Summary
Her demonstrerer vi en ikke-invasiv kontraktilitetsevalueringsmetode for hjertemedicinsk udstyr ved hjælp af 2D humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt (hiPSC-CM) monolag, belagt på et fleksibelt substrat kombineret med videobaseret mikroskopi. Dette værktøj vil være nyttigt til in vitro-evaluering af kontraktile egenskaber af hjerteelektrofysiologiske enheder.
Abstract
Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) undersøges i øjeblikket til flere in vitro-applikationer og er blevet anvendt i regulatoriske indsendelser. Her udvider vi deres anvendelse til hjertemedicinsk udstyrs sikkerhed eller ydeevnevurderinger. Vi udviklede en ny metode til evaluering af kontraktile egenskaber for hjertemedicinsk udstyr i robust sammentrækkende 2D hiPSC-CMs monolag belagt på et fleksibelt ekstracellulært matrix (ECM) -baseret hydrogelsubstrat. Dette værktøj muliggør kvantificering af virkningerne af hjerteelektrofysiologiske enhedssignaler på menneskelig hjertefunktion (f.eks. kontraktile egenskaber) med standard laboratorieudstyr. 2D hiPSC-CM-monolagene blev dyrket i 2-4 dage på et fleksibelt hydrogelsubstrat i et 48-brønds format.
hiPSC-CM'erne blev udsat for standard hjertekontraktilitetsmodulation (CCM) elektriske signaler til medicinsk udstyr og sammenlignet med kontrol (dvs. kun pacing) hiPSC-CM'er. De grundlæggende kontraktile egenskaber for 2D hiPSC-CM'erne blev kvantificeret ved videobaseret detektionsanalyse baseret på pixelforskydning. De CCM-stimulerede 2D hiPSC-CM'er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat viste signifikant forbedrede kontraktile egenskaber i forhold til baseline (dvs. før CCM-stimulering), herunder en øget peak kontraktionsamplitude og accelereret sammentræknings- og afslapningskinetik. Desuden muliggør udnyttelsen af det fleksible hydrogelsubstrat multiplexing af de videobaserede kardiokalitationskontraktionskoblingsaflæsninger (dvs. elektrofysiologi, calciumhåndtering og sammentrækning) i raske og syge hiPSC-CM'er. Den nøjagtige detektion og kvantificering af virkningerne af hjerteelektrofysiologiske signaler på menneskelig hjertesammentrækning er afgørende for udvikling, optimering og de-risiko for hjertemedicinsk udstyr. Denne metode muliggør robust visualisering og kvantificering af de kontraktile egenskaber af hjertesyncytium, hvilket bør være værdifuldt for ikke-klinisk hjertemedicinsk udstyrs sikkerhed eller effektivitetstest. Dette papir beskriver detaljeret metoden til generering af 2D hiPSC-CM hydrogel substratmonolag.
Introduction
Efterhånden som den amerikanske befolkning bliver ældre, fortsætter antallet af patienter med hjertesvigt med at stige sammen med de direkte medicinske omkostninger 1,2. Der er et kritisk behov for at udvikle nye terapier til behandling af hjertesvigt og innovative ikke-kliniske metoder til at teste sådanne terapier. Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er blevet foreslået som et in vitro-værktøj til støtte for den terapeutiske udviklingsproces og er blevet anvendt i regulatoriske indlæg 3,4. Deres udbredte anvendelse har imidlertid været begrænset til kontraktilitetsundersøgelser på grund af manglen på robuste kontraktile egenskaber, når de belægges under standard stive 2D-kulturbetingelser (dvs. konventionel vævskulturplast eller glas)5,6,7,8. Vi har tidligere demonstreret nytten af plettering af isolerede enkelte hiPSC-CM'er på et fleksibelt hydrogelsubstrat for at generere robuste synlige kontraktile egenskaber9. Vi viste, at isolerede hiPSC-CM'er har sammenlignelige kontraktile egenskaber med dem hos nyligt isolerede voksne ventrikulære kardiomyocytter hos voksne. Desuden demonstrerede vi nytten af denne metode til vurdering af kontraktile responser på farmakologiske midler7. Desuden har andre undersøgelser anvendt denne teknologi til mekanistiske vurderinger til grundvidenskab og sygdomsmodellering10,11,12. Her er denne metode blevet udvidet til 2D hiPSC-CM monolag, og dens anvendelighed til evaluering af fysiologisk relevante elektriske signaler om hjertekontraktilitetsmodulation (CCM) medicinsk udstyr in vitro demonstreres.
