肤和眼睛有危害。建议戴手套，实验室外套以及保护眼睛和面部设备，这是我们机构生物安全政策的一部分。

1. 试剂制备（第1天）
   1. 将 50 mL 20x Tris 缓冲盐水与吐温 （TBS-T） 稀释到 950 mL 二氢₂O 中，制成 1 L TBS-T。
   2. 将 8 mL 10x 三乙二胺四乙酸 （EDTA） 稀释到 72 mL 二H₂O 中，制成 1x 热诱导表位检索 （HIER） 溶液。
   3. 将驴血清在1x TBS-T中稀释至终浓度为5%以制成封闭缓冲液。将溶液储存在4°C直至准备使用。
2. 高温灭菌器制备:预处理模块
   注意:在处理浸入PT模块中使用的任何试剂中的任何试剂或部件时，请戴上化学防护手套。
   1. 将 140 mL 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释到 1，260 mL 二H₂O 中，制成 1.4 L 1x PBS。或者，将七个PBS片剂稀释成1.4L的diH₂O。
   2. 用1.4升PBS填充罐子，并将准备好的载玻片室容器与100毫升1x HIER溶液放入罐中。
   3. 将 PT 模块中的储罐预热至 75 °C。
3. 去除过量石蜡
   1. 在烤箱中以70°C烘烤载玻片至少20分钟。
      注意:某些纸巾或切片可能需要更长的烘烤时间。脑组织或TMA的推荐烘焙时间为1小时。这可以延长到16小时（过夜）或根据实验室经验。
   2. 将烘焙的载玻片放入载玻片架中，然后在通风橱下的摇摇杯上执行以下洗涤步骤。在以下溶液中洗涤载玻片:二甲苯2x30秒（无金属），100%酒精2x30秒（无金属），95%酒精2x30秒（无金属），80%酒精30秒（无金属），70%酒精30秒（无金属），diH₂O 2x30秒（无金属）。
   3. 将载玻片保存在新鲜的 diH₂O 容器中，直到准备好进行抗原检索。
      注意:在手术结束之前，不应干燥载玻片。
4. 抗原检索
   1. 将载玻片放入PT模块内装有1x HIER缓冲液的预热载玻片室中。将盖子放在油箱上。合上并锁住盖子。
   2. 按PT模块上的 "菜单 "按钮打开主菜单，然后按 设置周期 （时间和温度）按钮创建自定义程序。
   3. 在 97 °C 下运行 PT 模块 40 分钟。之后，PT模块将自动冷却至65°C。
   4. 一旦达到65°C温度，就从PT模块中取出载玻片。将载玻片在室温下保持30分钟。
      注:在温度冷却至65°C之前，PT模块不会打开。 在此过程中，请勿触摸载玻片的金色表面，并始终使用手套。
5. 抗体阻断
   1. 将摇床设置为 70 rpm。
   2. 将载玻片浸入 1x TBS-T 中清洗 5 分钟 2 倍。
   3. 使用疏水性屏障笔，在距离幻灯片边缘至少1毫米的组织部分周围画一个边框，并使其干燥15-30秒。
      注意:注意防止笔液接触组织切片，以避免任何组织干扰染色。在拉动障碍物时，不要用力按压笔，以避免潜在的泄漏。为了获得最佳的染色和图像采集结果，将组织切片放置在镀金载玻片的中间，在不大于15 mm x 30 mm的框架中，以留出足够的空间来绘制屏障，而无需接触组织或放置在载玻片外边缘的引导点。
