本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。
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摘要
摘要
巨噬细胞在稳态和炎症过程中具有重要的效应功能。这类细胞存在于机体的每一种组织中，能够根据微环境中的刺激信号改变其表型。细胞因子可显著影响巨噬细胞的生理状态，其中干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin 4）分别诱导形成M1型和M2型巨噬细胞。由于巨噬细胞具有高度可塑性，制备骨髓来源的巨噬细胞群体可能是多种细胞生物学实验模型中的基础步骤。本实验方案旨在帮助研究人员实现从小鼠骨髓前体细胞中分离并培养巨噬细胞。来自无病原体级C57BL/6小鼠的骨髓前体细胞在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的作用下可分化为巨噬细胞；本方案中，M-CSF来源于小鼠成纤维细胞系L-929的培养上清液。经过培养后，成熟的巨噬细胞可在第7天起用于后续实验。th 到 10th 天。一只动物可提供约 2 x 107 巨噬细胞。因此，该方案是利用基础细胞培养方法获取大量原代巨噬细胞的理想选择。
引言
单核细胞和巨噬细胞是可来源于骨髓祖细胞的单核吞噬细胞。近期研究表明，巨噬细胞也可起源于卵黄囊来源的红系-髓系祖细胞1无论其来源如何，这些白细胞在稳态和炎症过程中均具有重要的效应功能2,3单核细胞是来自外周血的细胞，可在组织中进一步分化为巨噬细胞2,4而巨噬细胞是具有异质性的细胞，其表型和功能受局部生长因子和细胞因子暴露的调控5由于巨噬细胞具有如此广泛的功能多样性，它们已在多种疾病模型中被广泛研究。因此， 体外 巨噬细胞的培养已成为研究其生理功能及其在不同疾病中作用的重要工具。骨髓是包括巨噬细胞前体在内的多种前体细胞的重要来源，这些前体细胞可被分离并扩增，从而指数级增加所获得的巨噬细胞数量。此外，骨髓来源的巨噬细胞对于避免组织微环境所产生影响尤为重要，因为巨噬细胞在不同组织刺激下会发生表型改变6,7骨髓前体细胞在暴露于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）时可转化为巨噬细胞8骨髓来源的巨噬细胞在组织中无法通过生物化学标志物与单核细胞来源的巨噬细胞相区分。这些细胞代表了一类高度同质的原代细胞群体，在许多其他方面可与腹腔巨噬细胞相比较。6,9.
由于巨噬细胞具有多种多样的细胞功能，长期以来一直是研究人员深入研究的对象。这些细胞可用于多种实验模型，包括感染性和炎症性疾病的研究，因为它们参与了这些病理过程10,11。此外，它们也可用于研究巨噬细胞在不同微环境刺激下发生的极化现象12,13。因此，本文提供了一种简单且可靠的实验方案，旨在从小鼠骨髓中获得大量原代巨噬细胞。
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方案
本方案严格遵循巴西国家动物实验伦理控制委员会（Concea）的规定，并已获得动物伦理与使用委员会（CEUA）的批准。C57BL/6小鼠购自巴西米纳斯吉拉斯联邦大学（UFMG）中央动物房，贝洛奥里藏特市。在本方案所述的所有步骤中，均应穿戴个人防护装备（PPE），如实验服、手套和眼部防护装置。
1. 准备成纤维细胞L-929系上清液作为M-CSF来源
- 解冻L-929成纤维细胞系细胞（美国模式培养物集存库认证细胞系-ATCC CCL1），并立即开始培养以保持细胞活性。
- 在层流生物安全柜中，使用 1,000 µ用移液器将L-929成纤维细胞系细胞从冻存管转移至50 mL无菌离心管中。
- 使用刻度移液管加入 50 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS），不含钙和镁。
- 300 x 离心 g, 4 °离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于 20 mL 的 Dulbecco′s 改良伊格尔′使用血清移液管，将s medium-F12补充10%胎牛血清（FBS）和1 mL青霉素/链霉素（P/S）（DMEM/F12-10）。
- 将重悬的细胞转移至T75细胞培养瓶中。
- 在37℃培养 °C，5% CO2 孵箱中培养至完全汇合。
注意：操作培养瓶时，应避免溶液润湿瓶盖，以免造成污染。为获得足够的上清液，需在细胞铺满培养瓶表面后进行传代培养。L-929细胞具有接触抑制特性。将胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、DMEM/F12-10和无菌PBS预热至37 °C，以启动细胞培养扩增，具体步骤如下。 - 当细胞完全汇合后，在超净台内弃去细胞培养瓶中的上清液。
- 使用移液管吸取20 mL无菌PBS清洗细胞培养瓶，并弃去溶液。
- 向含有贴壁细胞的细胞培养瓶中加入10 mL胰蛋白酶/EDTA（0.05%溶液）。
- 将细胞培养瓶从超净台转移至37°C，5% CO2 孵育箱中孵育3分钟。