CCM er en intrakardial hjertesvigtsbehandling, hvor ikke-excitatoriske elektrofysiologiske signaler leveres til myokardiet i den absolutte ildfaste periode af hjertecyklussen13,14. Der mangler reproducerbare metoder til evaluering af CCM i humane hjertecellemodeller. Tidligere arbejde har anvendt forskellige hjertecellemodeller til at evaluere CCM-kontraktilresponsen. Vi demonstrerede in vitro, at nyligt isolerede kaninventrikulære kardiomyocytter reagerer på CCM-stimulering ved en forbigående stigning i calcium og sammentrækningsamplitude15. En anden undersøgelse af isolerede ventrikulære kardiomyocytter hos hunde viste CCM-induceret forbedring af den intracellulære calciumtransiente amplitude16. I de fleste CCM-undersøgelser er der imidlertid anvendt ex vivo- og in vivo-præparater til dyr. Disse undersøgelser er vanskelige at korrelere med hinanden, fordi de anvender en række CCM-pulsparametre og arter17. En undersøgelse i en isoleret kaninpapillær model afslørede øget CCM-induceret kontraktilitet8,18, og en række helhjerteundersøgelser har vist CCM-induceret forbedring af kontraktil funktion19,20,21. Disse undersøgelser har givet vigtig mekanistisk indsigt. Der mangler imidlertid reproducerbare humane modeller for in vitro kardiale EP-kontraktile studier, herunder CCM. Til det formål har vi udviklet flere 2D- og 3D hiPSC-modeller og demonstreret CCM-induceret forbedring af kontraktile egenskaber på en parameterafhængig måde. Desuden har de CCM-inducerede inotrope virkninger vist sig at være delvist medieret af neuronal input og β-adrenerg signalering 8,17,22. Alligevel skal der vides mere om mekanismerne i CCM-terapi, og udnyttelse af kontraherende humane kardiomyocytter kan hjælpe med at opnå dette resultat. Som sådan er der et betydeligt behov for at udvikle humane ikke-kliniske værktøjer til evaluering af nye CCM-enheder og -signaler, fremskynde reguleringsprocessen, reducere byrden på dyremodeller og hjælpe enhedsudvikleremed at træffe beslutninger 8,17,23,24. Det er vigtigt at udvikle nemme, gør-det-selv-protokoller, der kan overføres til ethvert laboratorium, og som bruger standardudstyr og lave cellekrav for at reducere omkostningerne. Denne metode belyser virkningerne af CCM-stimulering på human kardiomyocytfunktion og giver vigtig indsigt i CCM-sikkerhed eller effektivitet17. Her beskriver vi metoden til generering af 2D hiPSC-CM-monolag på et fleksibelt hydrogelsubstrat for at producere et standardiseret ikke-klinisk værktøj til kvantificering af akut hjerteelektrofysiologi medicinsk udstyr (dvs. CCM) kontraktile reaktioner i sundhed og sygdom.
Protocol
1. Klargøring af plader og medier
BEMÆRK: En typisk ekstracellulær matrix (ECM)-baseret hydrogelalikvote er ~ 200 μL i et sterilt 1,5 ml rør opbevaret ved -20 ° C.
- I en steril vævskulturhætte fremstilles en steril 6-brønds plade ved at overføre 2 ml 0,1% gelatine (materialetabel) til hver brønd. Låget anbringes på 6-brøndspladen, og den coatede plade inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time.
- En dag før såning af hiPSC-CM'erne på det fleksible hydrogelsubstrat optø en hydrogel (materialetabel) alikvote i køleskabet på is.
- Forbered kardiomyocytmediet (materialetabel) ved at blande 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x B-27 supplement og 5 ml penicillin-streptomycin9.
2. Såning af kryopræserverede hiPSC-CM'er
- To dage før såning af hiPSC-CM'erne på det fleksible hydrogelsubstrat forplades hiPSC-CM'erne på 0,1% gelatinebelagte sterile 6-brøndsplader. HiPSC-CM'erne optøes ved hjælp af standardoptøningsprotokollen 9,25.
- Derefter plades 1.500.000 samlede hiPSC-CM'er (materialetabel) pr. brønd i henhold til producentens anvisninger (figur 1A)26.
- HiPSC-CM'erne dyrkes i standard kardiomyocytsubstrat i 2-4 dage for at give hiPSC-CM'erne mulighed for at komme sig efter kryopræserveringen ved 37 °C og 5% CO2. Opdater det brugte medium med 100% kardiomyocytmedium hver 48. time.
3. Afkobling og tælling af de forbelagte hiPSC-CM'er
- Kontroller status for hiPSC-CM'erne før dissociation. Evaluer hiPSC-CM'ernes sundhed, hvilket sikrer levedygtighed og stabil slag.
BEMÆRK: Renheden af hiPSC-CM-populationen er vigtig (f.eks. >90% hjerte-troponin T)7. En kardiomyocytudvælgelsesmetode (f.eks. metabolisk selektion eller sortering) anbefales for at reducere forstyrrelsen af hydrogelsubstratet af ikke-kardiomyocytceller25,26. - HiPSC-CM'erne vaskes 2x med 4 ml D-PBS pr. hul uden CaCl2 ellerMgCl2 (materialetabel). D-PBS suges op, der tilsættes 1 ml dissociationsreagens ved stuetemperatur til hvert hul, og derefter inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 10 ml kardiomyocytmedium til et sterilt 15 ml konisk rør.
- HiPSC-CM'erne adskilles fra 6-brøndspladen med en 1.000 μL pipette (figur 1B). Tilsæt cellesuspensionen til det 15 ml koniske rør26.