   4. 要清除笔残留物，请将载玻片浸入 TBS-T。
   5. 在室温下的水分室中，用100-200μL封闭缓冲液孵育组织切片20分钟。将组织留在封闭缓冲液中孵育，直到抗体预混液准备就绪。
6. 抗体组合制备
   注意:抗体组合混合物的最终体积根据估计的组织切片表面积而变化。要覆盖20毫米x 20毫米的区域，请准备100-200微升鸡尾酒。
   做以下工作以制备金属同位素偶联抗体的抗体组合混合物:
   1. 确认鸡尾酒的最终体积等于添加到封闭缓冲液体积的抗体鸡尾酒体积。
   2. 在项目的面板电子表格中确认所有抗体、稀释液和/或抗体浓度的规格。
   3. 将所有含抗体的试管以10，000× g 离心5分钟。将单个抗体加入封闭缓冲液中并充分混合。移液时不要打扰抗体管的底部。
   4. 通过用100μL封闭缓冲液预润湿0.1μm离心过滤装置来过滤抗体组合。以10，000× g 旋转过滤器2分钟，并用移液管除去封闭缓冲液流出。
   5. 将抗体组合转移到离心柱中，并以10，000× g 旋转过滤器2分钟。丢弃离心柱，使用流过作为过滤的抗体面板。
      注意:制作鸡尾酒后立即进行染色，以防止金属交换。如果需要长时间储存抗体混合物，可以对其进行冻干。
7. 抗体染色
   1. 小心地从载玻片上取下封闭缓冲液，方法是将每张载玻片的侧面倾斜，然后轻轻地将边缘轻敲在任务刮水器上。
   2. 将载玻片置于水分室中，并向组织中加入100-200μL抗体预混液（避免与组织接触并产生气泡）。
   3. 将阳性和阴性对照载玻片添加到染色批次中。
   4. 将载玻片在4°C孵育过夜（14-16小时）。
8. 试剂制备（第2天）
   1. 将 100 mL 10x 低钡 PBS、pH 7.4 稀释在 900 mL 二H₂O 中，制成 1x PBS。
   2. 在低钡PBS中制备350 mL 2%戊二醛的工作储备溶液（340 mL低钡PBS + 10 mL 70%戊二醛）。
      注意:在罩下进行稀释。戊二醛是一种非常粘稠的液体。每次使用1 mL移液管并向戊二醛管中加入1 mL低钡PBS，直到它变得足够液体以倒出管外。
   3. 将 10x Tris、pH 8.5、900 mL 二氢₂0 稀释至 1x Tris。
9. 固定和脱水
   1. 将载玻片的侧面倾斜，然后轻轻地将边缘轻敲任务刮水器，从每张载玻片中取出抗体预混液。
   2. 在以下缓冲液中用轻度至中度搅拌洗涤载玻片:1x TBS-T，3x次，每次5分钟（无金属）;过滤2%戊二醛5分钟;过滤1x三，pH 8.5，3x持续30秒;过滤二H₂O 2x 30秒;70%酒精30秒（无金属）;80%酒精30秒（无金属）;95%酒精30秒（无金属）;和100%酒精30秒（无金属）。
   3. 轻轻敲击每个滑梯的边缘，以除去多余的酒精，并让残留的酒精在室温下蒸发（约5-10分钟）。
   4. 在图像采集之前，在干燥器中干燥载玻片至少1小时，或将载玻片保存在真空室中以进行长期储存。

