利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

摘要

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。

摘要

基于免疫的治疗技术进步已彻底改变了癌症治疗与研究，由此引发了对肿瘤免疫微环境表征日益增长的需求。尽管传统的免疫组织化学适用于组织结构的研究，但其仅能分析少量标志物。相比之下，流式细胞术等技术可同时检测多个标志物，却丢失了组织形态学信息。近年来，整合表型分析与空间定位分析的多重检测策略应运而生，成为全面表征肿瘤免疫微环境的综合性方法. 在此，我们介绍一种创新技术，该技术结合了金属标记抗体与二次离子质谱法，重点讨论在检测方法开发与优化、组织制备以及图像采集和处理中的技术步骤。在染色前，必须构建并优化一套金属标记抗体组合。该高通量成像系统可在单个组织切片中同时支持多达40种金属标记抗体。值得注意的是，随着抗体组合中标志物数量的增加，信号干扰的风险也随之升高。在完成组合设计后，应特别关注抗体所连接的金属同位素分配，以最大程度减少此类干扰。初步的组合测试首先使用少量抗体子集进行，随后在对照组织中对完整组合进行验证。获取福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片，将其置于镀金载玻片上并进行染色。染色过程耗时两天，流程与常规免疫组织化学染色高度相似。样本染色完成后，将其放入图像采集仪器中。选择视野区域，进行图像采集、上传与存储。最后阶段是利用系统配套的图像处理软件对图像进行预处理，以滤除干扰信号并完成去噪。该平台的一个缺点是缺乏专用的分析软件，但所生成的图像可被多种计算病理学软件支持。

引言

围绕克隆性肿瘤群体的多种细胞类型在致癌过程的分类中具有关键作用。随着免疫疗法成为癌症治疗手段的重要组成部分，阐明肿瘤微环境（TME）的组成及其相互作用日益受到关注。因此，治疗策略已从以肿瘤为中心的模式转向以TME为中心的模式¹。

近年来，阐明免疫细胞在肿瘤监视和癌症发展中的作用的研究显著增加^2,3。在医学研究中，为了破译肿瘤微环境（TME）中多种组分之间独特的相互作用，涌现了大量方法，包括基于细胞计数的方法以及单重和多重成像技术。

诸如流式细胞术（20世纪60年代发明）、荧光激活细胞分选以及质谱流式细胞术等开创性方法，主要聚焦于识别和定量肿瘤微环境（TME）的组分⁴。尽管基于细胞术的定量技术能够实现免疫景观的表型分析，但无法确定细胞的空间分布。相反，标准单重免疫组织化学等方法可保留组织结构，使研究人员能够分析细胞分布，但其局限性在于单个组织切片中可检测的靶标数量有限^5,6。在过去的数年中，多重成像技术（如多重免疫荧光、条形码荧光成像和成像质谱）作为可在单细胞分辨率下获取信息的综合策略逐渐兴起，能....

方案

组织样本的获取符合德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构审查委员会的规定，仅用于科研目的，且样本已进一步去标识化。

1. 抗体选择

1. 通过定义研究问题来选择最佳的可用抗体克隆。使用人类蛋白图谱（Human Protein Atlas）、已发表的研究文献以及抗体生产商网站作为研究资源。
   注意：选择适当的正常人类组织对照，并在不同实验步骤中使用相同的对照组织进行染色，这对于确保标志物在正确的位置、正确的细胞区域中被准确染色至关重要。建议始终使用包含正常组织和肿瘤组织的小型组织微阵列（TMA）进行染色验证。
2. 仅使用无载体的抗体设计检测面板。
   注意：若商品化的无载体抗体不可获得，则必须使用纯化试剂盒将抗体调整为合适的无载体形式。已知牛血清白蛋白等蛋白添加剂会降低抗体的偶联能力。
3. 利用标准的显色免疫组织化学方法对每种抗体进行测试和滴定，以确定标志物表达的亚细胞定位模式，包括膜染色、胞质染色或核染色，以及在对照组织中特定细胞内的表达情况。
   注意：每种抗体都必须在pH 6的柠檬酸缓冲液和pH 9的乙二胺四乙酸（EDTA）条件下进行测试，并确定整个抗体组合将采用pH 6柠檬酸还是pH 9 EDTA条件进行染色。推荐使用pH 9 EDTA条件以获得良好的信号，尤其是在应用本方法时。
4. 根据阳性对照中标志物的表达模式选择最佳染色浓度。
....