- Skyl brønden med 1 ml frisk kardiomyocytmedium for at opsamle eventuelle resterende hiPSC-CM'er, og tilsæt dem til det 15 ml koniske rør. Bring det endelige volumen af det koniske rør til 15 ml.
- Centrifuger i 5 min (200 × g). Supernatanten fjernes op til 1 ml mærket. Resuspender cellerne i kardiomyocytmedium til et slutvolumen på 5 ml.
- Tæl hiPSC-CM'erne med en manuel eller automatiseret celletæller.
- HiPSC-CM-suspensionen inkuberes ved stuetemperatur, mens de fleksible hydrogelsubstrater fremstilles (maks. 30 min.).
4. Fremstilling af de fleksible hydrogelsubstrater
- Forbered en 20 μL pipette indstillet til 1 μL, 20 μL pipettespidser (f.eks. 20 μL) og en steril 48-brønds glasbundplade. Sørg for, at et stopur/timer er klar, inden hydrogelsubstraterne fremstilles.
- I den sterile vævskulturhætte blandes det ECM-baserede hydrogelsubstrat ved forsigtigt at banke på røret og straks placere det tilbage på is.
- Start derefter stopuret / timeren umiddelbart før det første hydrogelsubstrat er belagt - dette er tid nul.
- Afpipette 1 μL af hydrogelsubstratet op og ned ~3x for at afkøle pipettespidsen. Påfør ~1 μL af det ufortyndede hydrogelsubstrat vandret på bunden af hvert hul på pladen med 48 brønde (figur 1C, figur 2A og figur 3A), mens pipetten holdes i en vinkel på 45°. Alle hydrogelsubstraterne anbringes i samme retning i hvert hul (figur 2 og figur 3) for at hjælpe med at identificere substratet, når eksperimenterne udføres ved 40x forstørrelse 7,9,17,27.
BEMÆRK: Hver ~ 1 μL linje er et hydrogelsubstrat (figur 3). Det tager typisk ~5 min at forberede 48 brønde. Brug af et vandret vippet mikropladestativ (f.eks. 30°) kan give et bedre overblik over bunden af brønden og hydrogelsubstratet. Sørg for at gå hele længden af brønden (dvs. fra venstre mod højre). Korte hydrogelsubstrater kan være for tykke, hvilket reducerer substratstabiliteten. Lad ikke hydrogelsubstratet tørre i pipettespidsen. Hvis dette sker, skal du hurtigt skifte til et nyt tip og straks fortsætte. Alternativt kan kølepipettespidser anvendes. Det ECM-baserede hydrogelsubstrat kan hurtigt polymerisere, når det ikke er på is. Det foreslås, at der udarbejdes flere brønde ad gangen (f.eks. 10). Derudover anbefales det at øve sig i en mock 48-brønds plade. - Anbring låget på 48-brøndspladen, og lad hydrogelsubstraterne inkubere i 8-10 minutter ved stuetemperatur i den sterile vævskulturhætte, før cellerne tilsættes (figur 2B).
BEMÆRK: Det er vigtigt at overholde de foreslåede inkubationstider. En inkubationstid på mere end 10 min vil føre til stive hydrogelsubstrater og ingen synlige sammentrækninger. En inkubationstid på mindre end 8 min kan føre til substrater, der kollapser. - HiPSC-CM'erne sås straks dråbevis direkte på hydrogelsubstraterne med ~30.000 levedygtige hiPSC-CM'er pr. brønd i et lavt medium volumen på ~200 μL kardiomyocytmedium ved hjælp af en 1.000 μL pipette (figur 2B og figur 3B).
BEMÆRK: Denne proces stopper hydrogelsubstratpolymerisationen og sikrer, at hiPSC-CM'erne er på substratet 7,9,17,27. - Låget anbringes på pladen, og hiPSC-CM'erne inkuberes uforstyrret i 10-15 minutter ved stuetemperatur (figur 2C) i den sterile vævskulturhætte, så hiPSC-CM'erne kan klæbe til hydrogelsubstratet.
- Tilsæt forsigtigt ~ 100 μL frisk kardiomyocytmedium til hvert hul (slutvolumen: ~ 300 μL pr. Hul). Låget anbringes på pladen, og overføres til en inkubator ved 37 °C, 5% CO 2 i2-4 dage. Opdater 100% mediet hver 24. time, før sammentrækningseksperimenterne udføres.
BEMÆRK: Undersøg visuelt hiPSC-CM'erne for den korrekte morfologi; umiddelbart efter plettering skal hiPSC-CM'erne være runde (figur 3B). På dag 2 efter såning observeres et sammenflydende 2D hiPSC-CM monolags syncytium (figur 3C) (supplerende video S1) med robust synlig sammentrækning (supplerende video S2).
5. Registrering og analyse af sammentrækning
- CCM-analysemediet, som er Tyrodes opløsning, der indeholder følgende (i mmol/l): CaCl2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4,MgCl2 1, glucose 10 og HEPES 10, med pH justeret til 7,4 med NaOH og ligevægt til 37 °C i et vandbad.
BEMÆRK: Submaksimalt ekstracellulært calcium (0,5 mM) bruges til at forbedre CCM-analysevinduet. - Tænd mikroskopet og miljøkontrolkammeret for at ekvilibrere til 37 °C og 5% CO2.
