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监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

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DOI：

10.3791/64846

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2023年6月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL), 2Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, University of Utah, 4University of Lausanne (UNIL)

本文内容

摘要

斑马鱼靶向反应性亲电体和氧化剂（Z-REX）是一种基于化学生物学的方法，用于研究反应性小分子信号传导。该技术可应用于不同发育阶段的活体斑马鱼。在此，我们将斑马鱼中的标准检测方法与Z-REX相结合，用于信号通路分析。

摘要

活性代谢物及相关亲电性药物是研究中最难处理的小分子之一。传统方法通过向实验样本大量施加特定活性物质，以解析此类分子的作用机制（MOA）。在这种方法中，亲电物的高反应活性会导致蛋白质组发生非选择性的标记，且该过程具有时间和环境依赖性；同时，氧化还原敏感的蛋白质和过程也可能受到间接且通常不可逆的影响。在存在大量潜在靶点和间接次级效应的背景下，将表型变化与特定靶点结合直接关联起来仍是一项复杂任务。斑马鱼靶向活性亲电物与氧化剂系统（Z-REX）是一种可在幼年斑马鱼中按需释放活性亲电物的递送平台，旨在将亲电物精准递送至活体斑马鱼胚胎中特定的目标蛋白（POI），同时保持生物体其他系统的未受干扰状态。该技术的关键特性包括侵入性极低，并可实现剂量、化学类型以及时空上的精确控制。因此，结合一系列独特的对照手段，该技术可避免在动物整体暴露于活性亲电物或具有多效性作用的亲电性药物时常见的脱靶效应和系统性毒性。利用Z-REX，研究人员能够在完整活体动物接近生理条件的情况下，建立研究基础，以阐明特定活性配体与特定POI结合后，个体应激反应和信号输出如何发生改变。

引言

大量的细胞信号传导事件涉及小分子活性物质（在细胞内源性产生或外源性物质/异源代谢物，如药物）与其靶蛋白之间的反应。在许多情况下，此类共价结合事件即使在亚化学计量水平下也能触发细胞反应，从而导致发育、代谢、凋亡和/或免疫反应等方面的变化1。然而，将特定的结合事件与其表型后果相联系以解析其作用机制（MOA）已被证明具有挑战性。传统的脉冲式给药方法通常需要引入高浓度的活性物质，这往往会导致大量蛋白质被修饰，并对模式生物产生过度毒性2。此类条件远非理想。为解决这些问题，已开发出一种在天然细胞环境中实现精确定位递送亲电试剂的方法，称为T-REX（可靶向反应性亲电试剂与氧化剂）3。在此之后的数年中，研究重点已转向整体生物体实验，从而能够在非转化细胞中特定的细胞环境下研究蛋白质功能。因此，我们已将该技术拓展至多种模型系统，包括斑马鱼（Danio rerio）胚胎模型。本文中，我们介绍Z-REX（斑马鱼可靶向反应性亲电试剂与氧化剂）（图1）。

为了理解Z-REX，本文首先介绍REX技术及其基本原理。这些技术的核心在于通过模拟天然亲电分子的局部生成方式，来模拟内源性生理活性亲电物种（RES）的信号传导过程。 体内 以时空精确的方式进行。目的蛋白（POI）被表达为与Halo标签融合的构建体；Halo标签以1:1的化学计量比锚定一种组织通透性良好且惰性的探针，该探针携带光笼型活性脂质过氧化物（RES）。一种典型的内源性RES是4-羟基壬烯醛（下文简称HNE），其被光笼化于探针Ht-PreHNE中。在多数情况下，我们使用一种带有炔基修饰的HNE版本［即HNE(炔基)］，其生物学性质与HNE基本相同，但可通过点击化学进行标记。该探针同时带有氯代烷基以实现与Halo标签的共价结合，称为Ht-PreHNE(炔基)。Halo-POI融合蛋白与该探针形成的复合物可在紫外光照射下，将释放的RES递送至融合的POI附近。若POI能迅速与释放的RES发生反应，则POI会被RES共价标记，从而使得我们能够鉴定出具有动力学优势的半胱氨酸残基。

Z-REX 采用了上述 REX 技术的优点，并将其广泛应用于活体鱼类中特定信号通路的研究。该方案已针对斑马鱼（D. rerio）进行了优化，因为它们是遗传操作便利的脊椎动物，在发育过程中具有透明性，因此非常适合应用于 REX 等光化学/光遗传学技术。然而，由于该方法的广泛适用性源于脂质来源的亲电试剂（LDE）递送的伪分子内机制，类似的策略也可能在其他遗传操作便利的鱼类物种中有效。事实上，该方法具有高度的生物相容性，鱼类可在至少 48 小时内接受 Z-REX 光笼化亲电试剂 [例如 Ht-PreHNE(alkyne)] 处理，而对发育无任何明显影响。类似方案已在 C. elegans4,5 中成功应用。

本方案首先描述了在受精后1-1.5天（dpf）的斑马鱼胚胎模型中，通过mRNA注射实现外源Halo-POI融合蛋白的瞬时表达。这种方法可在斑马鱼大多数细胞中表达异位蛋白（下文称为“泛在性”表达），而非局限于特定组织或部位；然而，实验数据表明在某些情况下仍可观察到细胞类型特异性的效应。注射后，胚胎在低浓度探针[0.3–5 µM Ht-PreHNE(alkyne)]中孵育，直至受精后30.5小时（hpf）。随后，在用户设定的时间点，通过2-5分钟的光解反应将反应性效应分子（RES）递送至鱼体内的靶蛋白（POI）。光解释放RES后，可在接下来的2-10小时内开展多种下游表型分析：1）报告基因品系的活体成像（图2A）；2）通过蛋白质印迹法评估靶标标记效果（图3）；3）转录组分析（图4）；或4）整体免疫荧光染色（图5）。

以报告基因系的活体成像为例，Z-REX 与 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:eGFP) 鱼系的活体成像联用，用于检测对特定亲电性传感器靶蛋白（即 Keap1）进行可逆共价修饰（RES）后，中性粒细胞和巨噬细胞水平分别降低的情况，且在鱼类中未观察到对其他细胞的明显影响。然而，我们此前已证明，通过 Z-REX 技术可重现 T-REX 研究中靶蛋白标记及其下游信号通路的激活效果，适用于多种蛋白，包括 Akt36、Keap17 和 Ube2v26。总体而言，利用 Z-REX，科研人员可在多种复杂的氧化还原通路背景下，研究靶蛋白（POI）经由可逆共价修饰（RES）后所产生的生物学效应。该技术有助于在更具生理相关性的整体动物模型中，精确定位共价药物设计的靶点及其功能关键残基，并揭示新型药物的作用机制。

