从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

Summary

本方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞。

Abstract

巨噬细胞在体内平衡和炎症中具有重要的效应功能。这些细胞存在于身体的每个组织中，并且具有根据微环境中存在的刺激改变其轮廓的重要能力。细胞因子能深刻影响巨噬细胞生理学，尤其是IFN-γ和白细胞介素4，分别产生M1型和M2型。由于这些细胞的多功能性，骨髓来源的巨噬细胞群的产生可能是许多细胞生物学实验模型的基本步骤。该协议的目的是帮助研究人员分离和培养源自骨髓祖细胞的巨噬细胞。来自无病原体C57BL / 6小鼠的骨髓祖细胞在暴露于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）时被转化为巨噬细胞，在该方案中，巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）是从小鼠成纤维细胞谱系L-929的上清液中获得的。孵育后，成熟的巨噬细胞可在第7^天 至第10^天使用 。一只动物可以是大约 2 x 10⁷ 个巨噬细胞的来源。因此，它是使用细胞培养的基本方法获得大量原代巨噬细胞的理想方案。

Introduction

单核细胞和巨噬细胞是单核吞噬细胞，可以来源于骨髓中的祖细胞。最近的研究报告称，巨噬细胞也起源于卵黄囊衍生的红髓祖细胞¹。无论它们的衍生性如何，这些白细胞在体内平衡和炎症中具有重要的效应功能 ^2,3。单核细胞是来自外周血的细胞，可以在组织中进一步分化为巨噬细胞 ^2,4，^而巨噬细胞是异质细胞，表现出受生长因子和细胞因子局部暴露调节的表型和功能⁵。由于巨噬细胞表现出这种功能多样性，因此它们已在许多疾病模型中进行了研究。因此，巨噬细胞的体外培养已成为了解其生理学及其在不同疾病中的作用的重要工具。骨髓是祖细胞（包括巨噬细胞祖细胞）的重要来源，巨噬细胞祖细胞可以被分离和繁殖，使获得的巨噬细胞数量呈指数级增加。此外，骨髓来源的巨噬细胞对于避免组织微环境产生的影响尤为重要，因为巨噬细胞会响应组织中的不同刺激而改变其表型 ^6,7。骨髓祖细胞在暴露于巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 后转化为巨噬细胞⁸。骨髓来源的巨噬细胞不能通过组织中的生化标志物与单核细胞来源的巨噬细胞区分开来。这些细胞代表了高度均匀的原代细胞群，在许多其他方面可与腹膜巨噬细胞相媲美 ^6,9。

由于巨噬细胞的细胞功能具有不同性，研究人员长期以来一直对巨噬细胞进行深入研究。这些细胞可用于不同的实验模型，包括感染性和炎症性疾病，因为它们在这些过程中具有特性^10,11。它们还可用于研究巨噬细胞对各种微环境刺激的极化反应^12,13。因此，这里提供了一种简单可靠的方案，用于从小鼠骨髓中获得大量的初级巨噬细胞。

Protocol

该协议是根据国家动物实验控制委员会（Concea）并经动物伦理与使用委员会（CEUA）批准执行的。C57BL / 6小鼠购自巴西贝洛奥里藏特米纳斯吉拉斯联邦大学（UFMG）的Biotério Central。在本协议中描述的所有步骤都应使用个人防护设备 （PPE），例如实验室外套、手套和护目镜。

1. 成纤维细胞L-929谱系上清液作为M-CSF来源的制备

1. 解冻 L-929 成纤维细胞谱系细胞（美国型培养保藏认证细胞系-ATCC CCL1）并立即开始培养过程以保持活力。
2. 在层流生物安全柜中，使用 1,000 μL 移液管，将 L-929 成纤维细胞谱系细胞从小瓶转移到 50 mL 无菌离心管中。
3. 使用血清移液管加入 50 mL 不含钙和镁的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
4. 以300× g，4°C离心10分钟。丢弃上清液。
5. 使用血清学移液管将沉淀重悬于 20 mL 补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1 mL 青霉素/链霉素 （P/S） （DMEM/F12-10） 的 Dulbecco′s 改良的 Eagle 培养基 F12 中。
6. 将重悬的细胞转移到 T75 细胞培养瓶中。
7. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育直至完全汇合。
   注意: 操作烧瓶时，请小心避免用溶液弄湿盖子，因为这可能是污染源。为了获得方便量的上清液，有必要在细胞覆盖细胞培养瓶的整个表面后复制细胞。L-929细胞通过接触被抑制。将热胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，DMEM / F12-10和无菌PBS至37°C，开始细胞培养扩增，如以下步骤所述。
8. 一旦达到完全汇合，就从细胞培养瓶中丢弃上清液，在层流生物安全柜内。
9. 使用血清移液管用 20 mL 无菌 PBS 洗涤细胞培养瓶，并弃去溶液。
10. 将 10 mL 胰蛋白酶/EDTA（0.05% 溶液）加入含有粘附细胞的细胞培养瓶中。
11. 将细胞培养瓶从层流转移到 37°C、5% CO₂ 培养箱中，孵育 3 分钟。
12. 摇晃细胞培养瓶，使细胞从培养瓶表面解离，并使用显微镜确保所有细胞都已解离。
13. 用 10 mL DMEM/F12-10 培养基灭活胰蛋白酶/EDTA（0.05% 溶液）。
14. 使用血清移液管将溶液转移到 50 mL 无菌离心管中。
15. 在4°C下以300× g 离心10分钟。丢弃上清液。
16. 将沉淀重悬于 10 mL DMEM/F12-10 培养基中。
17. 将 1 mL 细胞悬液加入 T175 细胞培养瓶（1:10 培养物）中。
18. 重复该过程以获得 10 个 T175 细胞培养瓶。
19. 向每个细胞培养瓶中加入 50 mL DMEM/F12-10。
20. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育直至完全汇合。
    注:这些步骤保证 500 mL L-929 细胞上清液。在第 5 天，在细胞覆盖 T175 细胞培养瓶表面后，将富集上清液以进行 M-CSF，并且必须收集¹⁴。
21. 在接触抑制后第 5 天从培养箱中取出细胞培养瓶。
22. 将培养基转移到 50 mL 无菌离心管中。
23. 在4°C下以3,200× g离心10分钟。
24. 收集富含 M-CSF 的上清液，并将溶液转移到 50 mL 无菌离心管中。储存在-20°C的冰箱中。
    注意:离心对于从上清液中去除细胞和碎片极为重要。
25. L-929 上清液是一种方便且廉价的巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 来源，通常含有 5 至 10 ng/mL 的 M-CSF⁸。这些上清液还含有微量的其他细胞因子和生长因子，但它们不会对巨噬细胞生理学产生深远影响¹⁵。然而，纯化的 M-CSF 可以购买并用作浓度为 1 至 2 ng/mL 的 L-929 上清液的替代品⁸。

2. 切除股骨和胫骨

1. 根据国家动物实验委员会 （Concea） 第 18 号规范性决议和动物伦理与使用委员会 （CEUA） 的批准，在二氧化碳窒息后通过颈椎脱位对 8 周龄的 C57BL-6 野生型雄性小鼠实施安乐死。
2. 用70%乙醇溶液浸泡小鼠，并使用无菌剪刀沿腹部切开1厘米的切口。
3. 去除皮肤，直到后腿的肌肉完全暴露出来。
4. 在臀部高度移除后腿，注意不要折断股骨和胫骨。
5. 将后腿放入装有70%乙醇溶液的锥形离心管中。
   注意:始终使用无病原体的小鼠。确保收集两条腿以获得更多的细胞数量。步骤2在非无菌环境（台式）中进行。因此，重要的是要小心地切除股骨和胫骨，使它们保持完整，以避免细菌污染。该过程的其余部分在层流生物安全柜中进行。腿暴露于70%乙醇溶液的时间应限制在10分钟以内。如果时间较长，骨髓祖细胞可能会受到影响。

3.从胫骨和股骨的管腔中获取骨髓祖细胞

1. 从70%乙醇溶液中取出腿，并将它们转移到无菌PBS中。
2. 使用镊子和消毒湿巾去除所有肌肉和筋膜。在此步骤之后，骨头应该是干净的。
3. 使用无菌手术刀刀片切开两端的骨骺，露出骨髓。
4. 用 10 mL 无菌 PBS 填充 20 mL 注射器，补充有 2% 青霉素/链霉素溶液，并连接 26 G 针头。
5. 用一只手使用解剖钳握住骨头，另一只手将针头插入骨腔。注意不要用镊子压碎骨头。
6. 用PBS洗掉骨头内部，并将骨髓收集在无菌锥形离心管中。完成此步骤后，骨腔应呈白色。
7. 将收集的细胞在4°C下以300× g 离心10分钟。
8. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL DMEM/F12-10 中。
9. 匀浆并加入另外 9 mL DMEM/F12-10 培养基，使细胞总数达到 10 mL。

4.巨噬细胞培养

1. 向每个 100 mm x 20 mm 圆形塑料培养皿（总共 10 个培养皿）中加入 1 mL 细胞祖细胞，用移液管将细胞分布在板上以获得均匀分布。不要使用经过组织培养处理的培养皿。
2. 向每个培养皿中加入 9 mL 补充有 20% L-929 细胞上清液的 DMEM/F12-10。
3. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育。
4. ^在第 3 天，向每个培养皿中加入 10 mL 补充有 20% L-929 细胞上清液的 DMEM/F12-10 培养基。这样，培养皿现在总共有 20 mL 的培养基，足以满足细胞的生长直到其成熟结束。
   注意:不得使用组织培养处理过的培养皿，因为巨噬细胞作为天然贴壁细胞，其特点是与表面的强烈相互作用，以后不容易从培养皿中解离。通常，可以将一只小鼠（两个股骨）的细胞祖细胞接种在10个培养皿中。细胞祖细胞将转化为巨噬细胞，巨噬细胞可在孵育第 7 至 10 天使用。成熟确认是通过巨噬细胞形态的变化来识别的。成熟的巨噬细胞是粘附的，并表现出异质的形态，这可以通过向不同方向发射伪足来解释。这些成熟细胞的示例显示在代表性结果中。

5. 收获巨噬细胞

1. 从所有培养皿中丢弃上清液。
2. 用10mL温热（37°C）无菌Mg²⁺ 和^Ca2+ 游离PBS洗涤每个培养皿。
3. 丢弃每个培养皿中的溶液。
4. 将非酶促细胞解离溶液预热至37°C，并向每个培养皿中加入3mL。在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育10分钟。使用倒置显微镜观察巨噬细胞是否从培养皿中解离。
   注意:使用未经组织培养处理的塑料板应允许细胞轻松解离，并避免需要将细胞从板上刮下。
5. 使用带有非酶细胞解离溶液的血清移液管一遍又一遍地清洗培养皿，进行圆周运动以确认所有巨噬细胞都已从培养皿中解离。
6. 将所有培养皿的溶液一起收集到锥形 50 mL 离心管中。
7. 将 10 mL 无菌预热的 PBS 添加到空培养皿中，并按照步骤 5.4 进行。该过程是步骤 5.4 的重复，旨在保证收集所有巨噬细胞。
8. 以300× g，4°C离心10分钟。
9. 弃去上清液，用 1 mL DMEM/F12-10 重悬沉淀。使用移液器缓慢而小心地上下均质化，以避免损坏细胞。
10. 制备用 10 μL 台盼蓝稀释的 10 μL 巨噬细胞溶液的等分试样，以使用血细胞计数器对细胞进行计数。
    注意:在第 7 天，每个培养皿将产生大约 2 x 10⁶ 个巨噬细胞。这意味着当在10个平板中收获时，一只小鼠可以产生大约2 x 10⁷ 个原代巨噬细胞。由于 M-CSF 仅驱动巨噬细胞的成熟，因此该程序保证了基本上只是巨噬细胞的细胞群，并且没有其他污染的白细胞¹⁶。

Results

巨噬细胞是具有特殊生理特性的大而贴壁的细胞。由于能够粘附在玻璃和塑料上，它们在培养物中表现出多种形态学表现，并且它们典型的扩散形态与细胞质延伸的发射有关（图1）。一旦骨髓祖细胞暴露于 L-929 细胞上清液的 M-CSF 并开始转化为成熟的巨噬细胞，它们就会粘附在培养皿板上。

图2 显示了骨髓祖细胞向成熟巨噬细胞转化的动力学。在第 3 天，出现一些未成熟的巨噬细胞，大多数表现出典型的圆形形态，几乎没有膜突起（图 3）。尽管它们在整个过程中都会发生变化，但通常需要 7 天才能达到足够的数量和成熟度，以保证当前协议的最大效率。

此外，巨噬细胞是吞噬细胞（macro = large;phagos = eat），能够吞噬大量抗原或非抗原颗粒。从表型上看，它们的特征在于表面分子 F4/80 和 CD11b 的表达。通过流式细胞术的分析表明，通过本方案获得的巨噬...

Discussion

在许多细胞生物学实验模型中，产生骨髓来源的巨噬细胞群体是基本步骤，尤其是当实现原代细胞的均一群体很重要时。如前所述，细胞祖细胞只有在M-CSF存在下才能转化为巨噬细胞。L-929细胞上清液可作为M-CSF的主要来源。除了成本之外，使用重组 M-CSF 本身没有问题 ^8,17。有证据表明，重组 M-CSF 巨噬细胞在培养物中表现出更好的均匀性;然而，使用 r-M-CSF 或 L-929 上清液对主要巨噬细胞标志物的基因表达和细胞因子产生没有任何显着差异¹⁵。

骨髓祖细胞非常易感。为避免污染，使用清洁的层流生物安全罩是必不可少的。在该协议的第一步中，从骨骼表面去除肌肉会产生残留物，这些残留物可能成为污染源。建议在切割骨骺和露出骨髓之前清洁引擎盖。一旦祖细胞从骨腔中取出，重要的是要记住小心处理这些细胞，以保持无菌和最佳活力。