- Kardiomyocytmediet fjernes fra 48-brøndspladen, og skyl forsigtigt hvert hul to gange med 600 μL CCM-analysemedium.
- Der tilsættes 300 μL CCM-analysesubstrat pr. hul, og 48-brøndpladen anbringes på mikroskopet i miljøkontrolkammeret. Indsæt elektroderne, og ekvilibrer cellerne i 5 min.
- Brug videobaseret mikroskopi til at optage sammentrækningsvideoerne. Åbn videooptagelsessoftwaren, og indstil en billedhastighed på 100 billeder / s. Vælg et område af interesse (ROI) nær midten af hiPSC-CM-monolaget.
BEMÆRK: Vælg ikke et investeringsafkast nær kanten af hiPSC-CM-monolagene, da dette kan være ustabilt for kontraktile optagelser. - Derefter stimulerer feltet cellerne med en kommerciel pulsgenerator (materialetabel) til elektrisk tempo 2D hiPSC-CM-monolagene. Tempo hiPSC-CM'erne ved 1,5x tærskel ved 1 Hz med baseline pulsparametre (f.eks. monofasiske kvadratbølge pacing impulser med en 2 ms stimuluspulsvarighed på ~ 14 V / cm)17.
- Optag baseline, pacing kun (dvs. før CCM) (figur 1D) kontraktionsvideo i mindst fem slag17,28.
- Derefter stimuleres hiPSC-CM-monolaget med et eksperimentelt elektrisk signal (figur 1D). For at følge denne protokol skal du bruge standard CCM-stimuleringsparametrene: to symmetriske bifasiske impulser med 5,14 ms fasevarighed (20,56 ms samlet varighed), ~ 28 V / cm (faseamplitude), nul interfaseinterval og en forsinkelse på 30 ms (dvs. tid fra slutningen af pacingpulsen til begyndelsen af CCM-pulsen) (figur 1D)29,30 , og optag den CCM-inducerede sammentrækningsvideo i mindst fem slag.
- Sluk for CCM-signalet, stimuler med en baseline pacingpuls, og optag en sammentrækningsvideo af restitutionsperioden (dvs. efter CCM) i mindst fem slag.
- Brug standard kontraktionssoftware til automatisk at analysere sammentrækningsvideoerne og kvantificere de vigtigste kontraktile egenskaber (f.eks. kontraktionsamplitude, sammentrækningshældning, afslapningshældning, tid til top, tid til baseline 90% og sammentrækningsvarighed 50%)7,17,31,32.
- Brug 2D hiPSC-CM'erne på det fleksible hydrogelsubstrat til kontraktile eksperimenter fra dag 2-14 efter plettering på substratet.
Representative Results
Beskrevet i denne protokol er et simpelt, robust værktøj til at generere synligt sammentrækkende 2D hiPSC-CM monolag på et fleksibelt hydrogelsubstrat. Måling af kontraktile egenskaber opnås med videobaseret optagelse kombineret med kontraktilitetsanalysesoftware. Dette muliggør kvantificering af nøgleparametre for kardiomyocytkontraktilitet, herunder sammentrækningsamplitude, sammentrækningshældning, afslapningshældning, tid til top, tid til baseline 90% og sammentrækningsvarighed 50%. Modellen bruges til at karakterisere baseline kontraktile egenskaber af hiPSC-CM'er (figur 4) fra forskellige "sunde" donorer og kan udvides til evaluering af hjerteelektrofysiologi medicinsk udstyr signaler (dvs. CCM). Anvendelsen af CCM-standardstimuleringsparametrene (figur 1D)29,30 resulterede i forbedrede kontraktile egenskaber in vitro (figur 5 og tabel 1)17.
Vi demonstrerede endvidere, at denne metode kan bruges til at evaluere virkningerne af moduleringen af ekstracellulære calciumkoncentrationer på humane kontraktile egenskaber med og uden CCM-stimulering (figur 6)17. Den forventede calciumafhængighed af sammentrækning ved baseline blev observeret 7,17 såvel som en CCM-induceret stigning i calciumfølsomhed på niveauet af kardiomyocytmonolaget. Desuden afslørede den farmakologiske undersøgelse af den β-adrenerge signalvej (figur 7), at de CCM-inducerede inotrope virkninger delvis blev medieret af β-adrenerg signalering17. Desuden kan dette værktøj udvides til patientspecifikke sygdomskardiomyocytter, herunder dilateret kardiomyopati (DCM)33,34,35 (figur 8), for at forstå effekten af CCM i forbindelse med sygdomstilstande; faktisk blev forbedret kontraktil amplitude og accelereret sammentræknings- og afslapningskinetik observeret ved CCM "dosis" testet her (figur 8). Mens vi har en CCM-efterlignende enhed i vores laboratorium, er den metode, der anvendes her, ikke specifik for dette system og kan anvendes på andre hjerteelektrofysiologiske enheder.
