利用双极电极通过杏仁核电点燃建立颞叶癫痫小鼠模型

摘要

杏仁核在颞叶癫痫的发生和传播中起着关键作用，该癫痫起源于此结构并由此扩散。本文详细描述了兼具记录和刺激功能的深部脑电极的制备方法，并介绍了一种起源于杏仁核的内侧颞叶癫痫模型。

摘要

杏仁核是癫痫发作最常见的起源之一，杏仁核小鼠模型对于癫痫研究至关重要。然而，目前很少有研究详细描述该模型的实验方案。本文详细阐述了杏仁核电点燃癫痫模型制备的完整过程，并介绍了一种双极电极的制备方法。该电极兼具刺激与记录功能，可避免因植入分别用于刺激和记录的独立电极而造成的脑组织损伤。为实现长期脑电图（EEG）记录，实验中采用滑环装置，以消除因导线缠绕或脱落导致的记录中断。

在对基底外侧杏仁核（前囟后 1.67 mm，外侧 2.7 mm，腹侧 4.9 mm）进行周期性刺激（60 Hz，每次 1 秒，每 15 分钟一次），平均刺激 19.83 ± 5.742 次后，六只小鼠均出现完全点燃现象（定义为根据 Racine 评分标准出现三次连续的 V 级发作）。在整个点燃过程中持续记录颅内脑电图，点燃后观察到杏仁核区域持续 20–70 秒的癫痫样放电。因此，该方法是一种可靠的模拟起源于杏仁核的癫痫模型，适用于研究杏仁核在颞叶癫痫中的作用。本研究为今后探讨内侧颞叶癫痫的发病机制及新型抗癫痫发生药物提供了重要基础。

引言

颞叶癫痫（TLE）是最常见的癫痫类型，且易发展为耐药性癫痫。选择性杏仁核海马切除术等外科手术是治疗TLE的有效方法，但该疾病的致痫机制和发作机制仍在研究中^1,2。研究表明，TLE的发病不仅发生在海马，还广泛涉及杏仁核^3,4。例如，杏仁核硬化和杏仁核增大均被频繁报道为TLE发作的起源^5,6。杏仁核的重要性不容忽视；建立杏仁核模型对于研究癫痫发生至关重要，目前迫切需要对该模型进行清晰的阐述。

已有多种方法被提出用于在动物模型中诱导癫痫发作。过去，通常在早期阶段通过腹腔注射致痫药物⁷。尽管该方法操作简便，但癫痫灶的位置不确定。随着立体定位技术的发展以及详细的动物脑图谱的建立，颅内给药被应用于解决定位问题⁸。然而，在急性期缺乏对严重发作的有效干预，导致较高的死亡率，且慢性自发性发作常伴随发作间期和发作频率不稳定的问题^9,10。....

方案

本实验经首都医科大学宣武医院实验动物伦理委员会批准。所有小鼠均饲养于首都医科大学宣武医院的动物实验室。本方案分为四个部分：前两部分介绍使用滑环构建电极及电路连接脑电记录/刺激设备的方法；第三部分描述电极植入的手术操作方法；第四部分介绍用于杏仁核癫痫模型的脑电记录与刺激参数。

1. 电极的制备

1. 准备好以下预先制备的材料：两段长度为 3 cm 的聚四氟乙烯涂层钨丝（裸丝直径：76.2 µm），一段相同长度的银丝（裸丝直径：127 µm），以及一组 2 x 2 规格的排针。
2. 使用打火机烧灼每根钨丝的一端，以去除约 5 mm 的绝缘涂层。
   注意：去除绝缘层后的钨丝端部会变黑；该变黑部分的钨丝称为上端。
3. 剥开一段极细的多股导线，并从底部开始向上缠绕至钨丝开始变暗的位置，继续缠绕至顶端。通过捏住一端并轻轻扭转另一端，将这种超细导线（质地柔软）与钨丝结合，使两种材料易于紧密绞合在一起。
4. 轻轻拉紧以确保缠绕牢固，并剪去多余的超细导线。在整个过程中尽量保持钨丝笔直。
5. 将排针固定在焊接台的夹具上，使针脚较长的一侧朝外。用注射器针头取适量焊膏，涂抹在针脚上。将焊接烙铁加热至 320 °C，用烙铁尖端熔化并涂抹无铅锡丝。
6. 将钨丝的上端与排针的一个针脚重叠，使用烙铁上的焊料将钨丝焊接到针脚上。
   注意：若无超细导线辅助，....

结果

电极和电路可实现脑电图的记录并发挥刺激作用（图1）；该设计避免了分别植入记录和刺激电极的复杂性，并最大限度地减少对脑组织的损伤。滑环的应用使得电极能够与各类设备连接。

我们对六只健康的成年雄性C57BL/6小鼠进行了电极植入手术，术后2周开始进行电刺激。随着刺激次数的增加，行为性癫痫发作程度逐渐加重，分级依据Racine评分标准：1分 = 口部或面部自动症；2分 = 两次或以下肌阵挛性抽动；3分 = 三次或以上肌阵挛性抽动和/或前肢阵挛；4分 = 前肢和后躯强直-阵挛性伸展；5分 = 伴有直立和跌倒的前肢和后躯强直-阵挛性伸展；6分 = 伴有疯狂奔跑或跳跃的前肢和后躯强直-阵挛性伸展¹⁴。记录达到完全点燃所需的刺激次数（表1）。

完全点燃后进行刺激的脑电图代表性结果如图2所示。后放电持续5-15秒；随后，颅内自发性放电增强，并开.......

讨论

癫痫是一组具有多种表现形式和不同病因的疾病¹⁸；需要注意的是，没有单一模型适用于所有类型的癫痫，研究人员必须根据具体研究选择合适的模型。本研究介绍了一种最易实现的电极制备方法。该方法的各个部分均可调整，以适应不同的实验条件。

该方法采用兼具刺激和记录功能的电极，减少了因分别植入刺激电极和脑电图（EEG）记录电极而对动物大脑造成的损伤。在制备电极时，可选择不同尺寸的排针。大号排针能够与滑环实现最牢固的连接；然而，当需要在动物头部植入多个器件时，可选用占用空间更小、操作更方便的小型排针，并使用多通道滑环连接所有植入的电极。滑环可焊接不同类型接口，以满足不同实验室脑电设备的需求。此外，滑环可使动物自由活动，避免导线缠绕。

为确保电极在长时间内不会脱落，需在颅骨完全干燥后涂抹牙科水泥。预先在颅骨表面做几条横向和纵向切口，也可增强固定效果。术后动物至少需要恢复一周时间，以使炎症消退，必要时可适当使用抗炎药物以促进恢复。在此期间不建议进行其他实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 标记的驴抗兔 IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos 抗体		ab222699
颅骨钻	SANS	SA302
牙科水泥	NISSIN
脑电图记录与刺激设备	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
无铅锡线	BAKON
插针排/插座排	XIANMISI		间距为 1.27 mm
银线	A-M systems	786000
滑环	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
钨丝	A-M systems	796000
超细多股线	深圳成兴线缆	UL10064-FEP
焊接设备	BAKON	BK881