结果

获取扁桃体和肺腺癌TMA组织切片（厚度为5 mm），根据组织尺寸和载玻片安全边缘的要求，将其置于镀金载玻片的中央位置。为实现最佳染色效果，组织边缘与玻璃载玻片的侧边和底边之间需分别保留5 mm和10 mm的无组织玻璃边缘。染色前，将组织切片在烘箱中烘烤过夜，以确保切片牢固地附着于载玻片上。抗体组合包含23种标记物。在同一染色批次中，需包括一张扁桃体切片和一张含多种组织的TMA切片，用于评估在肺腺癌样本中表达较弱的标记物（图1）。阳性对照的选择应依据抗体组合中各抗体的靶标而定；例如，为评估SOX10的表达，需使用黑色素瘤样本，而评估GFAP的表达则需使用胶质母细胞瘤样本（图2）。

讨论

全面阐明肿瘤微环境（TME）中多种组分之间复杂而精细的相互作用，仍是癌症研究的关键目标。为此，制造商在过去五年中推出了大量多重检测技术。多重空间分析是一种多功能且强大的工具，可在保留肿瘤样本结构形态的同时，实现对多个靶标的同步分类。空间分析技术可通过荧光成像或质谱法进行，例如本文所述的技术^11,12,13。

在染色前，必须使用常规免疫组织化学方案对抗体进行优化，随后进行染色操作，以标准化抗体染色的可重复性。众所周知，不同的常规抗体克隆在不同条件下可能具有最佳表达效果。然而，将抗体与金属标签偶联时，需要使用无载体抗体，并且要求同一抗体组合中的所有抗体采用相同的抗原修复pH值，这是该方法的一个缺点。若未完成此步骤，可能导致图像质量低下，无法进行有效分析。必须投入时间查阅医学文献以及抗体 生产商的网站，从商业可获得的抗体中筛选出经过充分验证、可靠的优质抗体。在验证抗体及其组合时，构建较小的抗体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 试剂级酒精	Sigma-Aldrich	R8382
95% 试剂级酒精	Sigma-Aldrich	R3404
80% 试剂级酒精	Sigma-Aldrich	R3279
70% 试剂级酒精	Sigma-Aldrich	R315
20X TBS-T	Ionpath	567005
10X 低钡 PBS，pH 7.4	Ionpath	567004
10X Tris，pH 8.5	Ionpath	567003
4°C 冰箱	ThermoScientific	REVCO
气溶胶屏障移液器吸头 P10	Olympus	24-401
气溶胶屏障移液器吸头 P20	Olympus	24-404
气溶胶屏障移液器吸头 P200	Olympus	24-412
气溶胶屏障移液器吸头 P1000	Olympus	24-430
离心滤膜 Ultrafree-MC	Fisher Scientific	UFC30VV00
去离子 H2O	Ionpath	567002
驴血清	Sigma-Aldrich	D9663
EasyDip 载玻片染色缸，绿色	Electron Microscopy Sciences	71385-G
EasyDip 载玻片染色缸，黄色	Electron Microscopy Sciences	71385-Y
EasyDip 载玻片染色套装（染色缸+架），白色	Electron Microscopy Sciences	71388-01
EasyDip 不锈钢支架	Electron Microscopy Sciences	71388-50
70% 电镜级戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16360
热诱导表位修复（HIER）缓冲液：含 EDTA 的 10X Tris，pH 9	Dako	S2367
耐热载玻片染色盒	Electron Microscopy Sciences	62705-01
疏水屏障笔	Fisher	50-550-221
MIBI/O 软件	Ionpath	NA
MIBIcontrol 软件	Ionpath	NA
MIBIslide	Ionpath	567001
MIBIscope	Ionpath	NA
微量离心机	Eppendorf	5415D
切片机	Leica	RM2135
湿盒（加湿盒）	Simport	M922-1
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	Fisher Scientific	BP2944100
PT 模块	Thermo Scientific	A80400012
快速流动式无菌一次性过滤装置	Fisher Scientific	097403A
摇床	BioRocker	S2025
离心柱（Ultrafree-MC 离心滤膜，0.5 mL，0.1μm）	MillQ	UFC30VV00
载玻片烘箱	Fisher Scientific	6901
真空干燥柜	VWR	30621-076
Task-whipe	Kimberly Clark	34155
二甲苯	Sigma-Aldrich	534056-4L