Figur 1: Skematisk resumé af 2D hiPSC-CM in vitro CCM-modellen. (A) HiPSC-CM'erne er forbelagt i monolagsformat på gelatine (0,1%)-belagte 6-brøndsplader. (B) Efter 2 dage i kultur dissocieres hiPSC-CM'erne og forberedes til plettering på et fleksibelt hydrogelsubstrat. (C) De isolerede hiPSC-CM'er belægges med høj densitet på hydrogelsubstrater opstillet i et 48-brøndformat (venstre) og analyseres i (0,5 mM) ekstracellulært calcium Tyrodes opløsning (højre). D) Der anvendes en kommerciel pulsgenerator og kliniske CCM-standardpulsparametre29,30 (højre) til stimulering af hiPSC-CM'erne. Hjertefunktionen vurderes ved videobaseret analyse (venstre). E) Repræsentative kontraktionsregistreringer før CCM (baseline: 5 V), under CCM (CCM: 10 V) og efter CCM (genfinding: 5 V). Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk oversigt over belægning og såning af fleksibelt hydrogelsubstrat. (A) Helt optøet, ufortyndet ECM-baseret hydrogelsubstrat påføres en steril 48-brønds plade (venstre panel) med 1 μL hydrogelsubstrat pr. hul (højre panel). (B) Hydrogelsubstratet får lov til at inkubere ved stuetemperatur i 8-10 min (højre panel), efterfulgt af plettering af hiPSC-CM'erne med høj densitet i et lavt medium volumen (~ 200 μL) (venstre panel). (C) Efter 10-15 minutters inkubation tilsættes medium til hvert hul (venstre panel), og pladerne flyttes til en standard vævskulturinkubator (højre panel). Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrix, hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; RT = stuetemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ekstracellulært matrixbaseret hydrogelsubstrat. A) Repræsentativt hydrogelsubstrat (ingen celler) i en brønd i en 48-brønds glasbundplade umiddelbart efter, at substratet er påført brønden. B) Tid 0 efter podning af hiPSC-CM'erne. C) Tid 24 timer efter, at hiPSC-CM'erne er podet. Dette panel blev genoptrykt fra Feaster et al.17. De hvide pile angiver kanten af hydrogelsubstratet, 4x forstørrelse. Vægtstang = 1 mm. Forkortelse: hiPSC-CM = human induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af 2D hiPSC-CM monolags kontraktile egenskaber. (A) Repræsentativ kontraktionsoptagelse af 2D hiPSC-CM'er pacet ved 1 Hz (5 V). (B) Repræsentative sammentrækningsspor, der viser en sammentrækningscyklus. (C) Oversigtssøjlediagrammer. Dataene er gennemsnitlige ± SEM. n = 18. Forkortelse: hiPSC-CM = human induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Akut effekt af CCM på 2D hiPSC-CM kontraktile egenskaber. A) Repræsentativ sammentrækningsregistrering for før CCM (5 V), under CCM (10 V) og efter CCM (5 V). (B) Repræsentative sammentrækningsspor af de umiddelbare virkninger (dvs. sidste før CCM-slag, første CCM-slag og første efter CCM-slag, angivet med +). (C) Sammenfattende søjlediagrammer over de umiddelbare virkninger. Procentvis ændring, data er gennemsnitlige ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Effekt af ekstracellulær calciummodulation på CCM-responsen. A) repræsentative sammentrækningsspor af de umiddelbare virkninger for hver gruppe før CCM (5 V), under CCM (10 V) og efter CCM (5 V) hiPSC-CM'erne blev udsat for stigende koncentrationer af ekstracellulært calcium (Cao) på 0,25-2 mM. (B-D) Transformerede data (sigmoidal) til at guide øjet, der demonstrerer effekten af CCM på calciumfølsomheden af de kontraktile egenskaber (dvs. amplitude og kinetik) (bakkehældning = 1,0). n = 6-8 pr. Gruppe. Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Farmakologisk udfordring. repræsentative kontraktionsspor for hver gruppe før CCM (5 V), under CCM (10 V) og efter CCM (5V) hiPSC-CM'erne blev forbehandlet med (A) vehikel eller (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Oversigtssøjlediagrammer for hver betingelse. Procentvis ændring, data er gennemsnitlige ± SEM. n = 10 pr. Gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne figur er genoptrykt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Akut effekt af CCM på de kontraktile egenskaber hos syge 2D hiPSC-CM'er. (A) Repræsentativt kontraktionsspor for DCM L35P, kontrolbaseline (før 6 V) og DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Oversigtssøjlediagrammer. Procentvis ændring, data er gennemsnitlige ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Forkortelser: hiPSC-CM = humant induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocyt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering; DCM = dilateret kardiomyopati. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende Video S1: Timelapse af hiPSC-CM'erne på den ekstracellulære matrixbaserede hydrogel. Todimensionelle hiPSC-CM'er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat; Tid: 0-90 timer; en brønd af en 48-brønds glasbundplade; 4x forstørrelse. hiPSC-CM'erne danner et vandret monolags syncytium (dvs. venstre mod højre). Vægtstang = 1 mm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende Video S2: hiPSC-CM'er på den ekstracellulære matrixbaserede hydrogel. Todimensionelle hiPSC-CM'er belagt på det fleksible hydrogelsubstrat; Tid: ~ 24 timer; en brønd af en 48-brønds glasbundplade; 4x forstørrelse. HiPSC-CM'erne danner monolagsmorfologi og viser robust sammentrækning ved ~ 24 timer efter plettering. Vægtstang = 1 mm. Denne video er fra Feaster et al.17. Klik her for at downloade denne video.
