Summary
본 프로토콜은 플라스모디오포라 브라시카에 의해 유도된 담즙의 조직학적 관찰을 위한 최적화된 방법을 기술한다. 배축의 Vibratome 섹션은 질병 진행 동안 전사 인자와 식물 호르몬의 관여를 연구하기 위해 형광 이미징 전에 제거됩니다. 이 프로토콜은 수지 임베딩 한계를 극복하여 형광 단백질의 플란타 시각화를 가능하게 합니다.
Abstract
토양 매개 원생 생물 인 Plasmodiophora brassicae 에 의한 브라 시카 작물의 감염은 지하 기관에 담즙 형성을 유도합니다. 담즙의 형성은 세포 재 프로그래밍과 감염된 식물의 신진 대사 변화를 필요로합니다. 이것은 숙주 영양소가 리디렉션되는 병원체 지향적 생리적 싱크를 확립하는 데 필요합니다. 이 특정 식물-병원체 상호 작용과 숙주 성장 및 발달이 전복되고 재 패턴화되는 메커니즘을 완전히 이해하려면 담즙 형성에 수반되는 내부 변화를 세포 분해능으로 추적하고 관찰하는 것이 필수적입니다. 형광 염색과 형광 단백질을 결합하는 방법은 종종 식물의 해부학 적 및 생리적 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 불행히도, 큰 크기의 담즙과 낮은 투명도는 현미경으로 전체 마운트 관찰을 수행하는 데 주요 장애물로 작용합니다. 또한, 낮은 투명성은 뿌리 줄기 질병 진행 및 담즙 형성을 연구하기 위해 형광 현미경의 사용을 제한합니다. 이 기사에서는 P. brassicae에 감염된 담즙을 검사하기 위해 에피형광 및 컨포칼 현미경을 용이하게 하기 위해 담즙을 고정하고 제거하는 최적화된 방법을 제시합니다. 신속한 광학 투명화를 위한 조직 투명화 프로토콜을 사용한 후 비브라톰 절편을 사용하여 해부학적 변화를 감지하고 프로모터 융합체 및 형광 단백질로 태그된 리포터 라인으로 유전자 발현을 국소화했습니다. 이 방법은 선충 유발 세포 융합 및 뿌리 매듭뿐만 아니라 곤충으로 인한 잎 덩어리 및 변형과 같은 식물의 다른 병원체 유발 구조에서 세포 및 생리적 반응을 연구하는 데 유용합니다.
Introduction
병원균이나 곤충의 영향을받는 식물은 비정상적인 구조 (장기 변형 또는 담즙)를 개발할 수 있으며, 이로 인해 침입자가 영양분을 섭취하고 번식 할 수 있습니다1. 여기에서 원생 생물 Plasmodiophora brassicae 에 감염된 식물의 지하 부분에서 발생하는 담즙에서 일어나는 변화를 연구하기 위해 효율적인 조직 병리학 적 접근이 수행되었습니다 (그림 1). 이 병원체와 관련된 사소한 실은 P. brassicae 휴식 포자가 수년 동안 식물을 침범 할 수있는 능력을 유지할 수 있다는 사실에서 비롯됩니다. 유지 종자 유채 (Brassica napus)의 대규모 재배의 경우, 경제적 요인이 작물 순환을 제한하여 토양에 포자가 축적되기 때문에 심각한 문제입니다2. P. brassicae 로 인한 뿌리 질병에 대한 지방 종자 강간의 내성은 유 전적으로 결정됩니다. 슬프게도, 병원체는 생물학과 지방 종자 강간이 시작된 좁은 유전자 풀 때문에 종종 저항력을 능가합니다. 따라서 숙주 식물의 감염 후 반응과 질병 진행을 늦추거나 특정 증상이 발생하는 것을 예방하는 능력을 연구하는 것이 적절해졌습니다.
