用于冷冻电镜结构解析的与DNA修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

摘要

本方案详细阐述了使用两种样品制备方法制备用于冷冻电镜载网的核小体复合物的步骤。

摘要

在染色质背景下，DNA修复机制尚不明确。利用核小体核心颗粒（染色质的基本重复单位）开展的生化研究表明，大多数DNA修复酶对核小体DNA中损伤的清除速率低于游离DNA。目前尚未阐明碱基切除修复（BER）酶如何识别并清除核小体中DNA损伤的分子细节。然而，针对核小体底物的生化BER数据表明，核小体对修复过程构成的结构障碍因DNA损伤的位置及所涉酶的不同而异。这提示，这些酶在游离DNA与核小体中清除DNA损伤所采用的机制可能存在差异。鉴于基因组DNA的大部分均组装为核小体，因此亟需获得这些复合物的结构信息。迄今为止，科学界仍缺乏可用于开展此类复合物结构研究的详细且技术上可行的实验方案。本文中，我们提供了两种方法，用于制备两种基因融合的BER酶（DNA聚合酶β与AP内切酶1）结合于核小体DNA入口-出口附近单核苷酸缺口处的复合物，以进行冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构解析。这两种样品制备方法均适用于制备高质量的冷冻电镜载网。 通过 plunge freezing。本方案可作为制备含有不同BER因子、先锋转录因子以及染色质修饰酶的其他核小体复合物的起始参考。

引言

真核生物DNA通过组蛋白进行组织和压缩，形成染色质。核小体核心颗粒（NCP）是染色质的基本重复单位，可调控DNA修复、转录和复制过程中DNA结合蛋白对DNA的可及性¹。尽管NCP的首个X射线晶体结构早在二十多年前即已解析²，此后又陆续发表了大量NCP的结构^3,4,5,6，但核小体底物中的DNA修复机制至今尚未明确。要揭示染色质中DNA修复的分子细节，需要对参与其中的组分进行结构表征，以理解NCP的局部结构特征如何调控DNA修复活性。这一点在碱基切除修复（BER）背景下尤为重要，因为针对BER酶的生化研究表明，核小体中的DNA修复机制具有独特性，其机制依赖于酶特异性的催化结构需求以及DNA损伤在核小体内的结构位置^7,8,9,10,11,

方案

1. 通过盐梯度透析组装核小体核心颗粒

注意：使用重组组蛋白进行结构研究的核小体核心颗粒的制备方法已被其他研究者详细描述过^14,15,16。请参照其他研究者所述的方法进行重组X. laevis histones的纯化和组蛋白八聚体的组装^14,15，并按以下所述组装核小体底物。

1. 按指定规模购买三种寡核苷酸（见表1）：UND-197mer、161mer、35mer。
   1. 按文献所述方法对超长寡核苷酸（197mer 和 161mer）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化¹⁷。
      1. 在1×退火缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.0，50 mM NaCl）中将等摩尔量的寡核苷酸退火。例如，混合以下组分：40 µL 的161-mer [166.7 µM]；8 µL 的35-mer [292.4 µM]；16.8 µL 的197-mer互补链 [408.2 µM]；10 µL 的....

结果

正确组装的核小体核心颗粒（NCP）（图2）被用于与MBP-Polβ-APE1重组融合蛋白形成复合物（图3）。为了确定形成稳定复合物所需的NCP与MBP-Polβ-APE1的摩尔比例，我们进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）（图4），结果显示当MBP-Polβ-APE1过量5倍时，NCP出现单一迁移条带。在优化该复合物制备条件的过程中，使用戊二醛进行交联至关重要，可防止NCP解体。最初，NCP-Polβ-APE1复合物的组装在较小体积中进行，NCP浓度约为10 µM，戊二醛终浓度为0.005%。在此条件下，样品过度交联（图5D-E），导致形成无法分辨单个复合物的聚集体。当NCP稀释约10倍（1.2 µM NCP）进行交联时，聚集显著减少，颗粒稳定性明显提高（图5A