| Parameter | CCM | Efter |
| Amplitude | 16 ± 4%** | 4 ± 5% |
| Tid til peak 50% | -20 ± 9%* | 7 ± 5% |
| Tid til top 90% | -22 ± 8%* | 6 ± 5% |
| Tid til baseline 50% | -8 ± 5% | 4 ± 4% |
| Tid til baseline 90% | -12 ± 6%* | 5 ± 5% |
| Sammentrækning varighed 10% | -13 ± 6% | 3 ± 5% |
| Sammentrækning varighed 50% | -6 ± 5 % | 3 ± 5% |
| Sammentrækning varighed 90% | 0 ± 5% | 3 ± 4% |
| N | 23 | 23 |
Tabel 1: Kontraktile egenskaber. Procentvis ændring i forhold til før CCM (5 V); dataene er gennemsnitlige ± SEM for alle slag i hver gruppe under CCM (10 V) og efter CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne tabel er genoptrykt fra Feaster et al.17.
Discussion
Protokollen skitseret heri beskriver en metode til at generere robust sammentrækkende 2D hiPSC-CM-monolag på et fleksibelt ekstracellulært matrix (ECM)-baseret hydrogelsubstrat med kommercielle reagenser 7,17. HiPSC-CM'erne, der er podet på det fleksible hydrogelsubstrat, forbliver levedygtige og har forbedrede kontraktile egenskaber7. Denne teknik er afhængig af standard laboratorieudstyr ogkapaciteter 7. Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder i forhold til at arbejde med det ECM-baserede hydrogelsubstrat, der kræver omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Et potentielt problem er tilstedeværelsen af serum i mediet. Dette kan resultere i, at hiPSC-CM'erne danner netværk (f.eks. endotel/vaskulære netværk) i stedet for et sammenflydende enkeltlagsark; derfor anbefales et serumfrit medium under etableringen af de fleksible hydrogel hiPSC-CM-monolag (dvs. dag 0 til dag 4). På samme måde kan forberedelse af for mange hydrogelsubstrater ad gangen resultere i dårlige eller ujævne substrater på grund af operatørtræthed. Selvom det er vigtigt at arbejde hurtigt, er integriteten af hvert hydrogelsubstrat kritisk. På samme måde bør man omhyggeligt frø hiPSC-CM'erne og ændre mediet; Dette bør ikke gøres med magt. Når mediet ændres, skal det tilsættes forsigtigt fra brøndens øverste kant for ikke at forstyrre hydrogelsubstratet eller cellerne. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konventionel vævskulturplast eller glas) vil plettering ved lav densitet resultere i ufuldstændig enkeltlagsdannelse. Det er vigtigt visuelt at inspicere hiPSC-CM'erne for at bekræfte, at de er på hydrogelsubstratet og bruge en timer for at sikre nøjagtig timing. Desuden kan dyrkning af 2D hiPSC-CM-monolagene i mere end 14 dage på hydrogelsubstratet resultere i monolagsforstyrrelser baseret på ECM-egenskaberne og instruktioner fra producenten af substratet.
Der er flere begrænsninger for den nuværende metode, der skal overvejes. For det første var cellerne, der blev brugt i denne protokol, fra en kommerciel hiPSC-CM-udbyder, og disse celler danner et syncytium af elektrisk koblede celler. Syncytium indeholder en blanding af hiPSC-CM'er fra alle tre hjerteundertyper (dvs. ventrikulære, atriale og nodale)17. Studier kan drage fordel af en subtype-eksklusiv hiPSC-CM-population (dvs. 100% ventrikulær eller 100% atriel). For det andet anvendte denne metode kun hiPSC-CM'er, mens ikke-myocytter, herunder hjertefibroblaster, endotelceller og neuroner, kan forbedre hiPSC-CM-funktionaliteten22,36. For det tredje viser 2D hiPSC-CM'er flere funktioner i relativt umodne kardiomyocytter, herunder spontan slag, amorf morfologi og mangel på et inotropt respons 8,37. For det fjerde, mens denne protokol producerer robust kontraherende 2D hiPSC-CM-monolag, er det sandsynligt, at funktionelt forbedrede 3D hiPSC-CM-modeller såsom konstruerede hjertevæv (ECT'er) vil resultere i et forbedret CCM-induceret kontraktilt respons under fysiologiske calciumkoncentrationer 8,38. Endelig er protokollen beskrevet her designet til et 48-brøndsformat. Men med optimering og inkludering af automatisering kan dette skaleres til et højt gennemløbsformat (f.eks. 96-brønds- eller 384-brøndplader).
