Summary
Denne protokol skitserer et in vitro-migrationseksperiment, der er egnet til funktionel analyse af molekylerne involveret i in vivo-migration af neurale kamceller til den hyaluronanrige ekstracellulære matrix.
Abstract
Neurale kamceller (NCC'er) er stærkt vandrende celler, der stammer fra rygområdet i neuralrøret. Udvandringen af NCC'er fra neuralrøret er en vigtig proces for NCC-produktionen og deres efterfølgende migrering mod målsteder. NCC'ernes migrationsrute, herunder det omgivende neuralrørsvæv, involverer hyaluronan (HA)-rig ekstracellulær matrix. For at modellere NCC-migration til disse HA-rige omgivende væv fra neuralrøret blev der i dette studie etableret et blandet substratmigrationsassay bestående af HA (gennemsnitlig molekylvægt: 1.200-1.400 kDa) og kollagen type I (Col1). Dette migrationsassay viser, at NCC-cellelinje, O9-1, celler er stærkt vandrende på det blandede substrat, og at HA-belægningen nedbrydes på stedet for fokale adhæsioner i løbet af migrationen. Denne in vitro-model kan være nyttig til yderligere udforskning af det mekanistiske grundlag, der er involveret i NCC-migration. Denne protokol er også anvendelig til evaluering af forskellige substrater som stilladser for at studere NCC-migration.
Introduction
Neurale kamceller (NCC'er) er en multipotent cellepopulation, der er til stede i udviklende embryoner, og de stammer fra den neurale pladegrænse under neurulering. De bidrager til dannelsen af en række væv, herunder det perifere nervesystem, kardiovaskulære system, kraniofaciale væv og skelet1. Efter induktion og NCC-specifikation ved neurale pladegrænsen emigrerer NCC'er fra neuroepitelet og migrerer mod NCC-afledte vævssteder1.
Hyaluronan (HA) er en ikke-sulfateret glycosaminoglycan, der fordeles i en række væv som en komponent i den ekstracellulære matrix (ECM). Betydningen af HA i embryoudvikling er blevet demonstreret i modelsystemer gennem ablation af gener, der er ansvarlige for hyaluronan metabolisme. For eksempel viste mutationer i hyaluronansyntase gener (Has1 og Has2) i Xenopus sig at føre til NCC-migrationsdefekter og kraniofacial misdannelse2. Derudover er det rapporteret, at de HA-bindende proteoglycaner, aggrecan og versican, udøver hæmmende virkninger på NCC-migration3. Hos mus fører Has2-ablation til alvorlige defekter i dannelsen af endokardiepuder, hvilket resulterer i dødelighed 4,5,6 midt i drægtigheden (E9.5-10).
Transmembranprotein 2 (Tmem2), en celleoverfladehyaluronidase, har for nylig vist sig at spille en kritisk rolle i at fremme integrinmedieret kræftcelleadhæsion og migration ved at fjerne matrixassocieret HA på vedhæftningsstederne 7,8. For nylig viste Inubushi et al.9, at en mangel på Tmem2 fører til alvorlige kraniofaciale defekter på grund af abnormiteter i NCC emigration / migration og overlevelse. I den tidligere undersøgelse9 blev Tmem2-ekspression analyseret under NCC-dannelse og migration. Tmem2-ekspression blev observeret på stedet for NCC-delaminering og i emigrerende Sox9-positive NCC'er (figur 1). Derudover viste undersøgelsen ved hjælp af Tmem2-depleterede O9-1 neurale kamceller i mus, at in vitro-ekspressionen af Tmem2 var afgørende for, at O9-1-cellerne kunne danne fokale adhæsioner og for deres migration til HA-holdige substrater (figur 2 og figur 3)9.
Disse resultater indikerer kraftigt, at Tmem2 også er vigtig for NCC's vedhæftning og migration gennem den HA-rige ECM. Den molekylære mekanisme for NCC-adhæsion og migration inden for den HA-rige ECM er dog stadig uklar. Det er derfor nødvendigt at etablere et in vitro-dyrkningseksperimentelt system for fuldt ud at udforske NCC-adhæsion og migration inden for det HA-rige ECM.
Af de mange tilgange, der anvendes til test af cellemigration, er cellesårlukningsbaseret assay en simpel metode, der ofte anvendes inden for fysiologi og onkologi10. Denne tilgang er nyttig på grund af dens relevans for in vivo-fænotypen og er effektiv til at bestemme stoffers og kemoattractants roller under cellemigration11. Det er muligt at evaluere migrationsevnen for både hele cellemasser og individuelle celler ved at måle cellegabafstandene over tid11. I dette manuskript introduceres et modificeret in vitro sårlukningsbaseret assay for at modellere NCC-migration til HA-rige væv omkring neuralrøret. Denne procedure er også anvendelig til undersøgelse af forskellige ECM-komponenter (dvs. kollagener, fibronectin og laminin) for at analysere ECM-stilladsets rolle i NCC-migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Animal Ethics Committee ved Osaka University Graduate School of Dentistry.
1. Kultur af musekraniale neurale kamceller
BEMÆRK: Den neurale kamcellelinje, der anvendes i denne undersøgelse, omfatter O9-1-celler, oprindeligt afledt af Wnt1-Cre; R26R-GFP-ekspressive celler isoleret fra E8.5 museembryoner12 (se diskussion). Metoden beskrevet her til dyrkning af O9-1-celler følger en tidligere etableret protokol13.
- Forbered kældermembranmatrixbelagt plade.
- Optø kældermembranmatrixen (se materialetabel) på is. Matricen fortyndes 1:50 i afkølet 1x PBS, og den opbevares på is.
- Overtræk en 10 cm kulturplade med 10 ml af den fortyndede kældermembranmatrixopløsning. Inkuber pladen ved stuetemperatur i 1 time, og aspirer matrixen før brug.
- Pladen vaskes 3x med 2 ml PBS.
- Kultur O9-1-celler på kældermembranmatrixbelagt plade.
- Hele det embryonale stamcellemedium (ES) (se materialetabellen) opvarmes i vandbad ved 37 °C.
- Bland forsigtigt O9-1-cellesuspensionen (se materialetabellen), og tæl antallet af celler ved hjælp af en automatiseret celletæller (se materialetabellen). Juster cellekoncentrationen til 1,1 × 106/ml med komplet ES-cellemedium.
- Der tilsættes 8 ml forvarmet komplet ES-cellemedium til den matrixbelagte 10 cm dyrkningsplade, og O9-1-cellerne frøs ved 1,1 x 106 celler pr. plade. Der inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
- Næste dag udskiftes substratet med friskt, komplet ES-cellemedium (forvarmet til 37 °C). Udskift med frisk medium hver 2-3 dage derefter.
BEMÆRK: Når cellerne er ca. 80% sammenflydende (3-4 dage efter plettering), kan de adskilles med 0,25% trypsin-EDTA og føres videre eller fryses til senere brug. Repræsentative billeder af O9-1-celler er vist i figur 1. - Kulturpladen vaskes med 2 ml 1x PBS før trypsinisering. Tilsæt 2 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA og inkuber i 5 minutter ved 37 °C. Kontroller for fuldstændig cellefrigørelse; Bank forsigtigt på siden af pladen et par gange, hvis det er nødvendigt.
- Der tilsættes 2 ml forvarmet komplet ES-cellemedium til dyrkningspladen, og de dissocierede celler overføres til et 15 ml konisk rør. Centrifuger glasset ved 300 x g i 5 min.
- Supernatanten kasseres uden at forstyrre cellepelletsen. Derefter tilsættes 2 ml forvarmet komplet ES-cellemedium til røret, og cellerne resuspenderes grundigt ved pipettering. Frø cellerne på en ny kulturplade ved den ønskede celletæthed.
- Alternativt fremstilles en frossen cellestamme ved at tilsætte 1 ml cellefrysemedium indeholdende 10% dimethylsulfoxid (DMSO) til røret i stedet for komplet ES-cellemedium og grundigt resuspendere cellerne. Cellesuspensionen overføres til kryorør, og opbevares ved -80 °C.
2. Tilberedning af den HA/Col1-belagte skål
BEMÆRK: Den oprindelige metode til belægning af HA/Col1 på tallerkener med glasbund blev foreslået af Irie et al.7.
- Tilsæt forsigtigt 50 μL ufortyndet triethoxysilan til en 3,5 cm skål med glasbund (se materialetabel). Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) og beskyt mod lys.
BEMÆRK: Inkubationen med triethoxysilan bør ikke overstige 5 min. Dette kan påvirke belægningseffektiviteten og producere uønskede produkter. - Vask fadet hurtigt 3x med 2 ml destilleret vand. Tilsæt 50 μL 0,25% glutaraldehyd, fortyndet 100x i PBS pr. skål, og inkuber ved RT i 30 minutter.
- Vask hurtigt 4x med 2 ml PBS. Overtræk derefter opvasken med 300 μL kollagen type I i 0,2 N eddikesyre ved RT i 1 time.
- Vask hurtigt 3x med 2 ml PBS. Der tilsættes 300 μL 200 μg/ml fluoresceinaminmærket natriumhyaluronat-H2 (FAHA-H2) (fortyndet i PBS) til hver skål og inkuberes natten over ved RT. Der vaskes igen 3x med 2 ml PBS. Efter opsugning af PBS lufttørres pladen i 5 minutter på en ren bænk.
BEMÆRK: FAHA-H2 er et fluoresceinaminmærket natriumhyaluronat med en gennemsnitlig molekylvægt fra 1.200-1.600 KDa. HA med en passende molekylvægt kan anvendes i henhold til forskningsdesignet.
3. Migrationsanalyse på den HA/Col1-belagte parabol
BEMÆRK: Et sårlukningsbaseret assay med definerede 500 μm cellefrie huller i Col1/HA-substrater blev udført ved hjælp af 2-brønds kulturindsatser (se materialetabel). O9-1-cellerne udtrykker Tmem2, som er nødvendig for vedhæftning og nedbrydning af HA i det ekstracellulære rum9 (figur 2 og figur 3).
- Efter tørring af den belagte glasbundsskål fastgøres kulturindsatserne med 2 brønde til opvasken, og indsatserne fyldes udvendigt med 1 ml PBS.
- Frø O9-1-cellerne i brøndene ved 1 x 104 celler i 100 μL af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) pr. Indsats. Cellerne dyrkes i 2 dage ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
- Fjern indsatserne forsigtigt fra de belagte glasbundede fade med pincet. Vask de belagte glasbundede tallerkener forsigtigt med 2 ml 1x PBS for at fjerne cellerne og celleresterne. Tilsæt 2 ml frisk DMEM indeholdende 2% FBS i kulturretterne.
- Tag fasekontrastbilleder nu som starttidspunkt ved hjælp af et alt-i-et-fluorescensmikroskop i monokrom tilstand med indstillinger i høj opløsning (forstærkning ved 6 dB, ingen binning). Objektivlinser med forstørrelser på 4x til 20x blev brugt til billeddannelse i denne undersøgelse (se materialetabel).
BEMÆRK: Tag fasekontrastbillederne med de tilsvarende skalabjælker, og gem dem i TIFF-format. - Cellerne dyrkes i yderligere 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Tag fasekontrastbilleder ved 24 timer og 48 timer i kultur ved hjælp af alt-i-et-fluorescensmikroskopet.
- Cellerne fikseres ved 48 timer med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Vask derefter opvasken 3x i 5 minutter hver med 1 ml frisk PBS.
- Anbring en dæksel med monteringsmedium (se materialetabel) til yderligere morfologisk observation.
BEMÆRK: Opvasken kan fotograferes med det samme eller opbevares i op til 2 måneder ved 4 °C. - Valgfrit: Immunmærk cellerne for proteiner af interesse.
BEMÆRK: En protokol til påvisning af det fokale adhæsionskompleks (FA) ved hjælp af et museafledt monoklonalt antivinculinantistof (se materialetabel) er beskrevet her som et eksempel.- Opvasken inkuberes (fra trin 3.6) med 0,5 ml blokerende buffer (5% normalt gedeserum i PBS) i 60 min.
BEMÆRK: Vælg en passende blokerende buffer til det primære antistof. En typisk blokerende buffer ville være 5% normalt serum fra samme art som det anvendte sekundære antistof. - Forbered det fortyndede primære antistof i antistoffortyndingsbuffer (1% normalt gedeserum i PBS). Opvasken inkuberes med 0,5 ml fortyndet primært antistof natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Vælg den passende antistoffortyndingsbuffer. Antistoffet anvendes typisk ved en 1:50-1:200 fortynding. - Skyl 3x i 5 minutter hver med 2 ml PBS. Forbered det fortyndede gedeafledte sekundære antistof mod mus i antistoffortyndingsbufferen (1% normalt gedeserum i PBS). Inkuber opvasken med 0,5 ml fortyndet sekundært antistof i 1-3 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det sekundære antistof anvendes typisk ved en 1:500-1:1.000 fortynding. DAPI kan bruges til farvning af kernerne. - Skyl 3x med 2 ml PBS i 5 min hver gang. Anbring dækselen med 50 μL monteringsmedium.
BEMÆRK: Opvasken kan afbildes ved hjælp af alt-i-et-fluorescensmikroskopet med et GFP-filter (excitation: 470/40, emission: 525/50) og et TexasRed-filter (excitation: 560/40, emission: 630/75) i monokrom tilstand med højopløsningsindstillinger (forstærkning ved 6 dB, ingen binning). Objektivlinser med forstørrelser på 4x til 20x blev brugt til billeddannelsen i denne undersøgelse.
BEMÆRK: Objektglasset kan opbevares i op til 2 måneder ved 4 °C.
- Opvasken inkuberes (fra trin 3.6) med 0,5 ml blokerende buffer (5% normalt gedeserum i PBS) i 60 min.
4. Analyse af data
- Åbn ImageJ 1.51s-softwaren. I vinduet ImageJ skal du vælge Filer > Åbn på menulinjen for at åbne den gemte billedfil.
- For at indstille måleskalaen skal du tegne en linje med samme afstand som skalabjælken. Gå til Analysér > Indstil skala, og skriv den kendte afstand og enheder for linjen i de relevante felter i vinduet Indstil skala .
- Tegn en lige linje mellem cellegabet, og tryk på Analysér > Mål for at overføre værdierne til et datavindue. Der måles mindst fem forskellige positioner i hver prøve, og afstandene beregnes som gennemsnit for at opnå repræsentative prøvedata. Udfør de statistiske analyser ved hjælp af passende software (se Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et migrationsassay blev udført på blandede substrater sammensat af Col1 og HA med høj molekylvægt (gennemsnitlig molekylvægt: 1.200-1.400 kDa) under anvendelse af protokollen beskrevet her. O9-1-celler ved grænsen af hullet viste sig let at migrere ind i det HA-rige hul (figur 4). Immunfarvning for en FA-markør, vinculin14, bekræftede, at O9-1-cellerne dannede fokale adhæsioner (FA'er) på stederne for HA-nedbrydning (figur 5).
Figur 1: TMEM2-udtryk i NCC'er. Tværsnit af neuralrøret i Tmem2-FLAG KI-embryoner ved E9.0. (A) Sektioner på kranie- og trunkniveau i neuralrøret blev dobbeltmærket for TMEM2-FLAG-proteinet og HA. TMEM2-ekspression blev observeret i neuralpladen og grænseområdet i neuralrøret (fyldte pilespidser), mens disse steder var blottet for HA-farvning (åbne pilespidser). (B) Dobbeltmærkning af neurale kamceller for TMEM2-FLAG og Sox9. Tværsnit af E9.0 neuralrøret blev farvet til TMEM2-FLAG og Sox9. Sox9-positive præmigrerende og emigrerende NCC'er ved kanten af neuralrøret udtrykte TMEM2 med høj densitet. Forkortelse: nt = neuralrør. Skalastænger: (A) 300 μm; B) 100 μm. Tilpasset med tilladelse fra Inubushi et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nedbrydning af HA med TMEM2 i O9-1-celler. (A) Repræsentative billeder af Tmem2-depleterede og kontrol-O9-1-celler dyrket på en almindelig kulturskål (til venstre). (B) Ekspression af Tmem2 i disse celler blev evalueret af qPCR, med Gapdh som en intern kontrol for normalisering (søjlediagram). Midler ± SD (n = 5) vises som vandrette bjælker. p < 0,001 ved uparret elevs t-test. Skalastang, 5,0 μm. (C) Cellebaseret hyaluronidase-analyse. Tmem2-depleterede og kontrol-O9-1-celler blev dyrket i 48 timer på glasdæksler belagt med fluoresceineret HA (FA-HA). HA-nedbrydende aktivitet afsløres som mørke områder i den fluorescerende baggrund. Niveauet af HA-nedbrydning blev også kvantitativt sammenlignet mellem Tmem2-depleterede og kontrol-O9-1-celler som beskrevet i Materialer og metoder (bargraf). Data repræsenterer gennemsnit ± SD af fluorescensintensiteten under en celle i forhold til den i det cellefrie område (n > 50 celler pr. tilstand samlet fra tre uafhængige eksperimenter). p < 0,001 ved uparret elevs t-test. Vedtaget med tilladelse fra Inubushi et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Nedbrydning af substratbundet HA ved FA'er i O9-1-celler. Cellebaserede hyaluronidase-assays blev udført i 16 timer, og celler blev farvet for vinculin. I kontrol O9-1-celler forekommer HA-nedbrydning i vinkulin-positive FA'er. I Tmem2-depleterede O9-1-celler reduceres HA-nedbrydning og FA-dannelse kraftigt. Antallet af FA'er pr. celle blev kvantitativt sammenlignet mellem Tmem2-depleterede og kontrol-O9-1-celler (søjlediagram). Data repræsenterer gennemsnit ± SD (n >30 celler pr. tilstand samlet fra tre uafhængige eksperimenter). p < 0,001 ved uparret elevs t-test. Vedtaget med tilladelse fra Inubushi et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative billeder af O9-1-cellemigration til et cellefrit hul på blandede Col1/HA-substrater. (A) Toppanelet viser hullerne ved eksperimentets start (dag 0). De nederste paneler viser mellemrumsbilleder efter 24 timer (dag 1) eller 48 timer (dag 2) inkubation. Skalabjælke = 150 μm. (B) Et søjlediagram, der viser den kvantitative analyse af cellemigration. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige SD ± for det gapområde, der dækkes af migrerende celler i forhold til arealet af det oprindelige hul (n = 5 pr. Tilstand). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ved uparret elevs t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Nedbrydning af HA i de blandede Col1/HA-substrater ved FA'er i O9-1-celler. O9-1-celler dyrket på blandede substrater bestående af Col1/HA blev immunmærket med anti-vinculin-antistof (rødt). De mørke pletter/striber repræsenterer HA-nedbrydningsaktivitet i FAHA-H2-substratet (grøn). Stederne for HA-nedbrydning og fokale adhæsioner (vinculin) blev co-lokaliseret på de blandede substrater (pilespidser). Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige ECM-komponenter regulerer NCC's udvandring/migration. For eksempel regulerer HA positivt NCC-migration 2,15. Interessant nok belyste et studie baseret på genetiske musemodeller af Tmem2, en celleoverfladehyaluronidase, behovet for HA-nedbrydning ved NCC-migration9. Kollagener er også rigelige i ECM omkring neuralrøret16. Decorin, en lille leucinrig proteoglycan, har vist sig at regulere NCC-migration under neural udvikling17. Andre ECM-komponenter, herunder laminin og fibronectin, påvirker NCC-adhæsion og migration18. ECM-komponenternes specifikke rolle i NCC-migreringen er dog stadig ukendte.
Den her beskrevne in vitro-model har til formål at undersøge adfærden hos migrerende NCC'er, der møder HA-rig ECM. Vi valgte 2D, snarere end 3D, substrater på grund af vanskelighederne med at forberede sammensatte kollagen-HA-geler med ensartede geleringsegenskaber. I et 2D-kultursystem er de rumlige gradienter af de opløselige faktorkoncentrationer og stivhederne af de ekstracellulære matrixsubstrater forskellige fra dem af levende væv19. Fra dette synspunkt har et 3D-kultursystem store fordele og kan give dybere indsigt i cellemigrationsmekanismer20,21. I denne sammenhæng foretrækkes opsætning af et 3D-analysesystem, hvis det er relevant. Denne in vitro eksperimentelle model kan anvendes til at undersøge NCC's migrationsadfærd som reaktion på varierende ECM-komponenter. Dette ville muliggøre en bedre forståelse af det mekanistiske grundlag for NCC-migration, som styrer embryomorfogenese.
O9-1-cellerne, der blev brugt i denne undersøgelse, udtrykker stabilt stamcellemarkører (CD44, Sca-1 og Bmi1) og neurale kammarkører (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 og Itgb1). Under ikke-differentierende dyrkningsbetingelser opretholder O9-1-celler multipotente stamcellelignende egenskaber. O9-1-celler har potentialet til at differentiere sig til flere celletyper, herunder osteoblaster, chondrocytter, glatte muskelceller og gliaceller under specifikke dyrkningsbetingelser12. Derfor er O9-1-celler et nyttigt værktøj til at undersøge de molekylære egenskaber ved kranial NCC-migration og differentiering. Ikke desto mindre vil brugen af primære NCC'er (f.eks. fra embryonale neuralrør fra kyllinger eller mus) i stedet for O9-1-celler give mere detaljerede data for at lette en bedre forståelse af karakteren af NCC-migration.
I den sårlukningsbaserede migrationsanalyse vil NCC også sprede sig, og stigningen i celleantallet vil også bidrage til udvidelsen af cellepopulationen til gapområdet22. For at minimere spredningen under sårhelingsanalyse er serumsult den mest almindelige metode i stedet for at bruge farmakologiske midler23. Imidlertid bør virkningerne af serumsult testes i hver celletype.
Det mest kritiske trin i denne protokol er at tilføje den kovalente belægning af HA til glasbundsskålene. Glasoverfladebehandling med silanreagenser anvendes til analyse af fokale adhæsioner til ECM-substrater24. Triethoxysilan er en organosiliciumforbindelse, der indeholder mange frie aminogrupper, der kan binde til frie hydroxylgrupper på silicaglasoverflader25. En teknik blev udviklet og optimeret i denne undersøgelse til at producere et tyndt, stabilt silanlag på en silicaglasoverflade ved hjælp af triethoxysilan. Aminen i den triethoxysilanbelagte glasoverflade kan binde carboxylgrupperne på HA og følgelig kemisk immobilisere HA på glasoverfladen8. Med denne metode er det imidlertid ikke muligt at binde andre proteinbaserede ECM-substrater til glasoverfladen. Derfor blev glutaraldehyd brugt her til kemisk immobilisering af type I-kollagen gennem aminkobling til aldehydet. Især kan utilstrækkelig HA-belægning føre til fjernelse af HA-belægningen, selv uden enzymatisk fordøjelse (f.eks. ved påvirkning af mekanisk kraft under celleadhæsion og migration). Belægning med ECM-substrater i stedet for kollagen type I er mulig, forudsat at substraterne har amingrupper. Der kan dog være begrænsninger i kovalent belægning af ECM på glasbundede skåle på grund af substratets kemiske egenskaber; Således kan forsøg og fejl være påkrævet.
Selvom det ikke er en perfekt model til at efterligne NCC-migration til den HA-rige ECM, der omgiver neuralrøret, kan dette in vitro-migrationseksperiment være nyttigt til funktionel analyse af molekylerne involveret i in vivo NCC-migration. Derudover kan dette in vitro-assay være nyttigt til terapeutisk lægemiddelscreening for at fremskynde eller forhindre HA-nedbrydning samt migration af andre celletyper, herunder hudfibroblaster og keratinocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Jeg udtrykker stor anerkendelse til Fumitoshi Irie og Yu Yamaguchi for deres opmuntring og venlige forslag til etablering af denne metode. Dette arbejde blev støttet af tilskud til videnskabelige forskningsprogrammer fra Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 til T.I., #20H03896 til T.I.). Den oprindelige metode til belægning af HA på glassubstrater og in situ HA-nedbrydningsassays på substraterne blev beskrevet i Yamamoto et al. (2017)8, mens metoden til fremstilling af HA/Col1 blandede substrater blev beskrevet i Irie et al. (2021)7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