- 轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞从培养瓶表面解离，并使用显微镜确认所有细胞均已解离。
- 用10 mL DMEM/F12-10培养基灭活胰蛋白酶/EDTA（0.05%溶液）。
- 使用刻度移液管将溶液转移至50 mL无菌离心管中。
- 300 x g 离心 g 4℃时 °离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于10 mL DMEM/F12-10培养基中。
- 将1 mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中（1:10传代培养）。
- 重复该操作以获得十个 T175 细胞培养瓶。
- 向每个细胞培养瓶中加入50 mL DMEM/F12-10。
- 在37℃培养 °C，5% CO2 孵育箱中孵育至完全汇合。
注意：这些步骤可确保获得 500 mL L-929 细胞上清液。在第 5 天，当细胞覆盖 T175 细胞培养瓶表面后，上清液中将富含 M-CSF，必须收集该上清液14. - 在第5天接触抑制后，从培养箱中取出细胞培养瓶。
- 将培养基转移至50 mL无菌离心管中。
- 3,200 x 离心 g，于4 °10 分钟，4 °C
- 收集富含M-CSF的上清液，将溶液转移至50 mL无菌离心管中。于-20℃冰箱中保存 °C.
注意：离心对于去除上清液中的细胞和碎片至关重要。 - L-929 上清液是获取巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的一种便捷且经济的来源，通常含有 5 至 10 ng/mL 的 M-CSF8这些上清液还含有微量的其他细胞因子和生长因子，但它们对巨噬细胞生理学没有显著影响。15然而，可购买纯化的M-CSF，并以1至2 ng/mL的浓度替代L-929上清液使用。8.
2. 股骨和胫骨的切除
- 根据国家动物实验委员会（Concea）第18号规范决议以及动物伦理与使用委员会（CEUA）的批准，对8周龄C57BL-6野生型雄性小鼠先进行二氧化碳窒息，再通过颈椎脱位实施安乐死。
- 用70%乙醇溶液浸泡小鼠，并使用无菌剪刀沿腹部做1 cm切口。
- 去除皮肤，直至后肢肌肉完全暴露。
- 在髋部水平切除后肢，注意不要折断股骨和胫骨。
- 将后肢放入含有70%乙醇溶液的锥形离心管中。
注意：务必使用无病原体小鼠。为获得更多的细胞，应确保采集双侧后肢。步骤2 在非无菌环境（实验台面）中进行，因此需小心取出股骨和胫骨并保持其完整，以避免细菌污染。本操作的后续步骤均在层流通风生物安全柜中进行。后肢在70%乙醇溶液中的暴露时间应限制在10分钟以内；若时间过长，可能影响骨髓前体细胞。
3. 从胫骨和股骨骨髓腔中获取骨髓前体细胞
- 将腿部从70%乙醇溶液中取出，转移至无菌PBS中。
- 使用镊子和消毒湿巾去除所有肌肉和筋膜。此步骤后骨骼应保持洁净。
- 使用无菌外科手术刀片在骨骼两端切开骨骺，以暴露骨髓。
- 用10 mL含2%青霉素/链霉素溶液的无菌PBS填充20 mL注射器，并连接26 G针头。
- 一手使用解剖镊夹持骨骼，另一手将针头插入骨腔。注意避免镊子压碎骨骼。
- 用PBS冲洗骨腔内部，并将骨髓收集至无菌锥形离心管中。此步骤后，骨腔应呈现白色。
- 将收集的细胞在4 °C条件下以300 × g 离心10分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL DMEM/F12-10培养基中。
- 混匀后加入另外9 mL DMEM/F12-10培养基，使细胞总体积达到10 mL。
4. 巨噬细胞培养
- 将1 mL细胞前体加入每个100 mm × 20 mm圆形塑料培养皿（共10个），用移液器将细胞均匀铺布于培养皿表面。请勿使用经组织培养处理的培养皿。
- 每皿加入9 mL DMEM/F12-10培养基，并补充20% L-929细胞上清液。
- 在37℃培养 °C，5% CO2 培养箱
- 第3天rd 第几天，向每皿中加入10 mL添加了20% L-929细胞上清液的DMEM/F12-10培养基。如此，每皿培养液总量达到20 mL，足以支持细胞生长至成熟末期。
注意：不可使用经组织培养处理的培养皿，因为巨噬细胞作为天然贴壁细胞，与表面具有强相互作用，后续将难以从培养皿上解离。通常，一只小鼠（两根股骨）的细胞前体可接种于10个培养皿中。细胞前体将转化为巨噬细胞，可在培养第7至第10天使用。巨噬细胞成熟的确认依据其形态学变化：成熟巨噬细胞呈贴壁生长，形态具有异质性，表现为向不同方向伸出伪足。代表性结果中展示了此类成熟细胞的示例。
5. 收获巨噬细胞
- 弃去所有培养皿中的上清液。
- 用 10 mL 温热（37 °C）的无菌无 Mg2+ 和 Ca2+ 的 PBS 清洗每个培养皿。
- 弃去每个培养皿中的溶液。
- 将非酶细胞解离液预热至 37 °C，向每个培养皿中加入 3 mL。在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 10 分钟。使用倒置显微镜观察巨噬细胞是否已从培养皿上解离。