Den nuværende guldstandard for hiPSC-CM-undersøgelser er konventionelle stive 2D-kulturbetingelser (dvs. vævskulturplast eller glas). Selvom den konventionelle metode er nyttig til elektrofysiologi3 og calciumhåndtering39 undersøgelser, resulterer den i minimale kontraktile egenskaber 5,6,7. Som følge heraf kan konventionelle stive 2D-kulturbetingelser ikke vurderes af CCM's kontraktile virkninger8. Funktionelt forbedrede 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 er teknisk udfordrende, tidskrævende og kræver sofistikeret udstyr, der ikke er let tilgængeligt i alle laboratorier. I denne protokol beskriver vi en simpel metode til at generere robust sammentrækkende 2D hiPSC-CM-monolag inden for en kortere tidsramme end 3D ECT-metoder eller langsigtede, konventionelle 2D-metoder 7,40,41. Desuden er de reagenser, der anvendes her, kommercielt tilgængelige, herunder hydrogelsubstratet og hiPSC-CM'erne, og begge har betydelig lot-to-lot konsistens. Mens vi brugte aftagelige platintrådelektroder (interelektrodeafstand: 2,0 mm, bredde: 1,0 mm), er forskellige elektrodematerialer og konfigurationer modtagelige for CCM-kontraktile vurderinger in vitro 8,15,17,18,22. Ligeledes er der flere automatiserede software til rådighed, der muliggør analyse af sammentrækningsvideoer 7,31,32.
De fleste ikke-kliniske metoder til evaluering af kontraktilitet i forbindelse med hjertemedicinsk udstyr er i vid udstrækning baseret på dyre in vivo-dyremodeller (f.eks. hunde eller svin) og teknisk udfordrende papillære muskelstrimler (f.eks. kaniner)18. Dette papir beskrev en human in vitro-model til evaluering af virkningerne af hjerteelektrofysiologi, medicinsk udstyrssignaler på kontraktilitet. Dette værktøj kan reducere afhængigheden af dyreforsøg og være nyttigt til in vitro-evaluering af de kontraktile egenskaber ved hjerteelektrofysiologiudstyr.
Disclosures
Denne artikel afspejler forfatternes synspunkter og bør ikke fortolkes som at repræsentere US Food and Drug Administration's synspunkter eller politikker. Omtale af kommercielle produkter, deres kilder eller deres anvendelse i forbindelse med det materiale, der rapporteres heri, skal ikke fortolkes som enten en faktisk eller underforstået godkendelse af sådanne produkter fra Department of Health and Human Services. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser for dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af en udnævnelse til forskningsdeltagelsesprogrammet ved Center for Devices and Radiological Health administreret af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en interagency aftale mellem US Department of Energy og US Food and Drug Administration. Forfatterne takker Richard Gray, Trent Robertson og Anna Avila for deres forslag og tekniske assistance. Undersøgelsen blev finansieret gennem US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Gelatin | STEMCELL Technologies | 7903 | Pre-plating Culture Substrate |
| 48-well Plate | MatTek | P48G-1.5-6-F | Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass |
| 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | hiPSC-CM Culture, Plastic |
| B-27 Supplement, with insulin | Invitrogen | 17504-044 | Cardiomyocyte Media |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | c70-500 | Tyrode’s solution |
| CellOPTIQ Platform and Software | Clyde Biosciences | Contraction Recording and Analysis | |
| Conical tube 15 mL | Corning | 352099 | hiPSC-CM Dissociation |
| Digital CMOS Camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | Contraction Video Recording |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Cell Wash |
| Environmental Control Chamber | OKOLAB INC | H201-K-FRAME | Environmental Regulation |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1kg | Tyrode’s solution |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | hiPSC-CM Counting |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| iCell Cardiomyocytes Plating Medium | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | M1001 | hiPSC-CM Plating Media |
| iCell Cardiomyocytes2, 01434 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1017 | hiPSC-CMs |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermofisher | 50116047 | Maintain hiPSC-CMs |
| Inverted Microscope | Olympus | IX73 | Imaging hiPSC-CMs |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Fisher Scientific | m33-500 | Tyrode’s solution |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | Flexible Hydrogel Substrate |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Hydrogel Substrate Aliquot |
| Model 4100 Isolated High Power Stimulator | AM-Systems | Model 4100 | Pulse Generator |
| MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1153 | DCM hiPSC-CMs |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | Cardiomyocyte Media |
| Pipette L-20 | Rainin | 17014392 | Plating Hydrogel Substrate |
| Pipette P1000 | Fisher Scientific | F123602G | |
| Pipette tips, 1000 ul | Fisher Scientific | 02-707-509 | |
| Pipette tips, 20 ul | Rainin | GPS-L10S | Making Hydrogel Substrate |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | Tyrode’s solution |
| RPMI 1640, with glucose | Invitrogen | 11875 | Cardiomyocyte Media |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | s641-212 | Tyrode’s solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | Tyrode’s solution |
| Stimulation Electrodes | Pacing and CCM Stimulation | ||
| Stopwatch/Timer | Fisher Scientific | 02-261-840 | Plating Hydrogel Substrate |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | T10282 | hiPSC-CM Counting |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12605-010 | hiPSC-CM Dissociation |
References
- Jackson, S. L., et al. National burden of heart failure events in the United States, 2006 to 2014. Circulation: Heart Failure. 11 (12), 004873 (2018).