5. 图像采集

1. 幻灯片设置
   注:在使用仪器进行扫描之前，必须按照以下步骤使用基于 Web 的图像管理应用程序定义和设置载玻片。
   1. 在基于 Web 的图像管理应用程序的幻灯片页面上，单击" 加入新幻灯片 "，然后输入所需的详细信息（名称、幻灯片标识、位置和说明）。
   2. 通过单击"添加分区"创建扫描 分区。填写每个部分的信息（项目名称、幻灯片名称、块和位置）。若要保存创建的新幻灯片/节，请单击" 提交"。
   3. 在资源选项卡下，打开面板页面并选择要使用的面板。对于新面板，请单击" 创建新面板"。
   4. 选择面板后，单击" 部分"。添加在步骤 2 中创建的部分。通过单击 "编辑分区分配"。通过单击 提交进行保存。
2. 仪器设置
   注:本仪器（见 材料表）使用特定的控制软件程序进行操作（见 材料表）。
   1. 登录到控制软件。如果仪器处于睡眠模式，请单击" 唤醒 "。
      注意:建议在操作前至少1小时预热仪器，这有助于光束聚焦稳定。
   2. 若要加载幻灯片，请单击" 交换示例"， 然后单击" 继续 "以打开门。将载玻片放入装载槽中，样品朝上，标签位于右侧。单击 "继续 "关闭门。
      注:如果幻灯片未正确加载，将出现警告声音和调整幻灯片的通知。
   3. 选择项目，然后选择加载的示例的幻灯片名称。
   4. 在幻灯片光学图像窗格上可视化全景图像。
3. 视场 （FOV） 选择和采集
   1. 单击" 模式"菜单，然后选择"SED（二次电子检测器）"。单击 成像模式菜单 并选择QC −300 μm。
   2. 单击 "慢跑舞台 "以控制 FOV 位置，然后单击箭头进行导航并选择 FOV 的位置。
   3. 单击 添加 FOV，将 400 μm x 400 μm 设置为场大小，然后选择精细作为成像模式和 1 ms 停留时间。点击 确认。
      注:设置的停留时间将取决于所需的分辨率。停留时间随着分辨率的增加而增加。采集时间可能因多种因素而异，包括检测器磨合期和工作时间。我们对一个 FOV 的平均采集时间约为 17 分钟。不间断使用仪器长达 8 小时，可扫描约 28 个 FOV。连续使用数小时后，所采集图像的质量会下降。
   4. 创建 FOV 列表后，继续对焦图像，并通过将光束移动到不会成像的组织区域来调整柱化。调整参数，直到获得清晰的中心图像。
      注意:为了优化图像采集，最好将组织切片集中在载玻片上。在对焦时，只能获得中心区域的清晰图像。如果组织切片太大，边缘将失焦，图像将模糊。
   5. 单击 "开始运行"。获取的图像将自动上传并存储在基于Web的图像管理应用程序中。

6. 图像准备

1. 图像等压校正
   注意:等压校正的目的是消除由于存在质量相等或非常相似的同位素而产生的通道之间的溢出信号，这些同位素的质量差异无法使用质量分析仪检测到。
   1. 在基于 Web 的图像管理应用程序中，单击绿色的" 下载"图标 以保存 FOV（TIFF 图像）。
   2. 下载基于 Web 的图像管理应用程序中的"关于"选项卡上提供的最新版本的图像处理软件（请参阅 材料表），并将其保存在文件中。打开.zip存档文件，然后按照安装步骤操作。安装完成后打开软件。
   3. 通过单击图像处理软件输入窗格上的 "文件"图标 ，选择包含要更正的图像的文件夹。将加载 FOV 列表。
   4. 单击输入窗格上的 过滤器图标 以应用默认更正。对于每个通道，在屏幕右侧可视化校正前后获得的图像。
   5. 单击输出窗格上的 软盘图标 以保存更正后的图像。
2. 图像过滤:沃罗诺伊曲面细分
   注意:沃罗诺伊曲面细分图说明了将种子点的空间划分为沃罗诺伊细胞。目的是估计像元密度并定义像元边界。使用 Voronoi 曲面细分计算，将生成一个蒙版并将其应用于原始图像以进行过滤。
   1. 单击"过滤"选项卡 ， 然后在过滤参数菜单中选择 "沃罗诺伊曲面细分 "。
   2. 在输入窗格中，选择"质量校正.tiff图像。单击输入窗格上的 过滤器图标 。
   3. 单击输出窗格上的 软盘图标 以保存过滤后的图像。生成的两个文件将具有后缀 -已筛选.tiff和 -已筛选 .json。
      注意:名为"质量校正-过滤.tiff的图像可以上传到第三方数字分析软件程序或开源软件程序。