C57BL / 6小鼠用于该协议，但BALB...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 cc 注射器	DESCARPACK	SI100S4G	无菌注射器
26-G 针头	BD	497AQDKT7	无菌针头
50 ml 锥形离心管	SARSTEDT	62547254	适用于离心的塑料锥形管
70% 乙醇溶液	EMFAL	490	用于消毒的乙醇溶液
解剖学解剖镊子	3B SCIENTIFIC	W1670	保存在含有 70% 乙醇溶液
C57Bl/6 野生型小鼠	购自 Bioté米纳斯吉拉斯联邦大学 rio Central	不适用	小鼠必须无特异性病原体，年龄在 6 至 10 周之间。小鼠需要至少提前一周入住，以便从运输应激中恢复
细胞培养瓶 T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 培养瓶，斜颈，表面积 75 cm2，带过滤盖，无 DNase，无 RNase
培养瓶 T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 培养瓶，斜颈，表面积 75 cm2，带过滤盖，无 DNase， 不含 RNase
消毒湿巾还是婴儿湿巾？	CLOROX	不适用	有助于清洁骨骼
蒸馏水	GIBCO	15230	无菌蒸馏水
DMEM/F12-10	不适用	不适用 不	将 10 mL 胎牛血清 （FBS） 和 1 mL 青霉素/链霉素 （P/S） 添加到 DMEM/F12 中（q.s.p. 100 mL）
DMEM/F12-10 + L-929 细胞上清液	不适用	适用	加入 20% 的 L929 细胞上清液，在 DMEM/F-12-10
Dulbecco&prime 上培养;s 改良 Eagle′s 培养基 - F12 （DMEM/F12）	GIBCO	12500096	DMEM：F-12 培养基含有 2.5 mM L-谷氨酰胺、15 mM HEPES、0.5 mM 丙酮酸钠和 1200 mg/L 碳酸氢钠。将粉末重悬到 1 升 蒸馏水中，并加入 3,7 克碳酸氢钠。将 pH 值调节至 7.2 并用 0.22 &μM. 过滤。储存在 2 - 8 °C 冷冻胎
血清，认证，热灭活，美国 （FBS）	GIBCO	10082147	DMEM-F12
血球计数板	SIGMA-ALDRICH	Z359629	用于显微镜下巨噬细胞计数
L-929 细胞	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 是小鼠成纤维细胞谱系，用作巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF）
的来源尼康 TI eclipse	尼康	不适用	尼康TI Eclipse是一种荧光和相差显微镜
非酶细胞解离溶液	CELLSTRIPER （CORNING）	25-056-CI	非酶细胞解离溶液 从板中去除巨噬细胞而不损坏它们
未经处理的圆形培养皿 100 × 20–mm	康宁	CLS430591	不要使用经组织培养处理的培养皿或任何经组织培养处理的平板
P3199 青霉素 G 钾盐	USBIO	113-98-4	抗生素
青霉素和链霉素 （P/S） 溶液			使用 0,26 克青霉素和 0,40 克链霉素。与 40 mL 无菌 PBS 混合。在水平层流柜内，使用 0,22 µM 过滤并将 1.0 mL 等分试样储存在冰箱中的 1.5 ml 微量离心管中（-20°;C）
不含钙和镁 （PBS） 的磷酸盐缓冲盐水MEDIATECH		21-040-CM	无菌
S7975 硫酸链霉素，650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	抗生素
10 mL 或 25 mL	SARSTEDT	861254001	血清移液管 使用体积高于 1 mL
碳酸氢钠	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	DMEM-F12 软件的 pH 校正
Nis Elements Viewer	康	不适用	NIS-Elements Viewer 是一个免费的独立程序，用于查看图像文件和数据集
无菌 PBS 和 2% 的 P/S 溶液	LABORCRIN 590338		在 40 mL 无菌 PBS 中加入 1 mL P/S
直虹膜剪刀	KATENA	不适用	保存在含有 70% 乙醇溶液的无菌烧杯中
L-929 细胞的上清液	不适用	不适用	L-929 是小鼠成纤维细胞的一个谱系，用作巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 的来源。L-929 上清液从方案中获得
手术刀刀片 No.24 不锈钢	SWANN-MORTON	311	用于暴露骨骼骨骺
台盼蓝溶液，0.4%	GIBCO	15250061	台盼蓝溶液，0.4%，通常用作细胞染色剂，使用染料排斥试验胰
蛋白酶/EDTA 溶液 0,05%	GIBCO	25300-062	评估细胞活力用于从培养瓶中解离细胞
细胞培养的注射用水 （WFI）	GIBCO	A12873	无菌和无内毒素的水