讨论

针对纯化DNA修复因子的具体方案将取决于目标酶的特性。然而，有一些通用建议可供参考，包括采用重组方法进行蛋白质的表达与纯化¹⁸；如果目标蛋白质过小（<50 kDa），在近期之前通过冷冻电镜（cryo-EM）进行结构解析几乎是不可能的，但随着融合系统¹⁹、纳米抗体结合支架²⁰以及成像策略优化技术的发展²¹，这一限制已逐步被克服。

在初期阶段获得质量较差的载网是很常见的现象。最初在未使用任何交联剂的情况下，采用醋酸铀酰对碳膜铜网进行负染色，以评估核小体核心颗粒（NCP）的均一性和稳定性，结果显示NCP分散良好、形态稳定，且聚集极少。然而，当该样品以高出20倍的浓度进行冷冻电镜载网玻璃化处理时，却未检测到任何颗粒。保持NCP不发生解聚或聚集的样品优化成为最大的技术难点。此外，文中分别描述了两种制备方法，但二者并非互斥，可依次连续使用，即首先纯化NCP 通过 制备凝胶，与修复.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M HEPES；pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15630080
1 M MgCl2	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
10x TBE	Bio-rad	1610733
25% 戊二醛	Fisher Scientific	50-262-23
3 M KCl	Thermo Fisher Scientific	043398.K2
491 制样电泳槽	Bio-rad	1702926
Amicon Ultra 15 离心过滤器（分子量截留值 30 kDa）	Millipore Sigma	Z717185
Amicon Ultra 4 离心过滤器（分子量截留值 30 kDa）	Millipore Sigma	UFC8030
AutoGrid 镊子	Ted Pella	47000-600
自动冷冻制样仪	Leica	Leica EM GP
C-1000 touch 梯度PCR仪	Bio-rad	1851148
C型夹片和夹环	Thermo Fisher	6640--6640
切片站	SubAngostrom	SCT08
透析膜（分子量截留值 6–8 kDa）	Fisher Scientific	15370752
金刚石镊子	Techni-Pro	758TW0010
双链DNA（dsDNA）	Integrated DNA Technologies	N/A
FEI Titan Krios 透射电镜	Thermo Fisher	KRIOSG4TEM
FPLC 纯化系统	AKTA Pure	29018224
组分收集器 Model 2110	Bio-rad	7318122
辉光放电清洗系统	Ted Pella	91000S
载网盒	SubAngostrom	PB-E
载网储存配件包	SubAngostrom	GSAX
液态乙烷	N/A	N/A
液氮	N/A	N/A
Minipuls 3 双头蠕动泵	Gilson	F155008
Nanodrop 核酸蛋白测定仪	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Novex 16% Tricine 1.0 mm Mini Protein 凝胶	Thermo Fisher Scientific	EC6695BOX
Pipetman 移液器	Gilson	FA10002M
移液器吸头（VWR）低吸附型	VWR	76322-528
丙烯酰胺凝胶溶液（37.5:1）	Bio-rad	1610158
聚乙二醇（PEG）	Millipore Sigma	P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500 透析装置	Millipore Sigma	PURX35050
纯化的重组DNA修复因子	N/A	N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 目铜载网	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
重组组蛋白八聚体	N/A	N/A
弹簧式夹网工具	SubAngostrom	CSA-01
Superdex 200 10/300 凝胶过滤柱	Millipore Sigma	GE28-9909-44
透射电子显微镜	Thermo Fisher	Talos Arctica 200 kV
FEI Vitrobot Mark IV-I 用镊子组件	Ted Pella	47000-500
UltraPure 甘油	Thermo Fisher Scientific	15514011
Vitrobot 自动冷冻制样仪	Thermo Fisher	Mark IV System
Whatman 滤纸（55 mm）	Cytiva	1005-055
二甲苯青	Thermo Fisher Scientific	440700500
Zeba Micro 脱盐离心柱，7K 分子量截留值，75 µL	Thermo Fisher Scientific	89877