Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تصور المستقلبات المحددة في الأيض المكاني للطب الصيني التقليدي باستخدام DESI-MSI

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64912
Automatic Translation
1,4, 3, 3, 1, 1, 1,2
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Tianfu Chinese Medicine Innovation Harbour, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4China Resources Sanjiu (Ya’an) Pharmaceutical Co., Ltd.

Summary

في هذه الدراسة ، يتم تقديم سلسلة من الطرق لإعداد عينات DESI-MSI من النباتات ، ويتم وصف إجراء تركيب تجميع DESI ، والحصول على بيانات MSI ، والمعالجة بالتفصيل. يمكن تطبيق هذا البروتوكول في عدة شروط للحصول على معلومات الأيض المكاني في النباتات.

Abstract

يرجع الاستخدام الطبي للطب الصيني التقليدي بشكل أساسي إلى مستقلباته الثانوية. أصبح تصور توزيع هذه المستقلبات موضوعا حاسما في علوم النبات. يمكن لتصوير قياس الطيف الكتلي استخراج كميات هائلة من البيانات وتوفير معلومات التوزيع المكاني عنها عن طريق تحليل شرائح الأنسجة. مع ميزة الإنتاجية العالية والدقة العالية ، غالبا ما يستخدم تصوير قياس الطيف الكتلي بالتأين بالرش الكهربائي (DESI-MSI) في الأبحاث البيولوجية وفي دراسة الطب الصيني التقليدي. ومع ذلك ، فإن الإجراءات المستخدمة في هذا البحث معقدة وغير ميسورة التكلفة. في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين إجراءات التقسيم والتصوير DESI وطورنا طريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة لتحديد توزيع المستقلبات وتصنيف هذه المركبات في الأنسجة النباتية ، مع التركيز بشكل خاص على الأدوية الصينية التقليدية. ستعزز الدراسة استخدام DESI في تحليل الأيض وتوحيد الطب الصيني التقليدي / الطب العرقي للتكنولوجيات المتعلقة بالبحوث.

Introduction

أصبح تصور توزيع الأيض موضوعا حاسما في علوم النبات ، وخاصة في الطب الصيني التقليدي ، حيث يكشف النقاب عن عملية تكوين مستقلبات محددة داخل النبات. بالإشارة إلى الطب الصيني التقليدي (TCM) ، فإنه يوفر معلومات تتعلق بالمكونات النشطة ويوجه تطبيق أجزاء النبات في التطبيقات الصيدلانية. عادة ، يتم تحقيق تصور المستقلبات عن طريق التهجين في الموقع ، أو الفحص المجهري الفلوري ، أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، ولكن عدد المركبات المكتشفة بواسطة هذه التجارب ينقل معلومات كيميائية محدودة. إلى جانب تلطيخ الأنسجة ، يمكن أن يوفر تصوير قياس الطيف الكتلي (MSI) كمية كبيرة من البيانات ويوفر معلومات التوزيع المكاني للمركبات عن طريق مسح وتحليل شرائح الأنسجة على مستوى الميكرون1. يستخدم MSI التحليلات للامتزاز والتأين من سطح العينة ، يليه تحليل الكتلة لأيونات الطور البخاري الناتجة وتطبيق برنامج التصوير لدمج المعلومات ورسم صورة ثنائية الأبعاد تسجل وفرة أيونية محددة. يمكن لهذه التقنية تحديد كل من الجزيئات الخارجية والداخلية من خلال الكشف عن التوزيع المميز للأدوية ومستقلباتها المستحثة في الأنسجة والأعضاء المستهدفة2،3،4،5.

تم تطوير طرق تصوير مختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد على مدى العقود الأخيرة. وأبرزها الرش الكهربائي القائم على التأين MSI (DESI-MSI) ، والامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) ، وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي (SIMS)6. غالبا ما يستخدم DESI-MSI في الأبحاث البيولوجية نظرا لتشغيله في الغلاف الجوي ، والإنتاجية العالية ، والدقةالعالية 7. تم تطبيق MALDI لتحديد جزء ترانسثيريتين كعلامة حيوية سامة كلوية محتملة للجنتاميسين ولتحليل توزيع المستقلب السمي العصبي 1-ميثيل-4-فينيل بيريدينيوم بعد إدارة 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-تتراهيدروبيريدين في أدمغةالفئران 8،9. تم استخدام MALDI و DESI لتحديد تكوين الهياكل الشبيهة بالكريستال التي يسببها الدواء في كلية الأرانب ذات الجرعات. تتكون هذه الهياكل بشكل أساسي من مستقلبات تشكلت بسبب إزالة الميثيل و / أو أكسدة الدواء10. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق MSI في توطين التوزيع الأيضي لسمية الدواء في الأعضاء المستهدفة. ومع ذلك ، فإن الخلايا في الأنسجة النباتية تختلف وتختلف عن الحيوانات وتتطلب إجراءات تقسيم خاصة.

في النباتات ، باستخدام تصوير MALDI ، حتى الآن ، تم تحليل توزيع المركبات المختلفة في جذع القمح (Triticum aestivum) ، وفول الصويا (Glycine max) ، وبذور الأرز (Oryza sativa) ، وأزهار وجذور Arabidopsis thaliana ، وبذور الشعير (Hordeum vulgare) 11،12،13،14،15،16،17،18 . أفادت الدراسات الحديثة أن DESI-MSI آخذ في الظهور في تحليل الأيض للعقاقير والمنتجات الطبيعية ، خاصة في الطب الصيني التقليدي مثل الجنكة بيلوبا وفوزي وأرطماسيا أنوا L19،20،21. في هذه الدراسات ، تختلف بروتوكولات تحضير عينات المواد النباتية ، وبعضها يتطلب معدات أكثر تعقيدا ، مثل ميكروتوم التجميد. لدى DESI-MSI متطلبات صارمة لتسطيح سطح العينة المكتشفة. عند تحليل عضو أو نسيج ، عادة ما يتم إجراء العينة عن طريق التقسيم بالتبريد22. ومع ذلك ، فإن إجراء التقسيم بالتبريد معقد وأكثر تكلفة ، وطريقة درجة حرارة القطع المثلى للمادة اللاصقة شائعة الاستخدام (OCT) لها إشارة قوية عند التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، تختلف الأنسجة الطبية للطب الصيني التقليدي. على سبيل المثال ، يتم استخدام جذر Salvia miltiorrhiza ، المعروف باسم Danshen باللغة الصينية ، طبيا ، بينما في Zisu (Perilla frutescens) ، يتم استخدام الورقة23,24. لذلك ، من الضروري تحسين إجراءات تحضير العينات لتعزيز استخدام DESI في تحليل الأيض للطب الصيني التقليدي.

كعشب معمر وشائع الاستخدام ، تم تسجيل S. miltiorrhiza في البداية في أقدم دراسة طبية ، Shennong's Classic of Materia Medica (المعروفة باسم Shennong Bencao Jing باللغة الصينية). في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين إجراءات التقسيم والتصوير DESI وطورنا طريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة لتحديد توزيع وتصنيف المركبات في أنسجة S. miltiorrhiza. يمكن لهذه الطريقة أيضا التغلب على العيوب المرتبطة بالأنسجة الجافة - التي عادة ما تنكسر بسهولة تحت ضربة النيتروجين - وتعزيز تطور الطب الصيني التقليدي. وستعزز الدراسة توحيد الطب الصيني التقليدي/الطب العرقي لأغراض التكنولوجيات المتصلة بالبحوث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العينة

  1. اجمع الجذور والأوراق النظيفة من نبات Salvia miltiorrhiza البالغ من العمر عامين (الشكل 1 أ) ، وقم بتقطيعه مباشرة بسمك مقطع عرضي يبلغ حوالي 3-5 مم يدويا. بعد ذلك ، قم بلصق العينة على شريحة زجاجية مجهر التصاق باستخدام شريط على الوجهين (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: تأكد من أن حجم الشريط على الوجهين أكبر من العينة. إذا تم تجفيف الأنسجة ، انقعها في الماء أو 4٪ بارافورمالدهايد طوال الليل قبل تقطيعها.
  2. ضع شريحة زجاجية مجهرية أخرى فوق العينة ولف الشريحتين الزجاجيتين بفيلم مانع للتسرب مثل شطيرة (الشكل 1C). قم بتجميد عينة الساندويتش عند -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل ، ثم قم بتعريضها لفراغ هوائي لمدة ساعتين (الشكل 1 د) مع معلمات الإعداد التالية: درجة حرارة المصيدة عند -75 إلى -82 درجة مئوية ومقياس الفراغ عند 2.5 إلى 3.7 باسكال.
    ملاحظة: تأكد من أن الشريحتين الزجاجيتين متوازيتين عند لف فيلم الختم للحفاظ على سطح العينة سليما. إذا كانت الأنسجة النباتية تحتوي على نسبة عالية من الرطوبة ، فقم بتمديد وقت فراغ الهواء إلى 3 ساعات. لا تتجاوز 5 ساعات ، وإلا فإن الأنسجة سوف تنكسر بسهولة.
  3. قم بتخزين عينات الساندويتش في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التحليل. أحضر العينات إلى درجة حرارة الغرفة في مجفف لتجنب التكثيف على سطح العينة. ثم قم بإخضاع العينة لتطبيق المصفوفة.

2. تركيب وحدة التأين بالرش الكهربائي للامتزاز (DESI)

  1. تنفيذ إعداد الكاشف والمعايرة الجماعية للأداة في وضع ESI ؛ إجراء إعداد الكاشف باستخدام Leucine Enkephalin (LE) في محلول أسيتونيتريل الماء (1: 1 فولت / فولت) وإجراء معايرة الكتلة باستخدام فورمات الصوديوم (NaFA) في محلول الأيزوبروبانول المائي (1: 1 فولت / فولت).
  2. أخرج مصدر ESI وقم بتركيب وحدة DESI على مطياف الكتلة. قم بتوصيل مصدر الغاز N2 بوحدة DESI واضبط ضغط الغاز على حوالي 0.5 ميجا باسكال (الشكل 2A). ليست هناك حاجة للتنفيس عن الأداة عند تبادل المصادر.
  3. املأ المحقنة سعة 5 مل ب LE وحمض الفورميك في محلول الميثانول المائي (1: 9 فولت / فولت) وقم بتوصيل المحقنة بمضخة المحقنة عالية الأداء لتوفير مذيب لتأين المواد الكيميائية في العينة (الشكل 2 ب).
  4. قم بتوصيل مذيب يوفر الشعيرات الدموية بالمحقنة وبخاخ DESI (الشكل 2C). المذيب الذي يوفر الشعيرات الدموية هو قطر داخلي قياسي 75 ميكرومتر و 375 ميكرومتر خارج القطر الشعري. إنه ضيق إلى حد ما ويمكن حظره بسهولة بسبب الشوائب ، لذلك يجب أن تكون المذيبات المستخدمة في عمليات المسح من درجة MS وتصفيتها قبل الاستخدام لتقليل مخاطر الانسداد.
  5. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة واضبط معدل التسريب على 2 ميكرولتر / دقيقة للحصول على تدفق مستمر ورش المذيب (الشكل 2 ب). قم بإيقاف تشغيل صمام الغاز N2 ، ثم قم بتشغيله بعد حوالي 15 ثانية ؛ سيتم تفجير قطرة صغيرة من المذيب على المسرح ، ويمكن رؤية الرذاذ إذا كان تدفق المذيب في حالة ثابتة.
  6. اضبط موضع البخاخ من حيث زاوية الرش ومحور XYZ والنتوء والارتفاع (الشكل 2D). استخدم علامات حمراء وسوداء كمراجع لتحسين إشارة قياس الطيف الكتلي ، للحصول على شدة إشارة أعلى من 1 × 105 في وضع الحساسية (الشكل 2E).
    1. بروز البخاخ هو العامل الأكثر أهمية الذي يؤثر على شدة الإشارة ؛ اضبط النتوء عن طريق تغيير واقي الغاز N2 بمفتاح ربط 5 مم. يؤثر اتجاه الرش على جودة الصورة الجماعية ؛ قم بتدوير البخاخ حتى يصبح الرذاذ مستقيما. بمجرد ضبط النتوء على أفضل موضع لشدة الإشارة ، حاول ألا تغيره عند تبادل المصادر.
  7. بعد كل الخطوات المذكورة أعلاه ، يكون الإعداد جاهزا للتجارب ، ويكون الإعداد مستقرا عادة لمدة >3 أسابيع من قابلية الاستخدام ، ويتم ملاحظتها بعد الإعداد الأولي.

3. الحصول على صور DESI-MS

  1. بالنسبة ل DESI-MSI ، لا تقم بإجراء معالجة مسبقة للعينة. بالنسبة للعينات التي تحتوي بالفعل على معالجة مسبقة ، قلل خطوات المعالجة المسبقة قدر الإمكان. على سبيل المثال ، لا يمكن إجراء بعض العينات إلا باستخدام وسائط التركيب ، لذا قم بإزالة الوسائط الزائدة على الشرائح إن أمكن.
  2. التقط صورة للعينة على الشريحة (الشكل 3 أ). لا تلمس سطح العينة لتجنب أي شوائب في الداخل.
  3. ضع الشريحة على موضع اللوحة على مرحلة DESI. تحتوي المرحلة على موقعين للوحة ، A و B ؛ من المهم أن تتذكر الموضع الصحيح. استخدم شرائح قياسية (75 مم × 25 مم) أو شريحة كاملة ، وإلا فلن تتناسب الشريحة مع الموضع ولا يمكن تثبيتها بثبات. يمكن أن تستوعب الشريحة الكاملة (120 مم × 80 مم) ما يصل إلى أربع شرائح ، وبالتالي لديها مساحة أكبر بكثير للتجارب.
  4. افتح برنامج معالجة الصور الجماعية عالي الدقة ، وقم بتعيين لوحة جديدة في علامة التبويب Acquisition ، وحدد موضع اللوحة الأيمن (A أو B) ونوع اللوحة. في صفحة تحديد الصورة ، حدد الزوايا الأربع للشريحة ، ثم يتم ضبط الصورة تلقائيا على الاتجاه الصحيح (الشكل 3 أ).
  5. تعيين معلمات MS ؛ نوع التجربة الشائع الاستخدام هو وضع DESI-MS ، حيث سيتم اكتشاف الأيون الأصلي فقط. يمكن للأداة استخدام قطبية واحدة فقط في تجربة واحدة ؛ لذلك ، حدد القطبية على أنها موجبة أو سلبية. للحصول على مزيد من المعلومات حول المواد الكيميائية بكميات صغيرة ، قم بتطبيق وضع الحساسية (الشكل 3 ب).
  6. ارسم مستطيلا لتعريف منطقة المسح الضوئي في علامة التبويب نقش وقم بتعيين حجم البيكسل. بشكل عام ، بالنسبة لوضع DESI-MS ، حافظ على أحجام X و Y للبكسل متساوية. اضبط معدل المسح على ما لا يزيد عن 5 أضعاف حجم البكسل (الشكل 3C).
  7. احفظ المشروع وقم بتصدير ورقة عمل لبرنامج الحصول على قياس الطيف الكتلي.
  8. افتح برنامج الحصول على قياس الطيف الكتلي ، واستورد ورقة العمل ، واحفظها كقائمة نماذج جديدة. اضغط على بدء التشغيل لبدء فحص MSI. يمكن إضافة صور متعددة إلى قائمة انتظار التجارب عن طريق استيراد المزيد من أوراق العمل.

4. معالجة بيانات DESI-MSI والتصور

  1. قم بتحميل ملف بيانات العينة في برنامج معالجة الصور الجماعية وقم بتعيين معلمات معالجة صور DESI (الشكل 3D). نظرا لاستخدام Leucine Enkephalin لكتلة القفل الداخلية ، وكتلة القفل هي النقطة الوحيدة لتحديد قطبية التجربة ، فمن الأهمية بمكان ضبط كتلة القفل الصحيحة. قم بتعيين القيم التالية: للوضع الإيجابي: 556.2772; للوضع السلبي: 554.2620.
  2. من الممكن بناء قائمة بالمواد الكيميائية المستهدفة ، وفي هذه الحالة ستركز نتيجة المعالجة على المواد الكيميائية في القائمة المستهدفة. قم بتحميل ملف البيانات المعالجة لتصور صورة DESI للعينة. انقر فوق الزر "تطبيع" لتطبيع البيانات عن طريق الكروماتوغرافيا الأيونية الكلية (TIC) للحصول على الكثافة النسبية لمادة كيميائية معينة إلى المرجع ، ثم يمكن مقارنة عينات مختلفة مع بعضها البعض (الشكل 3E).
  3. ارسم منطقة اهتمام (ROI) وانسخ عدة نسخ على صورة العينة ؛ يمكن تحقيق عائد الاستثمار عبر صور مختلفة. حدد جميع عائد الاستثمار وقم بتصدير التحليل متعدد المتغيرات (MVA) لاستخراج معلومات MS من جميع عائد الاستثمار ل MVA (الشكل 3F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن أن يؤدي هذا البروتوكول إلى تحديد وتوزيع المركبات في العينات النباتية. في صورة MS ل m / z معين ، يمثل لون كل بكسل واحد الكثافة النسبية ل m / z ، وبالتالي يمكن أن يرتبط بالتوزيع الطبيعي ووفرة أيون المستقلب في جميع أنحاء العينة. كلما زادت وفرة المادة الكيميائية في موضع التجميع ، كان اللون أكثر إشراقا. يظهر الشريط في الصورة (الشكل 4A-D) تدرج الألوان. هنا ، اخترنا مركبين قيمين في الاستخدام الطبي ل S. miltiorrhiza. كما هو موضح في الشكل 4A-D ، فإن توزيع المركبات المستهدفة ، Tanshinone IIA (m / z: 333.0893 ، M + H) وحمض روزمارينيك (m / z: 705.1848 ، 2M + H-O) ، مرئي في مناطق مختلفة من الجذر. وفي الوقت نفسه ، تم اكتشاف مركب Danshenol A (m / z: 297.1127 ، M + H ