在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。
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摘要
摘要
基于免疫的治疗技术进步已彻底改变了癌症治疗与研究，由此引发了对肿瘤免疫微环境表征日益增长的需求。尽管传统的免疫组织化学适用于组织结构的研究，但其仅能分析少量标志物。相比之下，流式细胞术等技术可同时检测多个标志物，却丢失了组织形态学信息。近年来，整合表型分析与空间定位分析的多重检测策略应运而生，成为全面表征肿瘤免疫微环境的综合性方法. 在此，我们介绍一种创新技术，该技术结合了金属标记抗体与二次离子质谱法，重点讨论在检测方法开发与优化、组织制备以及图像采集和处理中的技术步骤。在染色前，必须构建并优化一套金属标记抗体组合。该高通量成像系统可在单个组织切片中同时支持多达40种金属标记抗体。值得注意的是，随着抗体组合中标志物数量的增加，信号干扰的风险也随之升高。在完成组合设计后，应特别关注抗体所连接的金属同位素分配，以最大程度减少此类干扰。初步的组合测试首先使用少量抗体子集进行，随后在对照组织中对完整组合进行验证。获取福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片，将其置于镀金载玻片上并进行染色。染色过程耗时两天，流程与常规免疫组织化学染色高度相似。样本染色完成后，将其放入图像采集仪器中。选择视野区域，进行图像采集、上传与存储。最后阶段是利用系统配套的图像处理软件对图像进行预处理，以滤除干扰信号并完成去噪。该平台的一个缺点是缺乏专用的分析软件，但所生成的图像可被多种计算病理学软件支持。
引言
围绕克隆性肿瘤群体的多种细胞类型在致癌过程的分类中具有关键作用。随着免疫疗法成为癌症治疗手段的重要组成部分，阐明肿瘤微环境（TME）的组成及其相互作用日益受到关注。因此，治疗策略已从以肿瘤为中心的模式转向以TME为中心的模式1。
近年来，阐明免疫细胞在肿瘤监视和癌症发展中的作用的研究显著增加2,3。在医学研究中，为了破译肿瘤微环境（TME）中多种组分之间独特的相互作用，涌现了大量方法，包括基于细胞计数的方法以及单重和多重成像技术。
诸如流式细胞术（20世纪60年代发明）、荧光激活细胞分选以及质谱流式细胞术等开创性方法，主要聚焦于识别和定量肿瘤微环境（TME）的组分4。尽管基于细胞术的定量技术能够实现免疫景观的表型分析，但无法确定细胞的空间分布。相反，标准单重免疫组织化学等方法可保留组织结构，使研究人员能够分析细胞分布，但其局限性在于单个组织切片中可检测的靶标数量有限5,6。在过去的数年中，多重成像技术（如多重免疫荧光、条形码荧光成像和成像质谱）作为可在单细胞分辨率下获取信息的综合策略逐渐兴起，能够在同一组织切片中实现多个标志物的同步染色分析7。
本文介绍了一种将金属标记抗体与二次离子质谱技术相结合的方法，可在单细胞分辨率下对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和新鲜冷冻（FF）组织样本进行定量分析、标志物共表达（表型分析）以及空间分布分析8,9。FFPE样本是组织存档中最广泛使用的材料，相较于新鲜冷冻样本，更易于获取，适用于多重成像技术10。此外，该技术还支持在数月后重新获取图像。本文中，我们讨论了使用FFPE组织样本的染色及图像处理方案。
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方案
组织样本的获取符合德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构审查委员会的规定，仅用于科研目的，且样本已进一步去标识化。
1. 抗体选择
- 通过定义研究问题来选择最佳的可用抗体克隆。使用人类蛋白图谱（Human Protein Atlas）、已发表的研究文献以及抗体生产商网站作为研究资源。
注意：选择适当的正常人类组织对照，并在不同实验步骤中使用相同的对照组织进行染色，这对于确保标志物在正确的位置、正确的细胞区域中被准确染色至关重要。建议始终使用包含正常组织和肿瘤组织的小型组织微阵列（TMA）进行染色验证。 - 仅使用无载体的抗体设计检测面板。
注意：若商品化的无载体抗体不可获得，则必须使用纯化试剂盒将抗体调整为合适的无载体形式。已知牛血清白蛋白等蛋白添加剂会降低抗体的偶联能力。 - 利用标准的显色免疫组织化学方法对每种抗体进行测试和滴定，以确定标志物表达的亚细胞定位模式，包括膜染色、胞质染色或核染色，以及在对照组织中特定细胞内的表达情况。
注意：每种抗体都必须在pH 6的柠檬酸缓冲液和pH 9的乙二胺四乙酸（EDTA）条件下进行测试，并确定整个抗体组合将采用pH 6柠檬酸还是pH 9 EDTA条件进行染色。推荐使用pH 9 EDTA条件以获得良好的信号，尤其是在应用本方法时。 - 根据阳性对照中标志物的表达模式选择最佳染色浓度。
- 根据免疫组织化学标志物的表达丰度、亚细胞定位以及与其他靶标的细胞共表达情况，将每种抗体分配至一种可用的金属同位素。
- 使用相应分配的金属对抗体进行染色，并与之前所用的相同对照组织中的表达情况进行比较。
注意：抗体-金属偶联过程始于抗体的准备、还原及后续偶联步骤（补充文件1）。每管负载金属的聚合物足以标记100 µg抗体。
2. 抗体组合设计
- 制备小批量的抗体染色试剂。在混合抗体中测试最多五种标记物。
注意：批量测试已偶联并使用免疫组化分析过的抗体，有助于早期识别通道间的干扰，并为使用其他金属重新偶联抗体提供机会。同时，也可评估标记物共表达的充分性。 - 用四种不同浓度的抗体（0.05 µg/mL、0.2 µg/mL、1 µg/mL 和 4.0 µg/mL）对每个小批量样本进行染色。
注意：通过比较不同滴度，确定能够产生正确定位、最高表达水平且背景染色最低（最佳信噪比）的抗体浓度。
3. FFPE 组织切片
- 选择专用于此目的的金镀膜载玻片，并将其置于切片机附近。将新刀片插入刀片架中以准备切片机。设置切片厚度为4–5 μm。
- 将FFPE包埋块置于冰上，切片前预冷。通过加热蒸馏水或去离子水（diH₂O）准备组织漂浮浴。2O）至 40–45 °C。
注意：使用二氢（diH）2使用超纯水或蒸馏水可降低污染的可能性。 - 开始切片。用镊子将组织切片放入水中，使其自然展平。用载玻片将组织切片从水中取出。
- 将载玻片放入载玻片架中，在室温下静置过夜使其干燥。
4. 福尔马林固定石蜡包埋组织的抗体染色
注意：染色过程需在两个不同的日期进行。
警告：本实验方案中使用的溶液可能具有腐蚀性，对皮肤和眼睛存在危害。建议佩戴手套、实验服以及眼部和面部防护装备，这是本机构生物安全政策的要求。
- 试剂准备（第1天）
- 将50 mL的20倍浓度Tris缓冲盐水Tween溶液（TBS-T）加入950 mL的去离子H2O中，配制成1 L的TBS-T溶液。
- 将8 mL的10倍浓度Tris-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液加入72 mL的去离子H2O中，配制成1倍浓度的热诱导表位修复（HIER）溶液。
- 将驴血清用1倍TBS-T稀释至终浓度为5%，制备封闭缓冲液。将该溶液储存于4 °C，待用。
- HIER准备：预处理（PT）模块
注意：操作PT模块中任何试剂或接触过试剂的部件时，必须佩戴化学防护手套。- 将140 mL的10倍磷酸盐缓冲液（PBS）加入1,260 mL的去离子H2O中，配制成1.4 L的1倍PBS溶液。或者，将七片PBS片剂溶于1.4 L的去离子H2O中。
- 将1.4 L PBS倒入容器中，并将已装有100 mL 1倍HIER溶液的切片室容器放入该容器内。
- 使用PT模块将容器预热至75 °C。
- 去除多余石蜡
- 将切片置于70 °C的烘箱中烘烤至少20分钟。
注意：某些组织或切片可能需要更长的烘烤时间。脑组织或组织微阵列（TMA）推荐烘烤时间为1小时，也可延长至16小时（过夜），或根据实验室经验调整。 - 将烘烤后的切片放入切片架中，在通风橱内的摇床上进行以下洗涤步骤。依次用下列溶液洗涤切片：无金属二甲苯洗涤2次，每次30秒；100%乙醇洗涤2次，每次30秒（无金属）；95%乙醇洗涤2次，每次30秒（无金属）；80%乙醇洗涤1次，30秒（无金属）；70%乙醇洗涤1次，30秒（无金属）；去离子H2O洗涤2次，每次30秒（无金属）。
- 将切片保存在新鲜的去离子H2O容器中，直至进行抗原修复。
注意：在实验结束前，切片不应干燥。
- 将切片置于70 °C的烘箱中烘烤至少20分钟。
- 抗原修复
- 将切片放入PT模块中已预热的切片室，室内含有1倍HIER缓冲液。盖上容器盖，关闭并扣紧盖子。
- 按下PT模块上的菜单按钮以打开主菜单，再按下设置循环（时间和温度）按钮，创建自定义程序。
- 在97 °C下运行PT模块40分钟。之后，PT模块将自动冷却至65 °C。
- 当温度降至65 °C时，取出切片。在室温下放置30分钟。
注意：PT模块温度未降至65 °C前不会开启。在此过程中切勿触碰切片的金色表面，并始终佩戴手套。
- 抗体封闭
- 将摇床调至70 rpm。
- 将切片浸入1倍TBS-T中洗涤2次，每次5分钟。
- 使用疏水屏障笔在组织切片周围画一圈边界，距离切片边缘至少1 mm，并静置15–30秒使其干燥。
注意：注意避免笔液接触组织切片，以防影响染色效果。绘制屏障时不要用力过猛，以免造成渗漏。为获得最佳染色和成像效果，应将组织切片置于镀金切片中央，且框架尺寸不超过15 mm × 30 mm，以便有足够空间绘制屏障，同时避免触碰组织或切片外缘的引导点。 - 为去除任何笔迹残留，将切片浸入TBS-T中。
- 在室温下的湿盒中，用100–200 μL封闭缓冲液孵育组织切片20分钟。保持组织切片在封闭缓冲液中，直至抗体主混合液准备就绪。
- 抗体组合准备
注意：抗体组合混合液的最终体积取决于估计的组织切片表面积。为覆盖20 mm × 20 mm的区域，需准备100–200 μL混合液。
按以下步骤制备金属同位素标记抗体的抗体组合混合液：- 确认混合液的最终体积等于加入封闭缓冲液中的抗体混合液体积。
- 在项目用的表格中核对所有抗体的规格、稀释比例和/或抗体浓度。
- 将所有含抗体的离心管在10,000 × g下离心5分钟。将各抗体逐个加入封闭缓冲液中，并充分混匀。移液时避免扰动抗体管底部。
- 通过预湿0.1 μm离心过滤装置进行抗体组合过滤：先用100 μL封闭缓冲液润洗滤器，在10,000 × g下离心2分钟，用移液器移除滤过液。
- 将抗体组合转移至离心柱中，在10,000 × g下离心2分钟。弃去离心柱，收集滤过液作为过滤后的抗体组合。
注意：配制完成后应立即进行染色，以防金属交换。若需长期保存抗体混合液，可进行冻干处理。
- 抗体染色
- 小心去除切片上的封闭缓冲液：将每张切片倾斜，轻轻敲击边缘以去除液体，并用实验用纸巾吸干。
- 将切片放入湿盒中，向组织区域加入100–200 μL抗体主混合液（避免接触组织并产生气泡）。
- 在染色批次中加入阳性和阴性对照切片。
- 在4 °C下孵育过夜（14–16小时）。
- 试剂准备（第2天）
- 将100 mL的10倍低钡PBS（pH 7.4）加入900 mL的去离子H2O中，配制成1倍PBS溶液。
- 配制350 mL工作浓度为2%的戊二醛低钡PBS溶液（340 mL低钡PBS + 10 mL 70%戊二醛）。
注意：在通风橱内进行稀释操作。戊二醛为高黏性液体，建议使用1 mL移液器，每次向戊二醛管中加入1 mL低钡PBS，直至其流动性足以倒出。 - 将10倍Tris溶液（pH 8.5）用900 mL去离子H2O稀释，配制成1倍Tris溶液。
- 固定与脱水
- 通过将切片倾斜并轻轻敲击边缘的方式，用实验用纸巾去除每张切片上的抗体主混合液。
- 在以下缓冲液中以轻度至中度振荡方式洗涤切片：1倍TBS-T洗涤3次，每次5分钟（无金属）；过滤后的2%戊二醛洗涤5分钟；过滤后的1倍Tris（pH 8.5）洗涤3次，每次30秒；过滤后的去离子H2O洗涤2次，每次30秒；70%乙醇洗涤1次，30秒（无金属）；80%乙醇洗涤1次，30秒（无金属）；95%乙醇洗涤1次，30秒（无金属）；100%乙醇洗涤1次，30秒（无金属）。
- 轻轻敲击每张切片边缘以去除多余乙醇，并在室温下静置使残余乙醇挥发（约5–10分钟）。
- 在图像采集前，将切片置于干燥器中干燥至少1小时，或长期储存时置于真空环境中。
5. 图像采集
- 载玻片设置
注意：在使用仪器扫描之前，必须通过基于网页的图像管理应用程序按照以下步骤定义并设置载玻片。- 在基于网页的图像管理应用程序的载玻片页面上，点击 新建收样载玻片，并输入所需信息（名称、载玻片编号、位置和描述）。
- 点击 添加区域 创建扫描区域。填写每个区域的信息（项目名称、载玻片名称、组织块编号和位置）。点击 提交 以保存新创建的载玻片/区域。
- 在资源标签页下，打开面板页面并选择要使用的面板。对于新面板，点击 创建新面板。
- 选择面板后，点击 区域。通过点击 编辑区域分配 添加第2步中创建的区域。点击 提交 保存设置。
- 仪器设置
注意：该仪器（见 材料表）需使用特定的控制软件程序操作（见 材料表）。- 登录控制软件。如果仪器处于休眠模式，请点击 唤醒。
注意：建议在操作前至少提前1小时启动仪器预热，以帮助电子束聚焦稳定。 - 要加载载玻片，请点击 更换样本，然后点击 继续 以打开舱门。将载玻片放入加载槽中，样本面朝上，标签位于右侧。点击 继续 关闭舱门。
注意：如果载玻片未正确加载，系统将发出警告音并提示调整载玻片位置。 - 选择项目，然后选择已加载样本的载玻片名称。
- 在载玻片光学图像窗格中查看全景图像。
- 登录控制软件。如果仪器处于休眠模式，请点击 唤醒。
- 视野（FOV）选择与图像采集
- 点击 模式 菜单并选择 SED（二次电子探测器）。点击 成像模式菜单，选择 QC −300 μm。
- 点击 移动载物台 以控制视野位置，然后点击箭头导航并选择视野位置。
- 点击 添加视野，将视野尺寸设为 400 μm × 400 μm，选择“精细”作为成像模式，停留时间为 1 ms。点击 确认。
注意：设定的停留时间取决于所需的分辨率。分辨率越高，停留时间越长。采集时间可能因多种因素而异，包括探测器磨合期和运行时长。我们单个视野的平均采集时间约为17分钟。仪器可连续运行最多8小时，可扫描约28个视野。连续使用多小时后，所采集图像的质量会下降。 - 创建视野列表后，进行图像对焦，并将电子束移至不用于成像的组织区域以调节像散。调节参数直至获得清晰的中心图像。
注意：为优化图像采集，理想情况是将组织切片置于载玻片中央。对焦时，仅能获得中心区域的清晰图像。若组织切片过大，边缘将失焦，导致图像模糊。 - 点击 开始运行。采集的图像将自动上传并存储在基于网页的图像管理应用程序中。
6. 图像准备
- 同量异位素校正成像
注意：同量异位素校正的目的是消除由于存在质量相等或非常相近的同位素所导致的通道间信号溢出，这些同位素的质量差异无法通过质谱分析仪检测到。- 在基于网页的图像管理应用程序中，点击绿色下载图标以保存视野（TIFF 图像）。
- 在基于网页的图像管理应用程序的“关于”选项卡中，下载最新版本的图像处理软件（参见材料表），并将其保存至文件。打开 .zip 压缩包文件，并按照安装步骤进行操作。安装完成后，启动该软件。
- 在图像处理软件的输入面板中，点击文件图标，选择包含待校正图像的文件夹。系统将加载视野列表。
- 在输入面板中点击滤镜图标，以应用默认校正。针对每个通道，在屏幕右侧查看校正前后的图像。
- 在输出面板中点击软盘图标，保存校正后的图像。
- 图像滤波：Voronoi 镶嵌
注意：Voronoi 镶嵌图将包含种子点的空间划分为 Voronoi 单元。其目的是估算细胞密度并定义细胞边界。通过 Voronoi 镶嵌计算生成掩膜，并将其应用于原始图像以实现滤波。- 点击滤波选项卡，并在滤波参数菜单中选择Voronoi 镶嵌。
- 在输入面板中选择 MassCorrected.tiff 图像。点击输入面板上的滤镜图标。
- 在输出面板中点击软盘图标，保存滤波后的图像。生成的两个文件将分别带有后缀 -Filtered.tiff 和 -Filtered.json。
注意：名为 MassCorrected-Filtered.tiff 的图像可上传至第三方数字分析软件或开源软件程序。
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结果
获取扁桃体和肺腺癌TMA组织切片（厚度为5 mm），根据组织尺寸和载玻片安全边缘的要求，将其置于镀金载玻片的中央位置。为实现最佳染色效果，组织边缘与玻璃载玻片的侧边和底边之间需分别保留5 mm和10 mm的无组织玻璃边缘。染色前，将组织切片在烘箱中烘烤过夜，以确保切片牢固地附着于载玻片上。抗体组合包含23种标记物。在同一染色批次中，需包括一张扁桃体切片和一张含多种组织的TMA切片，用于评估在肺腺癌样本中表达较弱的标记物（图1）。阳性对照的选择应依据抗体组合中各抗体的靶标而定；例如，为评估SOX10的表达，需使用黑色素瘤样本，而评估GFAP的表达则需使用胶质母细胞瘤样本（图2）。
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讨论
全面阐明肿瘤微环境（TME）中多种组分之间复杂而精细的相互作用，仍是癌症研究的关键目标。为此，制造商在过去五年中推出了大量多重检测技术。多重空间分析是一种多功能且强大的工具，可在保留肿瘤样本结构形态的同时，实现对多个靶标的同步分类。空间分析技术可通过荧光成像或质谱法进行，例如本文所述的技术11,12,13。
在染色前，必须使用常规免疫组织化学方案对抗体进行优化，随后进行染色操作，以标准化抗体染色的可重复性。众所周知，不同的常规抗体克隆在不同条件下可能具有最佳表达效果。然而，将抗体与金属标签偶联时，需要使用无载体抗体，并且要求同一抗体组合中的所有抗体采用相同的抗原修复pH值，这是该方法的一个缺点。若未完成此步骤，可能导致图像质量低下，无法进行有效分析。必须投入时间查阅医学文献以及抗体 生产商的网站，从商业可获得的抗体中筛选出经过充分验证、可靠的优质抗体。在验证抗体及其组合时，构建较小的抗体...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢MD安德森癌症中心研究医学图书馆编辑服务部的Don Norwood对本文的编辑工作，以及MD安德森癌症中心转化分子病理学系多重免疫荧光和图像分析实验室的支持。本出版物部分成果源于癌症免疫监测与分析中心—癌症免疫学数据共享网络（CIMAC-CIDC）的研究，该研究得到了美国国家癌症研究所（NCI）合作协定（U24CA224285）向德克萨斯大学MD安德森癌症中心癌症免疫监测与分析中心（CIMAC）提供的科学与资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100% 试剂级酒精 | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% 试剂级酒精 | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% 试剂级酒精 | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% 试剂级酒精 | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X 低钡 PBS，pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris，pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C 冰箱 | ThermoScientific | REVCO | |
| 气溶胶屏障移液器吸头 P10 | Olympus | 24-401 | |
| 气溶胶屏障移液器吸头 P20 | Olympus | 24-404 | |
| 气溶胶屏障移液器吸头 P200 | Olympus | 24-412 | |
| 气溶胶屏障移液器吸头 P1000 | Olympus | 24-430 | |
| 离心滤膜 Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| 去离子 H2O | Ionpath | 567002 | |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip 载玻片染色缸，绿色 | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip 载玻片染色缸，黄色 | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip 载玻片染色套装（染色缸+架），白色 | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip 不锈钢支架 | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| 70% 电镜级戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| 热诱导表位修复（HIER）缓冲液：含 EDTA 的 10X Tris，pH 9 | Dako | S2367 | |
| 耐热载玻片染色盒 | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| 疏水屏障笔 | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O 软件 | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol 软件 | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5415D | |
| 切片机 | Leica | RM2135 | |
| 湿盒（加湿盒） | Simport | M922-1 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）片剂 | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT 模块 | Thermo Scientific | A80400012 | |
| 快速流动式无菌一次性过滤装置 | Fisher Scientific | 097403A | |
| 摇床 | BioRocker | S2025 | |
| 离心柱（Ultrafree-MC 离心滤膜，0.5 mL，0.1μm） | MillQ | UFC30VV00 | |
| 载玻片烘箱 | Fisher Scientific | 6901 | |
| 真空干燥柜 | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
参考文献
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