注意：使用未经组织培养处理的塑料培养皿应可实现细胞的轻松解离，避免需要刮取细胞。 - 用移液管反复以非酶细胞解离液冲洗培养皿，进行环形运动，以确认所有巨噬细胞均已从培养皿上解离。
- 将所有培养皿中的溶液收集至一个 50 mL 锥形离心管中。
- 向空的培养皿中加入 10 mL 无菌预热的 PBS，按步骤 5.4 操作。此步骤为步骤 5.4 的重复，旨在确保所有巨噬细胞均被收集。
- 在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
- 弃去上清液，用 1 mL DMEM/F12-10 重悬沉淀。使用移液管缓慢轻柔地吹打混匀，避免损伤细胞。
- 取 10 µL 巨噬细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，制备成细胞计数样品，使用血细胞计数板进行细胞计数。
注意：在第 7 天，每个培养皿可产生约 2 × 106 个巨噬细胞。这意味着当使用十块培养板时，一只小鼠可获得约 2 × 107 个原代巨噬细胞。由于 M-CSF 仅促进巨噬细胞的成熟，该方法可确保获得的细胞群体几乎完全为巨噬细胞，且无其他白细胞污染16。
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结果
巨噬细胞是体积较大且具有黏附性的细胞，具有特殊的生理特性。由于能够黏附于玻璃和塑料表面，它们在培养中表现出多种形态特征，其典型的铺展形态与细胞质突起的形成有关（图1）。当骨髓前体细胞暴露于L-929细胞上清液中的M-CSF并开始向成熟巨噬细胞转化时，便会黏附于培养皿表面。
图2展示了骨髓前体细胞向成熟巨噬细胞转化的动力学过程。在第3天，出现少量未成熟巨噬细胞，多数呈现典型的圆形形态，仅有少量膜突起（图3）。尽管细胞在整个过程中持续转化，通常需要7天才能获得足够数量和充分成熟度，以确保本方案达到最高效率。
此外，巨噬细胞是吞噬细胞（macro = 大；phagos = 吞食），能够吞噬大量抗原性或非抗原性颗粒。在表型上，它们的特征是表达表面分子 F4/80 和 CD11b。流式细胞术分析显示，通过本方案获得的巨噬细胞在大小和颗粒度方面具有均一性
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讨论
获得骨髓来源巨噬细胞群体是许多细胞生物学实验模型中的基本步骤，尤其是在需要获得均一的原代细胞群体时尤为重要。如前所述，只有在M-CSF存在的条件下，细胞前体才能分化为巨噬细胞。L-929细胞的上清液可作为M-CSF的主要来源。除成本因素外，直接使用重组M-CSF本身也并无问题8,17。有证据表明，使用重组M-CSF获得的巨噬细胞在培养中具有更好的均一性；然而，在主要巨噬细胞标志物的基因表达和细胞因子产生方面，使用r-M-CSF或L-929上清液并无显著差异15。
骨髓前体细胞非常敏感。为避免污染，必须使用洁净的层流生物安全柜。在本实验方案的初始步骤中，去除骨骼表面的肌肉组织时会产生可能成为污染源的残留物。建议在切割骨骺并暴露骨髓之前，先清洁生物安全柜。一旦前体细胞从骨腔中取出，务必小心操作这些细胞，以保持无菌状态和最佳的细胞活力。
本方案使用 C57BL/6 小鼠...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作得到了米纳斯吉拉斯州研究支持基金会（FAPEMIG）通过米纳斯吉拉斯州人畜传染病研究网络（RED-00313-16）和米纳斯吉拉斯州组织工程与细胞治疗研究网络 - REMETTEC（RED-00570-16）以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20 毫升注射器 | DESCARPACK | SI100S4G | 无菌注射器 |
| 26 号针头 | BD | 497AQDKT7 | 无菌针头 |
| 50 毫升锥形离心管 | SARSTEDT | 62547254 | 适用于离心的塑料锥形管 |
| 70% 乙醇溶液 | EMFAL | 490 | 用于消毒的乙醇溶液 |
| 解剖镊 | 3B SCIENTIFIC | W1670 | 保存于含 70% 乙醇溶液的无菌烧杯中 |
| C57Bl/6 野生型小鼠 | 购自米纳斯吉拉斯联邦大学中央动物房 Biotério Central | 不适用 | 小鼠必须为无特定病原体级，年龄在 6 至 10 周之间。小鼠需至少提前一周安置，以恢复运输带来的应激反应 |
| 细胞培养瓶 T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 培养瓶，斜颈，表面积 75 cm²，带滤膜瓶盖，无 DNase，无 RNase |
| 细胞培养瓶 T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 培养瓶，斜颈，表面积 75 cm²，带滤膜瓶盖，无 DNase，无 RNase |