뿌리 질환에서 중증도는 일반적으로 담즙의 발달과 뿌리 시스템 손상 정도에 따라 평가됩니다. 이것은 질병 지수-DI로 알려져 있습니다.3. 그러나 이 식물-병원균 상호 작용에 대한 진정한 평가를 완전히 포착하지는 못합니다. 특히 병원균이 뿌리 내에 어떻게 분포되어 있는지, 식물이 억제 할 수 있는지 여부는 다루지 않습니다. P. brassicae 조직 내에서의 움직임. 또한 어느 정도까지 예측하기가 쉽지 않습니다. P. brassicae 지하 장기 해부학을 재 프로그래밍합니다. 모델 플랜트에 관한 연구 Arabidopsis thaliana 그것을 보여주었습니다 P. brassicae 감염은 목공 형성의 억제 (시작 및 성숙 단계 모두)와 담즙 내 체관 분화의 향상으로 이어진다.4,5. 또한, 감염된 식물의 뿌리와 배축에서, cambial 세포 자손은 유사 분열 상태를 종료하지 않고 건강한 식물보다 오래 증식합니다.6. 이 과정은 담즙의 최종 크기를 제어하고 감염된 식물 내에서 생성되는 병원체 휴식 포자의 수를 결정합니다. P. brassicae-숙주에서 주도적 발달, 대사 및 생리 학적 재 프로그래밍은 매우 복잡합니다.7; 따라서 담즙 내의 내부 변화를 검사 할 수있는 도구를 적용하는 것은 이러한 상호 작용을 적절하게 평가하는 데 중요합니다. 의 수명주기 진행 P. brassicae 전분 또는 지질 침착으로 관찰 될 수있는 숙주 세포 대사의 재 프로그래밍이 동반됩니다.7,8. 담즙의 성공적인 현미경 검사의 주요 장애물은 낮은 투명성에서 비롯됩니다. 이로 인해 담즙 내에서 곤봉 뿌리 주도 변화를 나타내는 대부분의 조직 학적 표본은 고정 임베딩 (왁스 또는 수지) 기술과 마이크로 톰 절편에서 비롯됩니다. 이러한 접근법은 곤봉 뿌리 담즙에서 활성인 수많은 유전자에 대한 프로모터 활성을 찾는 데 성공적으로 사용되었습니다.4,5 또는 관찰을 용이하게하는 다양한 염색 기술 P. brassicae 라이프 사이클 진행9. 그러나 고정 및 매립 단계는 시간이 많이 걸리고 중요한 생체 분자 (예 : 지질)가 부분적으로 또는 완전히 씻겨 져 특정 관찰을 크게 방해한다는 점에 유의해야합니다. 요사이 P. brassicae 숙주에서의 생애주기 진행은 형광 현장 혼성화 (FISH)의 도움으로 시각화되었으며, 여기서 SABATH 형 메틸 트랜스퍼 라제 (PbBSMT) 유전자 특이적 프로브를 휴지기 포자 형성을 표시하기 위해 사용하였다.10. 좋은 대안은 일부 세포 성분의 자가형광, 형광 단백질 마커에 융합된 유전자의 5'-상류 조절 영역의 활성, 및 특정 형광 태그된 단백질의 축적이 보일 수 있는 다른 형광 기반 방법의 사용이다. 그러나 샘플의 투명도가 낮을 뿐만 아니라 이러한 개체와 관련된 주요 단점은 고정되지 않은 표본으로 작업하는 것이므로 양질의 이미지를 문서화할 수 있는 시간이 크게 줄어듭니다. 2015 년 구리하라 외.11 형광 단백질을 보존하고 식물 조직 표본의 투명성을 높이는 투명화 시약을 개발했습니다. 또한 수많은 조직 학적 염색과 호환됩니다. 최근에는 식물 조직에서 다른 세포벽 구성 요소를 시각화하기 위해 동일한 기술이 성공적으로 적용되었습니다.12,13. 여기에서 이 프로토콜은 다양한 클럽루트 담즙 발달 측면을 분석하는 데 사용되었습니다. 워크플로우는 담즙 고정, 비브라톰 절편, 조직 투명화, 염색 및 형광 이미징으로 시작됩니다. 필요에 따라 직접 또는 특정 염색 후에 결과 섹션을 에피 형광 또는 컨 포칼 현미경으로 검사 할 수 있습니다. 이 방법은 식물 호르몬 균형 및 신호 전달을 포함하여 유전자 발현 및 생리적 반응의 국소 변화를 연구하는 효과적인 솔루션을 제공합니다. 질병 진행은 휴지기 포자의 분포 패턴과 성숙 역학을 살펴봄으로써 추적할 수 있습니다. 또한 프로토콜은 이미징 특성 변화에 쉽게 적용할 수 있습니다. P. brassicae 감염된 식물은, 자일로신생의 억제 또는 내성 유전자형에서 국소 발화로서 보이는 숙주 식물 방어 반응을 포함한다. 이 프로토콜의 예는 Arabidopsis thaliana 모델; 그러나 프로토콜은 에 속하는 다른 작물 종에도 적용될 수 있습니다. Brassicaceae 가족. 아래에 설명 된 방법은 담즙 형성에 수반되는 세포 구조 및 분자 변화에 대한 향후 상세한 연구를 용이하게 할 것입니다. P. brassicae-감염된 식물.