方案

在美国康奈尔大学进行的斑马鱼饲养和操作程序遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指南，并经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。在瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL，瑞士）斑马鱼单元进行的斑马鱼饲养和操作程序遵循《动物福利法》SR 455 和《动物福利条例》SR 455.1，并获得州级兽医授权 VD-H23。

注意：本方案中使用表达 Halo-TeV-Keap1 的 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:EGFP) 鱼系来演示 Z-REX 技术。该方法可扩展应用于其他目标蛋白、转基因报告鱼系以及下游生物学检测。有关本研究中使用的缓冲液，请参见补充表 1。所有试剂、仪器、设备、抗体、质粒、斑马鱼品系均列于材料表中。

1. mRNA 准备

  1. 使用 mMessage mMachine SP6 体外转录试剂盒制备 Halo-TeV-Keap1-2xHA 和 Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA。
    注意：按照制造商说明书操作，每种 mRNA 进行 40 µL 规模的反应。将 mRNA 沉淀重新溶解于 10 µL 无核酸酶水中。
  2. 通过微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估 mRNA 质量并测定浓度。高质量的 mRNA 其 A260/A280 比值应接近或高于 2.0。
  3. 用无核酸酶水将 mRNA 稀释至 1–1.5 mg/mL。
  4. 将 mRNA 溶液分装（每管 1–2 µL），并于 -80 °C 保存。

2. 产生鱼胚胎

  1. 选项1：制备野生型（WT）鱼胚胎。
    1. 在10个独立的鱼缸中设置10对交配鱼，每个鱼缸中用隔板将雄鱼和雌鱼分开。
      注意：通常10对交配鱼可提供足量的胚胎用于实验。可根据实验设计/需求以及亲代鱼的繁殖力调整交配对的数量。
    2. 设置好显微注射装置后的第二天早晨，移除其中5个鱼缸中的隔板，等待30分钟让鱼进行交配。
    3. 将亲代鱼转移至另一个鱼缸，通过滤网过滤鱼缸水收集胚胎，然后将滤网中的胚胎冲洗至一个10 cm的培养皿中。这些胚胎将用于第一轮显微注射。
      注意：若某一批次的卵质量较差（例如因蛋白质聚集导致卵呈不透明状），请勿将其与其他胚胎混合。
    4. （可选）对另外5个鱼缸参照步骤2.1.2–2.1.3进行类似操作，以获得下一轮注射所需的胚胎。
      注意：为尽量减少胚胎之间的年龄差异，最好仅进行一轮注射。然而，若所需胚胎数量超过单次注射所能处理的数量，建议进行两轮注射，以确保在mRNA注射时所有胚胎均处于1–4细胞期。注射轮次可根据操作者的注射熟练程度和实验设计进行调整。但建议整个操作过程（从移除第一个隔板到最后一个胚胎注射完成）在2小时内完成。胚胎间过大的年龄差异可能影响实验结果的可靠性和可重复性。
  2. 选项2：制备杂合型转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼胚胎。
    1. 在10个独立的鱼缸中设置10对交配鱼，每个鱼缸中用隔板将雄鱼和雌鱼分开：野生型（WT）鱼与Tg(lyz:TagRFP)鱼交配，或野生型鱼与Tg(mpeg1:eGFP)鱼交配。
      注意： 应避免杂合型转基因鱼之间的相互交配，因为纯合型报告鱼的荧光信号强于杂合型鱼，可能影响下游荧光读数结果。在成像时，转基因报告鱼系与野生型胚胎易于区分。同一批次中同时存在野生型和杂合型胚胎并无影响。lyz:TagRFP标记中性粒细胞，mpeg1:eGFP标记巨噬细胞。本方案也可适用于其他报告鱼系。
    2. 参照步骤2.1.2–2.1.4进行操作。

3. 显微注射仪设置

  1. 打开气源，将背压设置为 0.2–0.5 psi，注射压力设置为 25–30 psi。所示压力范围通常为推荐值。
    注意：必须保持稳定的背压，以防止鱼培养基倒流进入针头。在步骤 3.8 中校准注射体积时，仅可调整注射时间。后续步骤中不得更改注射压力；注射压力过低可能导致因表面张力和界面张力导致注射失败，而压力过高则可能损伤胚胎。
  2. 使用 RNase 去污染溶液清洁设备和注射平台。
    注意：降解 mRNA 的 RNase 可能来源于操作者或设备。实验前必须进行清洁处理，并佩戴手套。
  3. （可选）若需共注射 mRNA 和吗啉寡核苷酸（morpholino），请先在 0.2 mL 离心管中将两者预混。
    注意：Z-REX 实验中使用 Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA 溶液，其浓度为 250–1500 ng/µL 时效果良好。多种吗啉寡核苷酸已在斑马鱼中应用，其最佳浓度已有报道7。若使用序列未发表的吗啉寡核苷酸，操作者应先评估其毒性及基因敲低效率，再用于 Z-REX 实验。
  4. 使用微量移液器吸头将 1–2 µL mRNA（及适用时的吗啉寡核苷酸7）转移至注射针中。
    注意：若使用 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪制备注射针，建议设置参数如下：加热值：520 单位；拉力：60 单位；速度：70 单位；延迟：155 单位；气压：550 单位；斜坡：530 单位。
  5. 将注射针安装至显微注射操纵器上。
    注意：气源提供的背压应能将 mRNA（/吗啉寡核苷酸）溶液推至针尖。
  6. 使用尖头镊子或刀片轻折针尖，形成适合注射的开口。
  7. 将针尖浸入载有矿物油的镜台测微尺中。
  8. 施加两到三次注射脉冲，以排除针尖内的气泡。
  9. 通过调整注射时间，将液滴体积校准至 2 nL。
    ​注意：最佳方法是将液滴注射至血细胞计数板上的矿物油中（矿物油的黏度可模拟卵黄囊环境）。在显微镜下利用血细胞计数板的网格估算注射形成的液滴大小，并相应调整注射时间。尽管有时会使用酚红染料，但在本实验所述的 mRNA 注射流程中，尚未发现使用酚红的必要性。