获得扁桃体和肺腺癌TMA组织切片（5mm厚）并按照有关切片的组织大小和安全边缘的规格放置在金涂层载玻片的中间。组织边缘与载玻片的侧缘和下边界之间分别有5 mm和10 mm的自由玻璃边缘对于最佳染色是必需的。在染色之前，将组织切片在烤箱中烘烤过夜，以确保切片正确粘附在载玻片上。抗体组合由23个标记物组成。在同一染色批次中，包括扁桃体载玻片和含有多个组织的TMA载玻片，以评估肺腺癌样品中表达很少的标志物的表达（图1）。需要根据面板中使用的抗体靶标选择阳性对照;例如，为了评估SOX10的表达，需要黑色素瘤样本，为了评估GAFP表达，需要胶质母细胞瘤样本（图2）。

图 1:同位素纯度和通道串扰。 矩阵显示了从探针纯度和氧化物（蓝色框，≥0.5%;透明框<0.5%）获得的串扰百分比。对于质量标签，显示将至少0.5%串扰贡献给无通道（绿色），一个或两个通道（黄色）或两个以上通道（橙色）的探头。还显示了从无探头（绿色），一个或两个探头（黄色）或两个以上探头（橙色）接收至少0.5%串扰的质量通道。 请点击此处查看此图的大图。

图2:不同组织中的代表性染色图像。 （A）肺腺癌。（B）非肿瘤性肾。（C） 扁桃体。CD20 以黄色显示，Ki67 以品红色显示，CD3 以白色显示，CD11c 以绿色显示，CD68 以红色显示，细胞角蛋白以青色显示，双链 DNA （dsDNA） 以蓝色显示。放大倍率，200x .请点击此处查看此图的大图。

该染色过程与标准免疫组化染色非常相似，并且连续两天发生。染色方案的五个主要步骤是1）去除过量的石蜡，2）抗原检索，3）抗体阻断，4）抗体染色，以及5）固定和脱水（图3）。染色过程中的一个基本步骤是采取预防措施，避免金属污染样品，包括使用储存在塑料器皿中的无金属试剂和小心处理样品以限制机械损伤。建议在染色前立即准备抗体混合物。这减少了金属交换。染色完成后，我们存储载玻片并在第二天进行扫描。在采集图像之前，一个必要的步骤是使用基于Web的图像管理应用程序进行幻灯片设置（图4）。

图 3:图像采集工作流程和相关幻灯片。1）使用一次离子枪对用金属偶联抗体染色的FFPE组织切片进行光栅化，释放二次离子。2）飞行时间质谱仪分离，并根据离子在像素水平上的质量测量离子。3） 基于像素的二次离子定量。y轴对应于检测到的离子数（峰值），x轴对应于每种金属的质量。4）基于每个质谱的峰值，重建多维图像。（B） 本程序中使用的幻灯片示意图。为了获得最佳染色组织，切片必须距离载玻片的侧缘至少5 mm，距离其下边缘10 mm。在组织部分周围绘制疏水屏障时，必须将其保持在距离载玻片边缘至少1毫米的矩形内。请点击此处查看此图的大图。

图 4:基于 Web 的图像管理应用程序中的幻灯片设置。 在玻片扫描之前，必须设置每张载玻片。输入有助于识别幻灯片的所需详细信息。单击 "添加部分 "（黑色箭头）以包含块和位置信息。要保存，请单击 提交（红色箭头）。 请点击此处查看此图的大图。

在扫描当天，使用控制软件打开采集仪器。单击 交换幻灯片 可打开仪器的门，允许加载幻灯片。我们将载玻片放在装载槽上，朝上，标签位于右侧。一次只能扫描一张载玻片。下一步是选择FOV并按照协议中描述的步骤调整焦点和耻辱感。我们通过单击" 开始运行"来获取图像。采集时间因所需的 FOV 大小和分辨率而异。FOV 大小范围从 200 μm x 200 μm 到 800 μm x 800 μm，对应于 128 像素 x 128 像素到 2048 像素 x 2048 像素的帧大小范围。有三种标准分辨率可供选择:粗、细和超细。以超精细分辨率扫描较大的 FOV 非常耗时，一个 FOV 的最终采集时间为 25 s 至 4.7 小时（图 5）。

图 5:使用控制软件进行图像采集。 采集设置可以根据需要进行调整。要修改扫描分辨率，请单击" 成像模式 "下拉菜单（黑色箭头）。要修改 FOV 大小，请在 FOV 大小 （μm） 字段（红色箭头）中输入一个数字。 请点击此处查看此图的大图。

扫描完成后，包含所有 FOV 的图像集会自动上传到基于 Web 的图像管理应用程序。除了存储图像外，此应用程序还可以将所有通道一起或单独可视化，图像调整以及下载图像以进行进一步准备。标准可视化图像将另存为 TIFF 文件（图 6）。

图 6:使用基于 Web 的图像管理应用程序进行图像可视化。 获取的图像使用在线平台进行存储和可视化。可以调整可视化参数并更改每个标记的颜色。单击 添加图像通道 （白色箭头）以显示其他标记。放大倍率，200x .请点击此处查看此图的大图。

金属干涉是金属标记方法所固有的，尽管使用了最小化它们的策略。为了从与抗体偶联的金属同位素中去除多余的背景信号并准备用于分析的图像，我们使用相关的图像处理软件（参见 材料表）。图像准备过程有两个步骤:1）等压校正，它删除通道之间的信号，以及2）滤波，它删除由图像上的聚集引起的信号。

要开始等压校正，通过单击输入窗格的" 文件"图标 ，选择了包含已保存的 TIFF 图像的文件。该软件会自动将所有存档的TIFF图像加载到文件中，从而允许批量分析。接下来，我们通过单击输入窗格的" 筛选器"图标 来更正图像。自动生成了两个后缀为"质量校正"的结果文件:一个以 TIFF 格式存档，另一个以 JSON 格式存档。默认情况下，生成的存档保存在加载初始图像的同一文件中（图 7）。

图 7:图像准备:校正步骤。 要在图像处理软件中加载图像以进行准备，请单击输入窗格中 的"文件"图标 （黑色箭头），然后选择图像。要应用默认校正过程，请单击输入窗格中的 过滤器图标 （红色箭头）。要保存更新的更正图像，请单击输出窗格上的 软盘图标 。 请点击此处查看此图的大图。

图像准备的第二步是过滤，可以在软件的上部选项卡上选择。我们在输入窗格中选择了更正后的图像。在此步骤中，使用自动沃罗诺伊曲面细分作为过滤参数。单击输入面板上的过滤器图标会自动将所选过滤器应用于所有通道。在两个图像准备步骤（校正和滤波）中，每个通道在处理前后的图像和信号差异都显示在屏幕的右侧。

与等压校正步骤类似，生成了两个新存档，一个是 TIFF 格式，另一个是 JSON 格式。在此步骤中，文件名后面的后缀为 -Filter。因此，获得的最终图像被命名为"质量校正 - 过滤.tiff。通过完成这些步骤，我们使用首选的数字病理学软件准备了用于分析的图像（图8 和 图9）。通过使用这种技术，我们能够分析抗体组合中的所有23个标记物，在单个组织切片的亚细胞水平上，通道之间的干扰最小。

图 8:图像准备:过滤步骤。 在图像处理软件的上部选项卡（黑色箭头）中选择 过滤 。在"筛选参数"下，选择所需的方法（绿色箭头）。在输入窗格中，选择"批量更正图像"。要将所选过程应用于图像，请单击输入窗格上的 "筛选器"图标 （红色箭头）。要保存更新的过滤图像，请单击输出窗格上的 软盘图标 。 请点击此处查看此图的大图。

图9:图像制备前后的染色代表性图像。 （A）使用该技术染色扁桃体组织切片的图像，并在过滤和校正之前使用第三方数字图像分析软件程序进行可视化。（B）图像在相同条件下经过过滤和校正步骤后。CD20以黄色显示，Ki67以品红色显示，CD3以白色显示，CD11c以绿色显示，细胞角蛋白以青色显示，双链DNA（dsDNA）以蓝色显示。放大倍率，200x .请点击此处查看此图的大图。

补充文件1: 抗体组合列表。 每种抗体都偶联到列出的具有不同质量的特定金属同位素。 请按此下载此档案。

作者没有要披露的冲突。