프로토콜의 일반적인 워크플로는 매우 간단하며 담즙 발달의 모든 단계를 쉽게 이미지화하고 특성화할 수 있습니다(그림 2). P. brassicae 는 토양 매개 병원체이기 때문에 모든 실험은 토양 기반 시스템에서 수행되어야합니다. 병원체는 산성 조건을 선호합니다. 따라서 석회 처리되지 않은 토양 기질을 사용해야합니다. P. brassicae 는 인간에게 위협이되지 않지만 토양과 물을 통해 퍼질 수있는 식물 병원체입니다. 따라서 토양뿐만 아니라 감염된 식물의 모든 부분은 실험 후 오토 클레이브 또는 표백제로 처리하여 파괴해야합니다.
Protocol
1. 식물 성장 조건
- 22 ° C에서 9 시간의 빛과 20 ° C에서 15 시간의 어둠과 120 μmol · m-2 s-1의 방사 조도로 단일간의 빛 영역에서 Arabidopsis thaliana 식물을 재배하십시오 (광합성 활성 방사선으로 측정, 캐노피 수준에서 PAR, 재료 표 참조).
2. 포자 접종물의 제조
참고: 자세한 내용은 Fuchs et al.14를 참조하십시오.
- 300mL의 오토클레이브 증류수가 포함된 블렌더에서 배추 식물(Brassica rapa var. pekinensis 품종 "Granaat")에서 2-3개의 냉동 담즙을 균질화하고 4층의 멸균 거즈를 통해 여과합니다.
- 여과액을 원심분리하고(6,000 x g에서, 5분 동안, 그리고 4°C에서) 주걱을 사용하여 포자 펠릿으로부터 전분 층을 기계적으로 제거한다. 대부분의 전분이 제거 될 때까지이 과정을 반복하십시오.
- 혈구계13 을 사용하여 20 개의 서로 다른 필드 영역에서 포자 수를 세어 포자 농도를 결정하십시오.
- 접종에 사용되는 포자 현탁액의 최종 농도가 애기장대 탈리아나의 경우 1 x 106 포자·mL-1인지 확인하십시오. 발아 20 일 후 각 식물에 보정 된 포자 현탁액 2mL를 접종하십시오.
3. 조직 준비 및 고정
- 식물 조직을 준비하십시오.
- 뿌리 감염 및 감염되지 않은 식물의 뿌리 시스템에서 토양을 조심스럽게 제거하십시오. 물로 철저히 청소하고 배축과 담즙 (길이 0.5-2cm)을 미세 원심 분리기 튜브에 모으십시오.
- 아래 단계에 따라 PFA 고정(4% 파라포름알데히드, 1x PBS 중 PFA + 0.01% 트리톤 X-100)을 수행합니다.
- 4 ° C에서 교반하여 100 mL의 PBS (인산염 완충 식염수, pH 7.4, 표 65)에 65 g의 PFA 분말 (재료 표 참조)을 추가합니다 (끓이지 마십시오). KOH (10M 및 1M)를 적가하여 pH가 약 11 인 투명한 용액을 얻으십시오.
- H2SO4로pH를 조정하여 6.9로 낮추고 고정을 개선하기 위해 0.01%(v/v) Triton X-100을 추가합니다. 용액을 분취하여 -20 ° C (재동결하지 않음)에서 저장하거나 4 ° C에서 보관하십시오.
- 조직 고정을 수행하십시오.
- 샘플을 진공 펌프를 사용하여 일정한 진공(700 mbar)을 적용하여 실온에서 1시간 동안 200-500 μL의 PFA 고정액에 고정합니다. 물체가 PFA 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.
참고: 샘플은 4°C(냉장고)에서 몇 주 동안 보관하고 나중에 절단에 사용할 수 있습니다.
- 샘플을 진공 펌프를 사용하여 일정한 진공(700 mbar)을 적용하여 실온에서 1시간 동안 200-500 μL의 PFA 고정액에 고정합니다. 물체가 PFA 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.
4. 조직 매립 및 절편
- 감염되지 않은 배축 및 감염된 담즙의 아가 로스 임베딩에 4 % w / v 아가 로스를 사용하십시오. 용액을 끓여서 아가 로스를 녹이고 점성이있는 동안 식을 때 붓습니다.
- 과도한 PFA를 제거하기 위해 몇 초 동안 티슈에서 물체를 약간 건조시킵니다.
- 이쑤시개 / 집게를 사용하여 식물 물체를 아가 로스에 조심스럽게 삽입하고 방향을 잡습니다. 비스듬한 단면을 방지하려면 축이 비브라톰 블레이드의 평면에 수직이 되도록 물체의 방향과 성형이 올바른지 확인하십시오(방사형 단면의 경우).
- 아가로스 응고를 가속화하려면 페트리 또는 다중 배양 플레이트를 4°C에서 10분 동안 두십시오.
참고: 물체가 너무 큰 경우(접종 후 21일[DPI]에 더 큰 애 기장대 담즙의 경우와 같이) 아가로스에 삽입하지 않고도 물체를 절단할 수 있습니다.
5. 비브라톰 절편
알림: 비브라톰에는 식물 기관/조직을 절단하기 위한 진동 면도날이 장착되어 있습니다. 진동 속도, 진폭, 블레이드 각도 및 단면 두께는 모두 조정할 수 있는 매개변수입니다( 재료 표 참조).
- 블레이드를 사용하여 아가 로스 블록 내에서 물체를 조심스럽게 자르고 성형하여 절단에 선호되는 방향을 확인합니다.
- 아가로스 블록/큰 담즙을 붙여서 시아노아크릴레이트/인스턴트 접착제와 마스킹 테이프를 사용하여 시편 홀더에 적절하게 장착합니다( 재료 표 참조).
- 애기장대 배축 및 담낭 (초기 단계)의 경우 좋은 품질의 이미지를 얻으려면 단면의 두께를 30-40 μm 사이로 유지하십시오.
참고: 담즙 진행의 후기 단계를 분석하기 위해 단면의 두께는 50-80 μm 사이일 수 있습니다. - 움직이는 블레이드의 진동으로 인해 담즙 샘플이 파괴될 수 있으므로 더 얇은 부분을 절단하지 마십시오.
- 갤의 두께와 크기(40μm 또는 60μm)에 따라 단면, 속도 및 진동 진폭의 두께를 조정합니다.
- 수조에 증류수를 넣고 절편을 시작하십시오.
- 집게나 브러시를 사용하여 절편을 조심스럽게 수집하고 1mL의 1x PBS 버퍼(pH 7.4)가 포함된 미세 원심분리 튜브에 옮깁니다.
참고: 일반적으로 진동 진폭이 높을수록 단면화 품질이 향상됩니다. 성숙한 휴식 포자를 포함하지 않는 감염되지 않은 배축 또는 담즙의 경우 진동 진폭을 0.60mm·s-1 속도로 1.2mm로 유지할 수 있습니다. 세포 무결성이 부분적으로 손실되고 포자 성숙의 징후가 보이는 큰 담즙의 경우 진동 진폭을 0.55mm·s-1 속도로 0.45mm로 줄여야 합니다.
6. 표본 클리어링
- 마이크로 원심분리 튜브에서 1x PBS를 제거하고 200-500μL의 투명화 용액을 추가합니다(표 1).
- 이제부터는 샘플을 어두운 곳에서 실온에 보관하십시오. 물체가 항상 클리어링 솔루션에 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 샘플 처리 중 일정 시간 후에 색상이 변하는 경우 투명화 용액을 새 용액으로 교체하십시오.
알림: 투명액의 색상은 샘플 처리로 인해 노란색으로 변할 수 있습니다. 이러한 경우 조직의 청소를 개선하기 위해 용액을 교체하는 것이 좋습니다.
7. 염색 절차
- 세포벽에 대한 Calcofluor 백색 염색 (식물 세포 외설 용)의 경우, 투명화 용액에 5 % v / v의 Calcofluor 백색 염색 ( 재료 표 참조)을 준비하십시오. 어둠 속에서 최소 5분 동안 염색합니다.
- Nile Red로 지질을 염색하려면(감염된 세포에서 휴지기 포자와 기름 방울을 염색하기 위해) 투명화 용액에 1mg/mL의 스톡( 재료 표 참조)을 준비합니다. 더 희석하여 1:99를 얻습니다. 어둠 속에서 최소 10분 동안 염색합니다.
- 기본 푹신 리그닌 염색의 경우 투명화 용액에 0.2% w/v의 얼룩( 재료 표 참조)을 준비합니다. 어둠 속에서 최소 10분 동안 염색합니다.
참고: 이중 염색 중에 샘플은 Calcofluor 흰색 적용 전에 먼저 10분 동안 나일 레드로 염색됩니다. 과량의 염색 용액은 각 단계 후에 제거하였다. 물체가 과도하게 얼룩진 것 같으면 클리어링 용액으로 세척하여 과도한 얼룩을 제거하십시오. 필요한 경우 투명화 용액을 사용하여 얼룩을 희석하십시오. Calcofluor 염색 전에 항상 나일 레드/베이직 푹신으로 샘플을 염색하십시오. Calcofluor로 먼저 염색하면 나일 레드에 의한 포자의 적절한 염색을 방지 할 수 있습니다.
8. 현미경
- 현미경 슬라이드에 깨끗한 부분을 장착하고 에피형광 또는 컨포칼 현미경으로 관찰합니다( 재료 표 참조). 샘플의 건조를 방지하기 위해 투명 용액을 장착 매체로 사용하십시오.
- 여러 획득 모드를 사용하여 둘 이상의 형광 스펙트럼을 동시에 이미징할 수 있습니다.
참고: 제시된 프로토콜에 사용된 여기/방출 스펙트럼은 다음과 같습니다: 나일 레드 553/636 nm, 목부 자가형광 380/475 nm, 염기성 푹신 561/650 nm, 칼코플루오르 화이트 405/475 nm, erRFP 585/608 nm 및 GFP 488/509 nm(표 2).
Representative Results
지질과 수베린을 염색하는 나일 레드를 사용하면 지질을 포함하는 병원체 휴식 포자를 볼 수 있습니다(그림 3A,B). 따라서 이중 염색을 사용하여 담즙 내의 병원체 분포 패턴을 보기 위해 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. Calcofluor 흰색을 사용한 대조 염색은 대비를 생성하고 P. 브라 시카 성숙과 목부 발달을 동시에 추적하는 데 도움이됩니다 (그림 3B).
목부 형성 및 발달은 염색되지 않은 샘플에서 자가형광을 관찰하거나(그림 4A) 리그닌의 형광 기반 이미징을 가능하게 하는 Basic Fuchsin과 같은 염색(그림 4B)을 사용하여 확인할 수도 있습니다.
이 방법을 사용하면 유전자 발현 변화 또는 성장 조절제에 대한 반응을 추적 할 수 있습니다. 완벽한 예는 pHCA2 : erRFP 구조를 보유한 애기장대 식물을 사용하여 클럽 뿌리 담즙 내의 체관 조직에서 높은 캄비알 활성 2 (HCA2) 유전자 발현을 시각화 한 곳입니다. HCA2 유전자 활성은 이전에 분열학적 활성 형성층 및 체관부-계통 세포(15)에서 발견되었다. 여기에서 P. 브라 시카 주도 담즙 발달의 후기 단계에서 체관부와 공동 국소화되며 그 활동은 P. 브라 시카가 체관 복잡성을 증가시키는 방법을 반영합니다 (그림 5). 결과 이미지는 형성층이 조각화될 때 담즙 발달의 후기 단계에서 체관부 증식을 보여줍니다. 그림 5A는 담즙의 투명하지 않은 손 섹션을 보여주는 반면, 그림 5B는 비브라톰 절편에 이어 조직 투명화에 의해 얻어진 보다 선명하고 국부적인 형광 신호를 보여줍니다. 물체를 칼코플루오르 화이트로 대조염색하였다. 그림 6은 이 이미지(그림 6B)를 21DPI에서 수지 내장 및 마이크로톰 절편 갤(그림 6A)에 표시된 유사한 영역과 비교합니다. 감염된 식물과 감염되지 않은 식물 사이의 차이 사이토키닌 반응은 개발 담즙에서 TCS:GFP(2성분 신호) 마커16의 발현을 확인하여 평가했습니다(그림 7). 2차 비후가 있는 담즙 및 조직에서 약한 GFP 신호를 이미징하는 동안 성숙한 목부 세포의 자가형광으로 인한 추가 배경 신호도 이미징 중에 캡처된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
그림 1: 플라스모디오포라 브라시카에 포자가 있는 26DPI에서 유지종자 강간(B. napus) 및 애기장대 탈리아나(Columbia-0)에 대한 만곡근 질환 증상. 질병이 진행되는 동안 전체 뿌리 시스템에서 큰 담즙이 발생하여 매우 부서지기 쉽습니다. 미래의 감염을 촉진하기 위해 주변 토양으로 포자를 방출하는 것으로 결론을 내립니다. 식물체의 상부는 또한 성장과 발달이 좋지 않은 징후를 보입니다. 마지막으로, 감염된 식물은 뿌리 시스템이 완전히 손상되고 식물이 더 이상 질병에 대처할 수 없으면 성장 대사 및 발달에 대한 파괴적인 영향에 굴복합니다. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. -INF는 모의 접종을 나타내고 +INF는 P. 브라시카에 접종된 식물을 나타냅니다. 이 경우 건강한 뿌리 시스템을 제공하기 위해 토양 제거 전에 유지 종자 유채 식물의 사진이 제공됩니다. 세척 후 배축과 뿌리의 윗부분 만 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적인 워크플로 세척된 애기장대 뿌리 시스템은 (A) 해부, (B) 고정, (C) 아가로스 매립, (D) 장착 및 (E) 비브라톰 상에 절편화된다. 생성 된 개체는 조직 청소를 받게됩니다 (조직 유형 및 두께에 따라 어둠 속에서 RT에서 3 일 내지 수 주). (F) 그런 다음 투명해진 물체를 현미경으로 염색하고 검사할 수 있습니다. (G) 워크플로 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 나일 레드 염색으로 병원체 포자 표시. (A,B) 나일 레드는 휴지기 포자의 지질을 염색하여 P. 브라시카 성숙을 추적하는 데 완벽하게 작동합니다. (A) P. brassicae에 의해 식민지화되고 병원체 포자로 채워진 확대 된 세포. (B) 성숙한 목부 세포도 나일 레드로 염색됩니다. 절편은 숙주 세포의 지출을 보기 위해 Calcofluor white로 대조염색되었습니다(A: 대물 렌즈 = 20x 및 단면 두께 = 60μm; B: 대물 렌즈 = 5x 및 단면 두께 = 60μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 목부 발달 및 성숙 범위 추적 . (A) 리그닌은 UV로 여기시 강한자가 형광을 제공합니다. 따라서 성숙한 목부는 비교적 쉽게 구별 될 수 있습니다. (B) 염기성 푹신 및 칼코플루오로를 사용한 이중 염색은 모든 세포가 후자의 염료에 의해 염색되는 반면 성숙한 목부는 염기성 푹신으로 뚜렷하게 염색되기 때문에 더 나은 결과를 제공합니다. 이러한 방식으로 이중 염색은 자일로형성의 현저한 억제를 나타내는 개선된 대비를 가진 이미지를 제공합니다(A: 대물 렌즈 = 10x 및 단면 두께 = 60μm; B: 대물 렌즈 = 10x 및 단면 두께 = 60μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 21DPI에서 P. 브라시카에 감염된 식물의 배축에서 HCA2 유전자에 대한 체관부 특이적 신호. 형질전환 애기장대 탈리아나를 보유하는 proHCA2::erRFP에 대한 프로모터 활성은 (A) 및 (B)에서 볼 수 있습니다. 패널 (A)의 지워지지 않은 손 섹션, 특히 고르지 않은 손 섹션에서 중첩 및 겹치는 세포층으로 인해 erRFP 신호가 확산된 것처럼 보이는 경우 차이가 관찰될 수 있습니다. 한편, (B)는 erRFP 신호가 성숙한 혈관 다발의 체관부 세포를 정확하게 표시하는 조직 청소 후 비브라톰 섹션을 보여줍니다(대물 렌즈 = 20x 및 단면 두께 = 60μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 형광의 도움으로 TB, 수지 내장 및 마이크로톰 절단 담즙의 비교. (A) 톨루이딘 블루(TB), 수지 내장 및 마이크로톰 절편 담즙의 이미지 및 (B) 형광의 도움으로 획득한 대표적인 개체(도 5B에 제시됨)의 이미지 비교. 목부 세포는 노란색 별표, 형성층 영역에는 생생한 녹색 괄호, 체관부에는 청록색 별표, 플라스모디오포라 브라시카에 집락 세포는 흰색 PB 기호로 표시됩니다. 수지 포매 섹션 (A)은 비대 기관에서 휴식 포자의 분포, 질병 진행 정도 및 내성 식물의 국소 lignification과 같은 기타 과정을 연구하는 데 좋은 해상도를 제공합니다. 그러나, 여기에 기술된 프로토콜(B)은 유전자 발현 또는 단백질 축적의 민감한 관찰 및 다른 생리학적 변화 및 지질(포자 내)과 같은 중요한 분자의 시각화를 가능하게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 16DPI에서 비감염(-INF) 및 P. 브라시카에 감염(+INF) 애기장대 식물의 배축에서 사이토키닌 신호 반응 추적. TCS::GFP 마커는 플란타 사이토키닌 반응에서 특성화하기 위해 사용되었습니다. 비브라톰 절편은 투명화 처리를 거친 후 칼코플루오르 화이트로 염색하였다. 이미지에 따르면 16DPI에서 사이토키닌 반응은 감염된 담즙(오른쪽 패널)에서 크게 감소하는 것으로 보이며, 특히 체관부 풀(체관 조직을 형성하기 위해 분화하는 세포), 감염되지 않은 식물(왼쪽 패널)에서는 강하게 유지됩니다(대물 렌즈 = 5x 및 두께 = 30μm). 특정 수준의 목부 자가형광도 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 클리어링 용액 (독성) | ||
| 구성 요소 | 백분율(%) | 증류수 100mL에 |
| 크실리톨 | 10% | 10골드 |
| 소듐 데옥시콜레이트 | 15% | 15지 |
| 요소 | 25% | 25골드 |
| 10x PBS (인산염 완충 식염수) | 1x PBS (100 밀리리터) | |
| 나트륨 | 8 지 | 10 mL 10x PBS + 90 mL 증류수 |
| 증권 시세 표시기 | 0.2 지 | |
| KH2PO4 | 0.24 지 | |
| 나2HPO4 · 2H2O | 1.81 지 | |
| 증류수 | 100 밀리리터 | |
| 산이 | HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정 | |
| 오토클레이브하고 4°C에서 보관한다. | ||
표 1: 클리어링 용액 및 인산염 완충 식염수(PBS)의 조성.
| 형광 얼룩/ 태그 | 여기/방출 파장 | 현미경 필터 세트 사용 |
| 나일 레드 | 553/636 나노미터 | 필터 세트 43 |
| 목부 자가형광 | 380/475 나노미터 | 필터 세트 49 |
| 칼코플루오르 화이트 | 405/475 나노미터 | 필터 세트 49 |
| 기본 푹신 | 561/650 나노미터 | 필터 세트 43 |
| erRFP | 585/608 나노미터 | 필터 세트 43 |
| 증권 시세 표시기 | 488/509 나노미터 | 필터 세트 38 |
표 2: 본 연구를 위해 선택된 여기/방출 스펙트럼.
Discussion
담즙의 비브라톰 절단 부분에 클리어링 솔루션을 적용하면 P. 브라 시카와 숙주 식물 사이의 생물 영양 상호 작용을 연구하는 능력이 확실히 향상됩니다. 클리어링 프로토콜은 핸드 섹션에도 적용되지만 비브라톰 섹션에서 더 잘 작동합니다. PFA 고정액에 샘플을 고정하는 것은 절편을 진행하기 전에 샘플을 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있기 때문에 프로토콜에서 중요한 단계로 작용합니다. 이는 고정 중에 형광 단백질의 발현 및 보존을 손상시키지 않으면서 제한된 기간 동안 샘플을 저장할 수 있는 유연성을 제공합니다.
나일 레드 (DMSO 또는 메탄올에서)는 소수성으로 인해 수지 섹션과 호환되지 않으며, 이는 수지를 용해시키고 수지 내장 섹션17을 파괴합니다. 따라서 비브라톰 섹션은 발달 중인 담즙 내에서 병원체 분포와 수명 주기를 연구하는 데 도움이 되며, 여기서 나일 레드 염색을 쉽게 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용되는 투명화 용액은 매우 다목적입니다12, 다양한 형광 염색을 다양한 조합으로 사용하여 세포벽의 다양한 생체 분자/구성 요소(곰팡이 상호 작용에서 수베린, 리그닌, 셀룰로오스 및 키틴)를 염색할 수 있습니다. 또한, 형광 GFP 마커 라인의 절편을 대조염색하여 프로모터 활성 또는 단백질 축적 패턴을 특정 세포 또는 담즙 영역에서 병원체의 존재와 상관시킬 수 있습니다. 그러나 목부와 병원체로 채워진 거대 세포의 배경 자가형광은 클리어링 프로토콜 후에도 제거할 수 없었습니다. 이것은 담즙 형성의 후기 단계, 특히 에피 형광 현미경을 사용하고 약한 신호를 이미징 할 때 형광 마커를 보는 데 한계를 나타냅니다.
형광 신호의 발현/축적 수준이 낮기 때문에 전사 인자를 검출하기 어렵지만 이 기술을 사용하면 만족스러운 이미지를 얻을 수 있습니다. 전반적으로 비브라톰 절편과 조직 투명화 접근법을 결합하면 복잡한 담즙 조직의 조직학적 관찰을 위한 툴킷이 확장됩니다. 이 프로토콜의 유연성은 조직 고정 과정을 용이하게 하고 형광 단백질 및 프로모터 활성을 관찰하기 위해 신선한 조직 샘플을 절단하고 이미징하는 데 필요한 시간을 줄입니다. 추가 개선과 다양한 생체 분자에 특이적인 다른 형광 염료를 활용함으로써 이 방법은 조직학 연구 및 복잡한 조직 조직을 가진 조밀하고 불투명한 조직의 이미지 분석에서 더 큰 발전을 가져올 것입니다. 최근에, 제시된 조직 투명화 방법은 상이한 형광 신호(11,12,13)의 동시 획득을 결합하고 가능하게 하기 위해 대중적이고 널리 사용되는 프로토콜로서 등장하였다. 이러한 기술의 향후 개발 및 수정은 세포 수준에서 식물 - 병원체 상호 작용을 관찰하기위한 이미지 해상도를 크게 향상시킬 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 폴란드 국립 과학 센터 OPUS17 보조금 번호 2019/33/B/NZ9/00751 " Plasmodiophora brassicae에 감염된 식물의 장거리 혈관 조정"의 지원을 받았습니다. proHCA2::erRFP 라인을 공유해 주신 Yrjö Helariutta 교수(케임브리지 대학교 세인즈베리 연구소)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
| Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
| Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
| Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
| Commercial Bleach | Domestos | ||
| Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
| Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
| Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
| Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
| Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
| Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
| Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
| Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
| Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
| Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
| Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
| Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |
References
- Harris, M. O., Pitzschke, A. Plants make galls to accommodate foreigners: Some are friends, most are foes. New Phytologist. 225 (5), 1852-1872 (2020).
- Peng, G., et al. Crop rotation, cultivar resistance, and fungicides/biofungicides for managing clubroot (Plasmodiophora brassicae) on canola. Canadian Journal of Plant Pathology. 36 (1), 99-112 (2014).
- Siemens, J., Nagel, M., Ludwig-Müller, J., Sacristán, M. D. The interaction of Plasmodiophora brassicae and Arabidopsis thaliana: Parameters for disease quantification and screening of mutant lines. Journal of Phytopathology. 150 (11-12), 592-605 (2002).
- Malinowski, R., Smith, J. A., Fleming, A. J., Scholes, J. D., Rolfe, S. A. Gall formation in clubroot-infected Arabidopsis results from an increase in existing meristematic activities of the host but is not essential for the completion of the pathogen life cycle. The Plant Journal. 71 (2), 226-238 (2012).
- Walerowski, P., et al. Clubroot disease stimulates early steps of phloem differentiation and recruits SWEET sucrose transporters within developing galls. The Plant Cell. 30 (12), 3058-3073 (2018).
- Olszak, M., et al. Transcriptional profiling identifies critical steps of cell cycle reprogramming necessary for Plasmodiophora brassicae-driven gall formation in Arabidopsis. Plant Journal. 97 (4), 715-729 (2019).
- Malinowski, R., Truman, W., Blicharz, S. Genius architect or clever thief-How Plasmodiophora brassicae reprograms host development to establish a pathogen-oriented physiological sink. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (10), 1259-1266 (2019).
- Bi, K., et al. Integrated omics study of lipid droplets from Plasmodiophora brassicae. Scientific Reports. 6, 36965 (2016).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Badstöber, J., Gachon, C. M. M., Ludwig-Müller, J., Sandbichler, A. M., Neuhauser, S. Demystifying biotrophs: FISHing for mRNAs to decipher plant and algal pathogen-host interaction at the single cell level. Scientific Reports. 10, 14269 (2020).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Sexauer, M., Shen, D., Schön, M., Andersen, T. G., Markmann, K. Visualizing polymeric components that define distinct root barriers across plant lineages. Development. 148 (23), (2021).
- Fuchs, H., Sacristan, M. Identification of a gene in Arabidopsis thaliana controlling resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) and characterization of the resistance response. Molecular Plant-Microbe Interactions. 9 (2), 91-97 (1996).
- Guo, Y., Qin, G., Gu, H., Qu, L. -JDof56HCA2, a Dof transcription factor gene, regulates interfascicular cambium formation and vascular tissue development in Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (11), 3518-3534 (2009).
- Liu, J., Müller, B. Imaging TCSn::GFP, a Synthetic Cytokinin Reporter, in Arabidopsis thaliana. Plant Hormones: Methods and Protocols. Kleine-Vehn, J., Sauer, M. , Springer. New York. 81-90 (2017).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Fujimoto, T. Histochemical Detection of Lipid Droplets in Cultured Cells. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 483-491 (2013).