4. 显微注射

  1. 用新鲜的10% Hank's平衡盐溶液（HBSS）培养基填充注射板，并用钝头镊子将胚胎排列在板的凹槽中。
    注意：注射板由含10% HBSS培养基的2%琼脂糖制成，凹槽使用塑料模具形成。
  2. 将针尖浸入注射板中的10% HBSS培养基内。
  3. 施加两到三次注射脉冲，以去除针尖内的气泡。
  4. 每次注射时，以单次动作穿透胚胎的绒毛膜和卵黄囊，并施加一次注射脉冲。注射后可在卵黄囊内立即观察到一小团球状液体，该球状区域会相对较快地消散。对其他胚胎重复此步骤，直至获得足够数量的注射胚胎。
    注意：胚胎（包括注射和未注射的）存活率通常在50%–90%之间。建议每组对照或实验组注射所需数量两倍的胚胎。在生物素pull-down实验中，每种条件下需要100–140个存活胚胎；在qRT-PCR实验中，每种条件下建议使用5个存活胚胎。活体成像和整体免疫荧光染色实验的样本量由使用者自行决定；建议每种条件至少保留20个存活胚胎，以确保分析时具有良好的统计效力。
  5. 将注射后的胚胎冲洗至另一个含有新鲜10% HBSS培养基的10 cm培养皿中。
    注意：可使用冲洗瓶轻松将胚胎从凹槽中冲洗出来。
  6. 将未注射的胚胎收集到另一块培养板中。
    ​注意：未注射的胚胎可根据需要作为鱼类健康状况、基础蛋白表达水平、背景荧光水平等的质量对照。若注射操作顺利，且注射的mRNA/吗啉代寡核苷酸对胚胎无致死性，则注射组与未注射组胚胎的存活率应相近。

5. Z-REX

  1. 根据实验设计（即对照组/实验组的数量），将显微注射后的胚胎分配至10 cm培养皿中。
  2. 在红光照明的暗室中，更换培养基为30 mL含10% HBSS的溶液，可选择性添加或不添加1 µM Ht-PreHNE(alkyne)。
    注意：Ht-PreHNE(alkyne)为光敏性化合物，后续步骤中胚胎应始终保持避光状态。
  3. 将胚胎置于28.5 °C避光条件下孵育。
  4. 在受精后30.5小时（30.5 hpf），于暗室中更换培养基为新鲜的30 mL 10% HBSS。
    注意：更换培养基时应尽可能彻底移除旧培养基，此步骤对清除胚胎中未结合或过量的Ht-PreHNE(alkyne)至关重要。
  5. 将胚胎在28.5 °C避光条件下继续孵育30分钟。
  6. 重复步骤5.4–5.5，共再进行两次。
  7. 开启紫外灯（365 nm，3 mW/cm2）预热5分钟。
    注意：此预热步骤必须在执行步骤5.8前完成。紫外灯在刚开启的最初几分钟内输出功率较低且不稳定，应定期使用紫外光强计测量其实际功率。
  8. 在受精后32小时（32 hpf），对胚胎进行紫外光照射。
    1. 方案一：若后续检测包括活体鱼类成像、整体免疫荧光染色、凝胶内荧光分析（与Cy5叠氮化物进行点击偶联）、RNA-seq或qRT-PCR等，将胚胎暴露于紫外光下3分钟，每隔30秒轻轻摇动培养皿。
    2. 方案二：若后续检测为生物素下拉实验（biotin pull-down assay），将胚胎暴露于紫外光下，照射时间最长不超过5分钟（最短不少于3分钟），每隔30秒摇动培养皿一次，并在照射结束后将培养皿置于冰上冷却1分钟。
      ​注意：若使用其他探针，需根据所用光笼型亲电探针及光源的光解半衰期（t1/2）优化光照时间。t1/2photouncaging可通过已知方法测定8。对于Ht-PreHNE(alkyne)，其t1/2 < 1分钟3，因此上述推荐时间已足够。

6. 下游实验

  1. 选项1：表型分析。转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告基因的活体成像
    ​鱼类品系 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:eGFP)（图2）
    1. 将胚胎在4 °C下孵育10分钟以进行麻醉。
      注：建议每种实验条件至少准备20个存活胚胎。
    2. 从培养板中移除未受精或已死亡的胚胎。
      注：未受精或已死亡的胚胎呈浑浊或不透明状，可通过肉眼识别。若观察到较高的死亡率，请回溯检查注射操作过程，或尝试降低mRNA或吗啉代寡核苷酸的浓度。
    3. 使用尖头镊子去除胚胎的绒毛膜。用一对镊子夹住绒毛膜，避免接触幼鱼本身，再用另一对镊子撕开绒毛膜。胚胎较为脆弱，在去膜过程中仅可接触绒毛膜。
      注：初学者在去膜过程中常会损伤部分胚胎。因此，应始终准备比最低需求更多的胚胎。
    4. 将胚胎固定于2%琼脂糖板（使用10% HBSS培养基制备），并用体视显微镜（明场及相应的荧光通道）对胚胎进行成像（图2A、C、G）。
      注：在Z-REX处理（Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA注射联合Ht-PreHNE(alkyne)处理）后，中性粒细胞（lyz:TagRFP）数量减少最显著的时间点为36 hpf（Z-REX后4小时），而巨噬细胞（mpeg1:eGFP）数量减少最显著的时间点为34 hpf（Z-REX后2小时）（图2E,F）。 若使用不同的报告基因品系、mRNA/吗啉代寡核苷酸或探针，可选择其他时间点。曝光时间及/或增益需优化，以实现对单个细胞或特定（超）微结构的清晰可视化。
    5. 使用ImageJ（NIH）软件统计每条鱼的中性粒细胞/巨噬细胞数量（图2B、D-F、H）。在ImageJ中使用自由选择工具圈选整条鱼，并使用寻找最大值功能计数荧光细胞。
  2. 选项2：靶标标记评估。生物素叠氮化物点击偶联与生物素拉下实验（图3）
    1. 将胚胎在4 °C下孵育进行麻醉，通常需要10分钟。
      注：为获得足够的鱼体裂解液，每种实验条件需准备100–140个存活胚胎。
    2. 从培养板中移除未受精或已死亡的胚胎。
    3. 进行去膜和去卵黄操作。用一对尖头镊子夹住绒毛膜，另一对镊子刺穿卵黄囊，随后在去除绒毛膜的同时分离卵黄囊，使卵黄蛋白释放出来。
      注：此步骤中彻底去除卵黄蛋白至关重要，因样本中大量存在的卵黄蛋白会干扰后续分析。
    4. 将去卵黄的胚胎转移至1.5 mL离心管中。
      注：轻轻旋转培养板使去卵黄胚胎集中于底部，便于收集。较轻的绒毛膜碎片在此过程中被自然分离。
    5. 待胚胎沉降至管底后，吸除上清液，并加入1 mL预冷的HEPES缓冲盐溶液（pH 7.6）。
    6. 重复步骤6.2.5两次。
    7. （可选）若不立即进行下一步操作，可吸除缓冲液，将样品在液氮中速冻，并于-80 °C保存。
      注：去卵黄的鱼体沉淀物可在液氮中速冻并储存在-80 °C。速冻样品可在-80 °C保存最多两周。
    8. 用裂解缓冲液重悬鱼体沉淀物。
      注：裂解缓冲液（pH 7.6）包含50 mM HEPES、100 mM NaCl、1% Triton X-100、0.3 mM TCEP、2倍罗氏cOmplete Mini无EDTA蛋白酶抑制剂以及0.1 mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂。每条胚胎可获得约2 µg裂解液。每120个胚胎使用100 µL裂解缓冲液。两种罗氏cOmplete Mini无EDTA蛋白酶抑制剂和大豆胰蛋白酶抑制剂应在使用前加入裂解缓冲液。
    9. 向离心管中加入体积比为20%的氧化锆珠。
    10. 涡旋20秒，在液氮中速冻，然后在37 °C水浴中解冻。
    11. 重复步骤6.2.10两次。
    12. 在4 °C下以21,000 x g离心10分钟。
    13. 将上清液转移至新的预冷1.5 mL离心管中。
    14. 通过Bradford法测定蛋白浓度。
    15. 将裂解液稀释至1 mg/mL。
    16. 针对每种实验条件，将170 µg裂解液转移至2 mL离心管中。
    17. 将步骤6.2.16所得裂解液与0.2 mg/mL TeV蛋白酶(S219V)混合，并在37 °C孵育30分钟。
      注：对于未使用TeV蛋白酶处理的组别，仅需将裂解液与等体积的裂解缓冲液混合，以匹配其他组中使用的TeV蛋白酶溶液体积。
    18. 配制生物素-叠氮化物点击反应的10倍母液：10% w/v SDS、10 mM CuSO4、1 mM Cu(TBTA)、1 mM生物素-叠氮化物和20 mM TCEP。
      注：TCEP应在步骤6.2.19前立即加入混合液中。
    19. 向步骤6.2.17所得（经TeV蛋白酶消化的）裂解液中加入8.5 µL t-BuOH和17 µL 10倍点击反应母液。涡旋混匀、短暂离心后，在37 °C孵育15分钟。
    20. 向溶液中再加入1 mM TCEP，再次涡旋、离心，并在37 °C继续孵育15分钟。步骤6.2.19至6.2.20的总孵育时间为30分钟。
      注：补充TCEP（一种用于生成Cu(I)的还原剂）可提高点击反应效率。
    21. 向每管中加入600 µL -20 °C乙醇，涡旋混匀后于-80 °C过夜孵育。
      注：样品可在-80 °C保存1周；否则应立即进行下一步操作。
    22. 在4 °C下以21,000 x g离心1小时。
      注：离心后应在管底形成沉淀，此即为目标组分。
    23. 吸除上清液，加入1 mL -20 °C乙醇，涡旋混匀后在4 °C下以21,000 x g离心10分钟。
    24. 重复步骤6.2.23。
    25. 吸除上清液，加入1 mL -20 °C丙酮，涡旋混匀后在4 °C下以21,000 x g离心10分钟。
    26. 吸除上清液，让残余丙酮部分挥发，但不要完全干燥。
    27. 用100 µL重悬缓冲液（含8% w/v十二烷基硫酸锂[LDS]、1 mM EDTA的50 mM HEPES盐溶液，pH 7.6）重悬沉淀物，涡旋15秒，并超声处理至沉淀完全溶解。
    28. 在室温（RT）下以21,000 x g离心5分钟。
    29. 将上清液转移至新的2 mL离心管中，并加入1.5 mL 50 mM HEPES盐溶液（pH 7.6）。
      注：此步骤中LDS的最终浓度为0.5%。较高的LDS浓度可能削弱拉下效率。尽管提高LDS浓度有助于减少非特异性结合，但也可能降低拉下效率。因此，建议在此步骤中不要改变LDS浓度。
    30. 收集"输入"样品（图3）：将30 µL 1 mg/mL裂解液转移至新的1.5 mL离心管中，加入10 µL含6% β-巯基乙醇（BME）的4倍Laemmli上样缓冲液。将溶液速冻后于-80 °C保存。
    31. 将100 µL床体积的高容量链霉亲和素树脂转移至新的2 mL离心管中。加入1 mL含0.5% LDS的50 mM HEPES盐溶液（pH 7.6），在室温下以1,500 x g离心2分钟，吸除上清液。再用1 mL含0.5% LDS的50 mM HEPES盐溶液（pH 7.6）重复洗涤一次。
    32. 将步骤6.2.29所得溶液转移至步骤6.2.31中已预洗的高容量链霉亲和素树脂管中，在室温下于翻转混合仪上孵育4–6小时。
    33. 在室温下以1,500 x g离心2分钟，取30 µL上清液，与10 µL含6% BME的4倍Laemmli上样缓冲液混合，作为"穿流"样品。然后吸除剩余上清液。
      注："穿流"样品可通过Western blot分析以检测链霉亲和素拉下效率。尽可能彻底去除上清液以洗去未结合蛋白至关重要。首先使用P-1000移液器吸除大部分上清液，再使用带凝胶加样头的P-20移液器吸除残留上清液。
    34. 向树脂中加入1 mL含0.5% LDS的50 mM HEPES盐溶液（pH 7.6），在室温下翻转孵育30分钟。
    35. 在室温下以1,500 x g离心2分钟，吸除上清液。
      注：通常0.5% LDS足以去除大多数非特异性结合蛋白。若后续分析中仍观察到非特异性信号，可适当提高洗涤缓冲液中的LDS浓度。
    36. 重复步骤6.2.34至6.2.35两次。
    37. 向树脂中加入40 µL含6% BME的2倍Laemmli上样缓冲液。
    38. 在98 °C孵育5分钟以洗脱结合的蛋白。
    39. 在室温下以21,000 x g离心5分钟，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。此即为"洗脱"样品。
      注：直接将含有树脂的步骤6.2.38溶液上样至凝胶可能影响SDS-PAGE分析结果。
    40. 每孔上样20 µL，加载至10孔10%聚丙烯酰胺凝胶中进行凝胶电泳。
      注：开始时以较低电压（120 V）运行，待染料前沿进入分离胶后改为170 V。当染料前沿跑出凝胶时停止电泳。
    41. 使用抗HA、抗Halo或其他检测管家蛋白的抗体进行Western blot分析（图3）。
  3. 选项3：转录组分析。RNA-seq与qRT-PCR（图4）
    注：强烈建议在15分钟内产下的胚胎用于本实验。胚胎间的年龄差异会显著影响实验结果。
    1. Z-REX处理2小时后，将胚胎在4 °C下孵育10分钟进行麻醉。
    2. 使用尖头镊子进行去膜操作（步骤6.1.3）。
    3. （可选）若需分别分析不同部位，可用镊子进行解剖分割（例如将头部与尾部分离）。
    4. 若从整条胚胎提取RNA，将3–5个胚胎转移至1.5 mL离心管中；若从头部或尾部提取RNA，则将10–12个解剖后的组织段转移至1.5 mL离心管中。
      注：建议实验设置3–5个生物学重复。
    5. 向离心管中加入1 mL TRIzol试剂和玻璃珠。
      注：研究发现，玻璃珠在RNA提取中效果优于氧化锆珠。
    6. 涡旋混合30秒。
      注：若不立即进行下一步操作，溶液可在-80 °C保存1–3周。
    7. 根据制造商说明书提取RNA。
    8. 使用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量和浓度。
      注：高质量RNA的A260/A280比值应接近或高于2.0。
    9. 可将RNA送测序，或取1 µg RNA用扩增级DNase I处理，再使用Superscript III逆转录酶和oligo-(dT)20进行逆转录。此步骤请依照制造商说明书操作。
    10. 进行qRT-PCR，并采用ΔΔCT法分析数据9（图4B–D）。
  4. 选项4：目标蛋白表达与共定位分析。整体免疫荧光染色实验（图5）
    注：经甲醛固定的胚胎较为脆弱，应避免剧烈震荡，小心操作。
    1. 按照步骤6.1.1–6.1.3对胚胎进行去膜处理。
    2. 将胚胎转移至1.5 mL离心管中。
      注：每管应含有相同数量的胚胎，且不超过40个。
    3. 待胚胎沉降至管底后，吸除上清液，并加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.6）。
    4. 再重复步骤6.4.3一次。
    5. 吸除上清液，加入1 mL含4%甲醛的PBS溶液（pH 7.6），在4 °C下轻柔摇动过夜孵育。
      注：甲醛溶液中的样品可在4 °C保存1周。
    6. 吸除上清液，加入1 mL -20 °C甲醇，在-20 °C侧放孵育至少18小时。
      注：样品可在-20 °C保存一个月或更长时间。
    7. 吸除上清液，加入1 mL PDT缓冲液（含0.3% v/v Triton X-100、0.1% v/v Tween-20和1% v/v二甲基亚砜[DMSO]的PBS缓冲液）。
    8. 重复步骤6.4.7，并在室温下轻柔摇动孵育30分钟。
    9. 吸除上清液，加入1 mL封闭缓冲液（含10% v/v热灭活胎牛血清[FBS]、2% w/v牛血清白蛋白[BSA]和0.1% v/v Tween-20的PBS缓冲液），在室温下轻柔摇动孵育1小时。
    10. 吸除上清液，加入200 µL一抗溶液（用封闭缓冲液稀释）。
    11. 吸除上清液，加入500 µL一抗溶液（用封闭缓冲液稀释），在4 °C下轻柔摇动过夜孵育。
      注：若使用新的一抗，建议设置部分不加一抗的样品作为阴性对照。但理想情况下，使用吗啉代寡核苷酸敲低、基因编辑敲除或目标蛋白表达被激活的胚胎，是验证抗体特异性的更可靠方法。
    12. 吸除上清液，加入1 mL PDT缓冲液，在室温下轻柔摇动孵育30分钟。
    13. 重复步骤6.4.12。
    14. 吸除上清液，加入1 mL封闭缓冲液，在室温下轻柔摇动孵育1小时。
      注：自此步骤起，样品应避光处理，以防二抗偶联的荧光染料发生光漂白。
    15. 吸除上清液，加入200 µL二抗溶液（用封闭缓冲液稀释）。
    16. 吸除上清液，加入500 µL二抗溶液（用封闭缓冲液稀释），在室温下轻柔摇动孵育1.5小时。
    17. 吸除上清液，加入1 mL PDT缓冲液，在室温下轻柔摇动孵育30分钟。
    18. 重复步骤6.4.17。
    19. 将胚胎固定于2%琼脂糖板（使用PBS，pH 7.6制备），并用体视显微镜（明场及相应荧光通道）进行成像（图5A、B、D、F）。
      注：若使用Leica M165 FC荧光体视显微镜，建议使用25倍放大倍数以获得高分辨率图像。
    20. 使用ImageJ（NIH）软件定量/分析荧光信号强度。在ImageJ中使用自由选择工具对感兴趣区域内的信号进行定量。

结果

经 Z-REX 处理的转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:EGFP) 的活体成像。通过 Keap1 的 HNE 化修饰诱导中性粒细胞/巨噬细胞凋亡。（另见 图 2）。通过向来自 Tg(lyz:TagRFP) 或 Tg(mpeg1:EGFP) 的杂合转基因胚胎注射编码 Halo-Keap1 的 mRNA，随后用 Ht-PreHNE(alkyne) 处理，评估 Keap1 亲电标记对中性粒细胞和巨噬细胞水平的影响。按照步骤 6.1 的下游检测方案选项 1 操作，释放 HNE(alkyne) 并实现对 Keap1 的标记。分别通过活体成像观察报告基因品系 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:eGFP) 来评估中性粒细胞和巨噬细胞的水平。在 Z-REX 处理后（HNE 递送至 Keap1），两类细胞的数量均减少了 30%–40%。相反，在 Z-REX 技术对照组中（无光照且无 Ht-PreHNE(alkyne)、仅光照、或仅 Ht-PreHNE(alkyne)）未观察到中性粒细胞或巨噬细胞的减少（图 1D 和 图 2A–D）。

中性粒细胞/巨噬细胞凋亡的诱导表明，通过 Z-REX 将 HNE 成功递送至 Keap1。有关通路分析及凋亡机制的详细信息已有发表5。为排除 HNE(alkyne) 的脱靶效应，设置了多个对照组。（1）在相同实验条件下，胚胎注射 Halo-P2A-Keap1 mRNA 代替 Halo-TeV-Keap1 mRNA。P2A 连接肽使 Halo 与 Keap1 蛋白独立表达。在此情况下，Halo 释放的 HNE(alkyne) 无法标记 Keap1，因其不再与 Halo 相邻（图 1D）；因此，未触发凋亡信号通路。该组中未观察到巨噬细胞或中性粒细胞水平的变化（图 2A、B）。（2）使用编码 Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) 的 mRNA 进行相同实验，该 Keap1 突变体对 HNE(alkyne) 不产生响应（图 1D）。该组中亦未观察到巨噬细胞或中性粒细胞水平的变化（图 2G、H）。

生物素叠氮化物点击偶联与生物素下拉实验。靶向标记效果评估。（另见图3）。靶向标记效果评估使用野生型胚胎进行，胚胎中注射了编码Halo-TeV-Keap1-2xHA（Halo-POI融合构建体）或Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA（P2A分体构建体，其中Halo与Keap1未融合；图1D）的mRNA。仅在表达融合蛋白并经Z-REX处理的组别中成功下拉出标记的Keap1蛋白（上图抗HA印迹的第二泳道），而在其他对照组（未注射mRNA、融合构建体未加Z-REX处理、或P2A分体构建体）中均未检测到。结果表明，HNE(alkyne)已成功递送至Keap1，修饰后的Keap1通过点击化学反应与生物素共价连接，随后生物素标记的Keap1被链霉亲和素树脂有效下拉。

转录分析。RNA-seq 与 qRT-PCR。（另见图4）。Z-REX处理后的转录变化通过RNA-seq和qRT-PCR进行评估。在RNA-seq中，多个免疫相关基因在Z-REX处理后表达下调。相反，许多抗氧化反应（AR）相关基因表达上调，这是由于Keap1发生HNE化修饰后激活了Keap1-Nrf2-AR通路所致10（图4A）。在qRT-PCR分析中，检测三个免疫相关基因（lyz、mpeg1.1 和 coro1a）时也获得了类似结果（图4B）。相应基因的上调与下调表明，由Keap1 HNE化介导的信号通路成功被激活。

整体免疫荧光染色实验及共定位分析。（另见图5）。通过整体免疫荧光（IF）染色检测外源表达的Halo-TeV-Keap1-2xHA和Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA（图5A、B）。P2A分裂构建体的HA标签数量是TeV融合构建体的两倍，因此在注射P2A分裂构建体mRNA的组中，抗HA信号强度约为另一组的两倍，表明两种构建体的表达水平相似（图5C）。使用抗Halo抗体检测时，Halo-TeV-Keap1（wt）与Halo-TeV-Keap1（C151S,C273W,C288E）的表达水平也相似（图5D、E）。通过抗RFP与抗活化型Caspase 3共免疫染色，在Z-REX处理的Tg(lyz:TagRFP)胚胎中观察到中性粒细胞与活化型Caspase 3的共定位（图5F）。活化型Caspase 3是细胞凋亡事件的标志物。

斑马鱼-REX 示意图；mRNA 微注射、光触发标记、转录组学分析。
图 1：Z-REX 工作流程。（A, B）在 1–4 细胞期的斑马鱼胚胎中注射编码 Halo-POI（例如 Halo-Keap1）的 mRNA（及吗啉寡聚物）。注射后的胚胎用一种探针处理，该探针由 HaloTag 配体和连接炔基官能团的光笼型亲电物组成，如图 B 中的 Ht-PreHNE(alkyne)。去除过量探针后，将胚胎暴露于光照下，以释放目标亲电物［例如 HNE 或其类似物 HNE(alkyne)］。下游分析在设定的/用户自定义的时间点进行。（C）Ht-PreLDE 探针的设计与作用机制，该探针可适用于多种脂质来源的亲电物（LDE）。（D）Z-REX 的阴性/技术对照组。请点击此处查看该图的放大版本。

在Z-REX下对斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞进行活体成像及追踪，ANOVA图示分析。
图2：对经 Z-REX 处理的转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼进行活体成像。 Z-REX介导的Keap1 HNE化修饰诱导中性粒细胞/巨噬细胞凋亡。A代表性图像 Tg(lyz:TagRFP) 表达Halo-TeV-Keap1（融合构建体）或Halo-P2A-Keap1（分裂构建体）的斑马鱼胚胎，在阴性对照条件下处理（无处理、仅光照、仅Ht-PreHNE(alkyne)或Z-REX）。胚胎年龄：36 hpf。B中性粒细胞水平的定量分析 A. (C代表性图像 Tg(mpeg1:eGFP) 表达Halo-TeV-Keap1的斑马鱼，经或未经Z-REX处理。胚胎年龄：34 hpf。D巨噬细胞水平的定量分析 C. (E，F) 时间过程测量（E）中性粒细胞和（F) Z-REX 处理后巨噬细胞水平。 (G) 与图中所示实验类似的实验 A 在表达 Halo-TeV-Keap1（WT）或 Halo-TeV-Keap1（C151S, C273W, C288E）（一种不具备HNE感应能力的突变体）的鱼类中。H) 中性粒细胞水平的定量分析 G比例尺： 500 µm所有图表均以均值 ± 标准误（SEM）表示。 p 使用单因素方差分析（蓝色）和双尾学生t检验（黑色）计算数值。该图已根据Poganik等人修改。7. 请点击此处以查看此图的放大版本。

链霉亲和素下拉、蛋白质相互作用示意图；Keap1-Halo 检测、印迹分析、TEV 切割。
图 3：生物素下拉实验。 表达 Halo-TeV-Keap1-2XHA 或 Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA 的野生型胚胎经 Z-REX 处理或相应的阴性对照条件（本实验中为无探针处理）处理。收集胚胎后进行裂解，并在进行生物素下拉实验前用 TEV 蛋白酶处理。结果通过蛋白质印迹分析。该图改编自 Huang 等. Z-REX：引导反应性亲电体靶向特异性或广泛表达的蛋白质，并记录幼鱼中由亲电体诱导的功能性氧化还原反应。该图改编自 Huang 等.11。请点击此处查看该图的放大版本。

火山图和条形图显示Z-REX处理后免疫反应相关基因表达的变化。
图4转录分析 (AZ-REX处理与未处理胚胎的RNA-seq结果。具有统计学显著差异表达（SDE）的基因已标出。免疫相关SDE基因以红色标注，抗氧化反应（AR）相关基因以绿色标注，其他SDE基因以蓝色标注。全部 p 数值使用 CuffDiff 计算得出。B-D) 三个与免疫相关的 SDE 基因 A: (B) lyz, (C) mpeg1.1，以及（D) coro1a 进一步通过qRT-PCR进行分析，仅Z-REX处理的胚胎显示出这些转录本的抑制。所有图表均以均值±标准误（SEM）表示。 p 数值通过单因素方差分析（蓝色）和双尾 Student t 检验（黑色）计算得出。该图改编自 Poganik 等人。7. 请点击此处以查看此图的放大版本。

整体免疫荧光成像；斑马鱼；HaloTag；AlexaFluor；蛋白质表达分析。
图5全组织免疫荧光染色实验 (A，B) 表达以下任一物质的胚胎代表性图像（A) Halo-TeV-Keap1-2xHA 或 (BHalo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA 经抗 HA 抗体及 AlexaFluor568 标记的二抗免疫染色。将 mRNA 注射鱼类与同龄未注射鱼类进行比较。C) 流感血凝素（HA）抗体信号的定量分析A，B). (D) 表达 Halo-TeV-Keap1（WT）或 Halo-TeV-Keap1（C151S, C273W, C288E）的胚胎经抗 Halo 抗体及 AlexaFluor647 标记的二抗免疫染色后的代表性图像。将 mRNA 注射的斑马鱼与同龄未注射的斑马鱼进行比较。E) 抗Halo信号的定量分析 D. p 采用双尾 Student's t 检验计算值。 (F) Tg(lyz:TagRFP) 经Z-REX处理的胚胎用抗RFP抗体和抗活化Caspase 3抗体进行共免疫染色，并孵育相应的荧光标记二抗。白色方框标示放大区域。白色箭头指示中性粒细胞与活化Caspase 3的共定位。比例尺： 500 µm所有图表均以均值 ± 标准误（SEM）表示。此图改编自 Poganik 等。7。以及 Huang 等人.11. 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充表 1：本研究中使用的缓冲液列表。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案中描述的Z-REX技术为在活体鱼类中研究亲电分子-靶点配对及信号通路解析提供了一种可靠的策略。通过邻近导向递送，可实现对亲电化合物处理的剂量和空间控制。与传统一次性大剂量给药方法不同，传统方法中使用的超生理浓度亲电分子常导致脱靶效应，而Z-REX系统仅向体系释放微量亲电分子，因而基本无创。我们在斑马鱼胚胎中使用了0.1–6 µM的Ht-PreHNE(alkyne)，结果表明该处理对胚胎发育无不利影响11。

Z-REX 实验通常比 T-REX 更耗时，后者是一种用于在培养细胞中筛选或研究亲电分子感应蛋白的技术。如果实验目的是筛选亲电分子与靶标蛋白的相互作用，我们建议首先在培养细胞中通过 T-REX 进行广泛的筛选，再利用 Z-REX 进行体内验证以及表型/通路分析。与细胞培养相比，Z-REX 实验除了需要具备 T-REX 所要求的生化实验技能外，还需掌握基础的斑马鱼饲养技术。Z-REX 实验的典型周期（从斑马鱼交配到光诱导亲电分子递送）为 2 至 3 天，仅比转染活细胞的典型 T-REX 实验多出不超过 1 天。表型分析的活体成像可在光照后 2 至 10 小时内进行；用于下拉实验的生物素-叠氮化物点击偶联需 3 天；检测转录响应的定量逆转录 PCR（qRT-PCR）需 3 天；免疫荧光染色（IF 染色）需 5 天。这些步骤大致与细胞培养中的对应操作相似，但数据分析时需结合斑马鱼生理学特性及报告基因品系的特点进行解读。

作为一种多变量实验方法12，Z-REX 需要设置多个对照组以排除实验结果中的不确定性（图 1D）。常见的对照组包括：（1）仅使用 DMSO/溶剂处理；（2）使用探针处理，但不进行光照；（3）进行光照，但不使用探针处理；（4）P2A 分裂型构建体，其中 Halo 标签与目标蛋白（POI）分别表达，从而阻断邻近递送效应；以及（5）功能部分缺失的突变体，其亲电分子感应残基发生突变，例如 Akt3 (C119S)6 和 Keap1 (C151S, C273W, C288E)5，这些突变体已在我们先前的研究中使用。

如果下游实验涉及蛋白质印迹分析，则必须在收获前进行去卵黄处理。卵黄蛋白会影响裂解液浓度测定的准确性，并可能非特异性地结合抗体。在进行活体鱼类成像或整体免疫荧光染色时，我们也观察到卵黄囊中存在非特异性荧光信号，这可能是由于卵黄囊内源性自荧光蛋白所致，或源于抗体本身的非特异性结合。如果自荧光信号干扰目标信号，我们建议在定量分析中排除卵黄囊区域，或对不同区域分别进行定量。活体鱼类成像和整体免疫荧光染色实验必须进行去膜处理。卵膜会干扰成像效果，并影响后续的定量或细胞计数。然而，去膜仅适用于发育超过1天的胚胎（1 dpf以上）；处于囊胚期、原肠胚期或体节期的较年轻胚胎过于脆弱，不宜去膜。

本文所述的 Z-REX 技术基于 mRNA 驱动的外源性目的蛋白（POI）表达。与使用或构建转基因鱼系相比，该方法更为快速。mRNA 驱动的表达具有广泛性和瞬时性，在本方案所用的 mRNA 中至少可持续表达 2 天。然而，在其他情况下，表达持续时间可能有所不同。因此，该方法为研究特定亲电分子标记事件的影响提供了一个快速且更全面的观察窗口，并可与多种高通量/高内涵检测方法兼容。在特定组织中稳定表达 Halo-POI 的转基因鱼系也可与 Z-REX 兼容11。当需要提出更精确的科学问题时，此类鱼系尤为适用，例如，当细胞培养数据预测某一特定器官会出现表型，或 mRNA 注射实验的筛选结果提示某一特定器官对亲电分子标记事件敏感时。在我们先前的研究中，已利用 Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) 鱼证明了通过 Z-REX 实现心脏特异性的抗氧化反应诱导11。此外，也有可能在大于 2 dpf 的转基因鱼中进行 Z-REX 实验。

披露

由 REX 技术推动发现的同工型特异性小分子激酶抑制剂已提交专利申请

致谢

资助：Novartis FreeNovation、NCCR 和 EPFL。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇（BME）Sigma-AldrichM6250
1.5 mL 微量离心管AxygenMCT-150-C-S
10 cm 培养皿Celltreat229692
2 mL 微量离心管AxygenMCT-200-C-S
30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液BioRad1610154
6 孔板Celltreat229506
丙酮FisherA/0600/15
琼脂糖GoldBioA201-100
All Blue 预染蛋白标准品BioRad1610373
过硫酸铵SigmaA3678
生物素-dPEG11-叠氮Quanta Biodesign102856-142
Bradford 染料BioRad5000205
牛血清白蛋白（BSA）FisherBP1600-100
毛细管VWRHARV30-00200
氯仿Supelco, Inc1.02445.1000
cOmplete Mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物Roche11836170001
Cu(TBTA)Lumiprobe21050
CuSO4Sigma209198
DMSOFisherD128-500
驴抗小鼠-Alexa Fluor 647Abcamab1501071:800（IF）
驴抗兔-Alexa Fluor 647Abcamab1500751:1000（IF）
驴抗大鼠-AlexaFluor 568Abcamab1754751:1000（IF）
ECL 底物Thermo Fisher Scientific32106
ECL-Plus 底物Thermo Fisher Scientific32132
端对端旋转仪FinePCRRotator AG
乙醇FisherE/0650DF/15
溴化乙锭SigmaE1510
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪Sutter Instrument Co.P-97
荧光体视显微镜LeicaM165 FC
镊子（钝头）自制通过将锐利镊子（Fine Science Tools，Dumont #5，11252-40）钝化自制
镊子（锐头）Fine Science ToolsDumont #5，11252-40
凝胶上样吸头Fisher02-707-181
凝胶/印迹成像仪VilberFusion FX 成像仪
玻璃珠Sigma45-G1145
玻璃载物台测微尺Meiji Techno.MA285
热灭活胎牛血清（FBS）SigmaF2442
加热超声波水浴VWR89375-470
HEPESFisherBP310-1
高容量链霉亲和素琼脂糖Thermo Fisher Scientific20359
Ht-PreHNE 炔探针自制-Parvez, S. 等. T-REX 活细胞中按需氧化还原靶向. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
成像板（10% HBSS 缓冲液，用于活胚胎）使用培养皿和含 2% 琼脂糖的 10% HBSS 缓冲液制备
成像板（PBS，用于甲醛固定的胚胎）使用培养皿和含 2% 琼脂糖的 PBS 制备
注射板使用显微注射模具、培养皿和含 2% 琼脂糖的 10% HBSS 缓冲液制备
LDSApolloAPOBI3331
甲醇VWR20864.32
显微注射模具Adaptive Science ToolsTU-1
微量加样器吸头（Microloader tips）Eppendorf930001007
显微操作器NarishigeMN-153
显微注射显微镜OlympusSZ61
显微镜光源Olympus KL 1600 LED
矿物油SigmaM3516
mMessage mMachine SP6 转录试剂盒AmbionAM1340
小鼠抗-β-肌动蛋白-HRPSigmaA38541:20000（WB）
小鼠抗 HaloTag 抗体PromegaG921A1:500（IF）
多功能酶标仪BioTek InstrumentsCytation 5
核酸琼脂糖凝胶电泳装置BioradMini-Sub Cell GT 系统
寡聚(dT)20Integrated DNA Technologies定制：(dT)20
橙色GSigmaO3756
多聚甲醛SigmaP6148
PBSGibco14190144
pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA 自连-可从瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Yimon AYE 教授课题组获取
pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA自连-可从瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Yimon AYE 教授课题组获取
气动 PicoPumpWPISYS-PV820
蛋白质电泳设备及耗材BioradMini-PROTEAN Tetra 垂直电泳系统
兔抗活化 Caspase-3 抗体BD Pharmingen 5595651:800（IF）
大鼠抗 HA-HRPSigmaH36631:500（IF 和 WB）
大鼠抗 RFP 抗体ChromoTek5F81:800（IF）
冷冻离心机Eppendorf5417R
RNAseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂ThermoFisher Scientific10777019
RnaseZap RNA 去污染溶液ThermoFisher ScientificAM9780
摇床振荡器DLABSK-R1807-S
SDSTeknovaS9974
SuperScript III 逆转录酶ThermoFisher Scientific18080085
叔丁醇Sigma471712
TCEP-HClGold BiotechnologyTCEP1
TeVP 蛋白酶（S219V）自制-Parvez, S. 等. T-REX 活细胞中按需氧化还原靶向. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Tg(lyz:TagRFP)斑马鱼国际资源中心（ZIRC）uwm11Tg（ZFIN）-
Tg(mpeg1:eGFP)斑马鱼国际资源中心（ZIRC）gl22Tg（ZFIN）-
PCR 仪Analytik Jena846-x-070-280
TMEDASigmaT7024
移液管Fisher13-711-9D
TrisApolloAPOBI2888
吐温-100FisherBP151-100
TRIzol 试剂Thermo Fisher Scientific15596018
大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂SigmaT9003
吐温-20FisherBP337-500
365 nm 紫外灯SpectrolineENF 240C
紫外光度计 SpectrolineXS-365
涡旋振荡器Scientific Industries, Inc.Vortex-Genie 2
Western 印迹转膜设备及耗材BioradMini Trans-Blot 或 Criterion Blotter 
斑马鱼饲养与繁殖设备实验室自制
氧化锆珠BioSpec11079107zx

参考文献

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监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制
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