| 消毒湿巾或婴儿湿巾 | CLOROX | 不适用 | 有助于清洁骨骼 |
| 蒸馏水 | GIBCO | 15230 | 无菌蒸馏水 |
| DMEM/F12-10 | 不适用 | 不适用 | 向 DMEM/F12 中加入 10 mL 胎牛血清（FBS）和 1 mL 青霉素/链霉素（P/S），定容至 100 mL |
| DMEM/F12-10 + L-929 细胞上清液 | 不适用 | 不适用 | 在 DMEM/F12-10 中加入 20% 的 L-929 细胞培养上清液 |
| Dulbecco′s 改良 Eagle′s 培养基 - F12（DMEM/F12） | GIBCO | 12500096 | DMEM/F12 培养基含有 2.5 mM L-谷氨酰胺、15 mM HEPES、0.5 mM 丙酮酸钠和 1200 mg/L 碳酸氢钠。将粉末溶解于 1 升 蒸馏水中，加入 3.7 g 碳酸氢钠。调节 pH 至 7.2，用 0.22 µm 滤膜过滤。储存于 2 - 8 °C 冰箱 |
| 胎牛血清，经认证，热灭活，美国来源（FBS） | GIBCO | 10082147 | 用于 DMEM/F12 培养基的营养补充 |
| 血细胞计数板 | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | 用于显微镜下计数巨噬细胞 |
| L-929 细胞 | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 是一种小鼠成纤维细胞系，用作巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的来源 |
| Nikon TI eclipse | NIKON | 不适用 | Nikon TI Eclipse 是一种荧光与相差显微镜 |
| 非酶细胞解离液 | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | 非酶细胞解离液可在不损伤细胞的情况下将巨噬细胞从培养板上分离 |
| 未经处理的圆形培养皿 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | 请勿使用组织培养处理过的培养皿或任何组织培养处理过的培养板 |
| P3199 青霉素 G 钾盐 | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | 抗生素 |
| 青霉素和链霉素（P/S）溶液 | 使用 0.26 克青霉素和 0.40 克链霉素，与 40 mL 无菌 PBS 混合。在水平层流超净台内，使用 0.22 µm 滤膜过滤，并将 1.0 mL 分装至 1.5 mL 微量离心管中，于 -20°C 冰箱保存 | ||
| 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS） | MEDIATECH | 21-040-CM | 无菌 |
| S7975 硫酸链霉素，650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | 抗生素 |
| 10 mL 或 25 mL 移液管 | SARSTEDT | 861254001 | 移液管用于转移大于 1 mL 的液体体积 |
| 碳酸氢钠 | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | 用于 DMEM/F12 培养基的 pH 调节 |
| Nis Elements Viewer 软件 | NIKON | 不适用 | NIS-Elements Viewer 是一款可免费使用的独立程序，用于查看图像文件和数据集 |
| 含 2% P/S 的无菌 PBS 溶液 | LABORCRIN | 590338 | 在 40 mL 无菌 PBS 中加入 1 mL P/S 溶液 |
| 直剪眼科剪 | KATENA | 不适用 | 保存于含 70% 乙醇溶液的无菌烧杯中 |
| L-929 细胞上清液 | 不适用 | 不适用 | L-929 是一种小鼠成纤维细胞系，用作巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的来源。L-929 上清液通过本实验方案获得 |
| 24 号不锈钢外科手术刀片 | SWANN-MORTON | 311 | 用于暴露骨骼骨骺 |
| 台盼蓝溶液，0.4% | GIBCO | 15250061 | 0.4% 台盼蓝溶液常规用于细胞染色，通过染料排斥法评估细胞活力 |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | GIBCO | 25300-062 | 用于将细胞从培养瓶中解离 |
| 细胞培养用注射用水（WFI） | GIBCO | A12873 | 无菌且无内毒素的水 |
参考文献
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重印与许可