- Cook, C., Cole, G., Asaria, P., Jabbour, R., Francis, D. P. The annual global economic burden of heart failure. International Journal of Cardiology. 171 (3), 368-376 (2014).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Yang, X., Ribeiro, A. J. S., Pang, L., Strauss, D. G. Use of human iPSC-CMs in nonclinical regulatory studies for cardiac safety assessment. Toxicology Sciences. 190 (2), 117-126 (2022).
- Zuppinger, C. 3D cardiac cell culture: A critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Huethorst, E., et al. Conventional rigid 2D substrates cause complex contractile signals in monolayers of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 600 (3), 483-507 (2022).
- Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress: A method for the generation of single contracting human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 117 (12), 995-1000 (2015).
- Feaster, T. K., et al. Acute effects of cardiac contractility modulation stimulation in conventional 2D and 3D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte models. Frontiers in Physiology. 13, 1023563 (2022).
- Feaster, T. K. Implementation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte to model excitation-contraction coupling in health and disease. , Vanderbilt University Medical Center. PhD thesis (2015).
- Cadar, A. G., et al. Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 163-173 (2020).
- Parikh, S. S., et al. Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1323-1330 (2017).
- Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
- Campbell, C. M., Kahwash, R., Abraham, W. T. Optimizer Smart in the treatment of moderate-to-severe chronic heart failure. Future Cardiology. 16 (1), 13-25 (2020).
- PMA P180036. FDA Summary of Safety and Effectiveness Data. Food and Drug Administration. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf18/P180036B.pdf (2019).
- Blinova, K., et al. Acute effects of nonexcitatory electrical stimulation during systole in isolated cardiac myocytes and perfused heart. Physiological Reports. 2 (8), 12106 (2014).
- Sabbah, H. N., et al. Cardiac contractility modulation with the impulse dynamics signal: Studies in dogs with chronic heart failure. Heart Failure Reviews. 6 (1), 45-53 (2001).
- Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Acute effects of cardiac contractility modulation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Physiological Reports. 9 (21), 15085 (2021).
- Brunckhorst, C. B., Shemer, I., Mika, Y., Ben-Haim, S. A., Burkhoff, D. Cardiac contractility modulation by non-excitatory currents: Studies in isolated cardiac muscle. European Journal of Heart Failure. 8 (1), 7-15 (2006).
- Mohri, S., et al. Cardiac contractility modulation by electric currents applied during the refractory period. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 282 (5), 1642-1647 (2002).
- Mohri, S., et al. Electric currents applied during refractory period enhance contractility and systolic calcium in the ferret heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (4), 1119-1123 (2003).
- Burkhoff, D., et al. Electric currents applied during the refractory period can modulate cardiac contractility in vitro and in vivo. Heart Failure Reviews. 6 (1), 27-34 (2001).
- Narkar, A., Feaster, T. K., Casciola, M., Blinova, K. Human in vitro neurocardiac coculture (ivNCC) assay development for evaluating cardiac contractility modulation. Physiological Reports. 10 (21), 15498 (2022).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Blinova, K., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, 1-15 (2015).
- Cadar, A. G., Feaster, T. K., Durbin, M. D., Hong, C. C. Production of single contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Matrigel mattress technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. 42, 1-7 (2017).
- Narkar, A., Willard, J. M., Blinova, K. Chronic cardiotoxicity assays using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3199 (2022).
- OPTIMIZER® Smart Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2020/05/13-290-008-01-US-Rev-01-OPT-Smart-IPG-IFU.pdf (2018).
- OPTIMIZER™ Smart Mini Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2021/02/13-290-011-EU-Rev-00-OPTIMIZER-Smart-Mini-IPG-IFU-EU.pdf (2019).
- Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
- Grune, T., Ott, C., Haseli, S., Hohn, A., Jung, T. The "MYOCYTER" - Convert cellular and cardiac contractions into numbers with ImageJ. Scientific Reports. 9, 15112 (2019).
- Masarone, D., et al. Use of cardiac contractility modulation as bridge to transplant in an obese patient with advanced heart failure: A case report. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 833143 (2022).
- Nadeem, M., Tariq, E. F., Aslam, H. M., Illahi, Y., Shah, R. All-cause mortality outcomes of usage of cardiac contractility modulation in patients with dilated cardiomyopathy ineligible for cardiac re-synchronization therapy: An updated meta-analysis of randomized controlled trials. Cureus. 12 (9), 10627 (2020).
- Manganelli, G., et al. Use of cardiac contractility modulation in an older patient with non-ischemic dilated cardiomyopathy: A case report. Clinics and Practice. 11 (4), 835-840 (2021).
- Mannhardt, I., et al. Automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening. Journal of Visualized Experiments. (122), e55461 (2017).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Feric, N. T., et al. Engineered cardiac tissues generated in the Biowire™ II: A platform for human-based drug discovery. Toxicology Sciences. 172 (1), 89-97 (2019).
- Hwang, H. S., et al. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes to understand and test cardiac calcium handling: A glass half full. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 379-380 (2015).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Stoehr, A., et al. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1353-1363 (2014).
