使用福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的质谱成像扩展肿瘤微环境的理解

摘要

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动力学的兴趣惊人地增加。该协议详细介绍了质谱成像技术及其染色和成像步骤，允许高度多路复用的空间分析。

摘要

基于免疫的疗法的进步彻底改变了癌症治疗和研究。这引发了对肿瘤免疫景观表征的需求不断增长。虽然标准免疫组化适用于研究组织结构，但它仅限于分析少量标记物。相反，流式细胞术等技术可以同时评估多个标志物，尽管有关组织形态的信息丢失。近年来，整合表型和空间分析的多重策略已成为表征肿瘤免疫景观的综合方法。 在这里，我们讨论了一种结合金属标记抗体和二次离子质谱的创新技术，重点介绍了测定开发和优化，组织制备以及图像采集和处理中的技术步骤。在染色之前，必须开发和优化金属标记的抗体组合。这种高复级图像系统在单个组织切片中支持多达40种金属标记的抗体。值得注意的是，信号干扰的风险随着面板中包含的标记数量而增加。在设计面板后，应特别注意对抗体的金属同位素分配，以尽量减少这种干扰。使用一小部分抗体进行初步的面板测试，随后在对照组织中对整个面板进行测试。获得福尔马林固定的石蜡包埋组织切片并将其安装在镀金载玻片上并进一步染色。染色需要2天，与标准免疫组化染色非常相似。一旦样品被染色，它们就被放置在图像采集仪器中。选择视野，获取、上传和存储图像。最后阶段是图像准备，以便使用系统的图像处理软件进行滤波和消除干扰。该平台的缺点是缺乏分析软件。但是，生成的图像由不同的计算病理学软件支持。

引言

克隆性肿瘤群体周围众多细胞类型的重要性是癌变分类的关键因素。在建立基于免疫的疗法作为癌症治疗武器库的一部分之后，对阐明这种肿瘤微环境（TME）组成和相互作用的兴趣不断上升。因此，治疗策略已从以肿瘤为中心的方法转变为以TME为中心的方法¹。

近年来，阐明免疫细胞在肿瘤监测和癌症发展中的作用的努力急剧增加^2，3.在医学研究中，大量的方法，包括基于细胞术的方法以及单重和多重成像技术，作为破译TME多种元素独特相互作用的尝试的一部分， 出现了。

流式细胞术（20世纪60年代发明）、荧光活化细胞分选和质量细胞术等开创性方法主要集中在鉴定和定量TME组分⁴上。尽管基于细胞术的定量技术允许免疫景观表型分析，但确定细胞空间分布是不可能的。相反，诸如标准单重免疫组织化学之类的方法保留了组织结构并使研究人员能够分析细胞分布，尽管单个组织切片中靶标数量的减少是这些方法的局限性^5，6。在过去几年中，用于单细胞分辨率的多重成像技术（如多重免疫荧光，条形码荧光成像和成像质谱）已成为使用相同的组织切片

方案

根据德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会，出于研究目的获得了组织样本，并且样本进一步去鉴定。

1. 抗体选择

1. 定义研究问题以选择最佳可用的抗体克隆。使用人类蛋白质图谱、已发表的研究和抗体制造商网站作为研究资源。
   注意:选择足够的人体组织质控品和相同的人体组织质控品在不同步骤中染色对于确保标记物在正确的位置和正确的细胞区室中正确染色至关重要。始终建议使用包括正常组织和肿瘤组织在内的小组织微阵列（TMA）进行染色验证。
2. 仅使用无载体抗体来设计试剂盒。
   注意:如果没有商业无载体抗体，则需要使用无载体抗体制剂;纯化试剂盒可用于将抗体调整到正确的配方。已知蛋白质添加剂（如牛血清白蛋白）会降低偶联能力。
3. 使用标准色原性免疫组化测试和滴定每种抗体，以确定标记物表达的亚细胞模式;膜，细胞质或核染色;并在对照组织中的特定细胞中表达。
   注意:但是，每种抗体必须在pH 6柠檬酸盐和pH 9乙二胺四乙酸（EDTA）中进行测试，并且必须确定面板是否用pH 6柠檬酸盐或pH 9 EDTA染色。建议使用pH 9 EDTA来获得良好的信号，特别是在使用这种方法时。
4. 根据阳性对照中的表达模式选择最佳染色浓度。
5. 根据免疫组化标记丰度、亚细胞定位和细胞与其他靶标的共表达，将每种抗体分配给一种可用的金属同位素。
6. 用相应的指定金属染色抗体....

结果

获得扁桃体和肺腺癌TMA组织切片（5mm厚）并按照有关切片的组织大小和安全边缘的规格放置在金涂层载玻片的中间。组织边缘与载玻片的侧缘和下边界之间分别有5 mm和10 mm的自由玻璃边缘对于最佳染色是必需的。在染色之前，将组织切片在烤箱中烘烤过夜，以确保切片正确粘附在载玻片上。抗体组合由23个标记物组成。在同一染色批次中，包括扁桃体载玻片和含有多个组织的TMA载玻片，以评估肺腺癌样品中表达很少的标志物的表达（图1）。需要根据面板中使用的抗体靶标选择阳性对照;例如，为了评估SOX10的表达，需要黑色素瘤样本，为了评估GAFP表达，需要胶质母细胞瘤样本（图2）。

图 1

讨论

全面阐明TME多个组成部分之间复杂而复杂的相互作用仍然是癌症研究的关键目标。作为这项工作的一部分，制造商已经推出了许多多重检测方法，特别是在过去的5年中。多重空间分析是一种多功能且功能强大的工具，有助于同时对多个靶标进行分类，同时保持肿瘤样品中的结构形态。空间分析技术可以使用荧光成像或质谱法进行，例如本文^11、12、13中描述的技术。

在染色之前，需要使用常规的免疫组化方案进行抗体优化，然后使用染色方案来标准化抗体染色的再现性。一个非常众所周知的事实是，不同的常规抗体克隆在不同条件下可能具有最佳表达。然而，要用金属标签偶联抗体，需要无载体抗体，就像为整合到面板中的所有抗体定义相同的pH值以进行抗原检索一样，这是这种方法的缺点。未能完成此步骤可能会导致无法成功分析的低质量图像。必须花时间研究医学文献和抗体制造商的网站，以便从市售抗体中选择经过充分验证的最佳可靠抗体。在验证抗体和检测组合时，构建较小的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 试剂醇	Sigma-Aldrich	R8382
95% 试剂醇	Sigma-Aldrich	R3404
80% 试剂醇	Sigma-Aldrich	R3279
70% 试剂醇	Sigma-Aldrich	R315
20X TBS-T	离子路径	567005
10X 低钡 PBS pH 7.4	离子路径
10X Tris pH 8.5	离子光程	567003
4°C 冰箱	ThermoScientific	REVCO
气溶胶屏障移液器吸头 P10	奥林巴斯	24-401
气溶胶屏障移液器吸头 P20	奥林巴斯	24-404
气溶胶屏障移液器吸头 P200	奥林巴斯	24-412
气溶胶屏障移液器吸头 P1000	奥林巴斯	24-430
离心过滤器超自由-MC	Fisher Scientific	UFC30VV00
去离子 H2O	离子路径	567002
驴血清	Sigma-Aldrich	D9663
EasyDip 载玻片染色罐，绿色	电子显微镜科学	71385-G
EasyDip 载玻片染色罐，黄色	电子显微镜科学	71385-Y
EasyDip载玻片染色试剂盒（广格 + 架子），白色	电子显微镜科学	71388-01
EasyDip 不锈钢支架	电子显微镜科学	71388-50
戊二醛 70% EM 级	电子显微镜科学	16360
热诱导表位修复 （HIER） 缓冲液：10X Tris，含 EDTA，pH 9	Dako	S2367
耐热玻片腔室	电子显微镜科学	62705-01
疏水屏障笔	Fisher	50-550-221
MIBI/O 软件	Ionpath	NA
MIBIcontrol 软件	Ionpath	NA
MIBIslide	Ionpath	567001
MIBIscope	Ionpath	NA
微量离心机	Eppendorf	5415D
切片机	Leica	RM2135
水分室（湿室）	Simport	M922-1
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 片剂	Fisher Scientific	BP2944100
PT 模块	Thermo Scientific	A80400012
快速流无菌一次性过滤装置	Fisher Scientific	097403A
摇床	BioRocker	S2025
离心柱（Ultrafree-MC 离心过滤器，0.5mL 0.1μm ）	MillQ	UFC30VV00
滑轨烤箱	Fisher Scientific	6901
真空柜干燥器	VWR	30621-076
任务鞭	Kimberly Clark	34155
二甲苯	Sigma-Aldrich	534056-4L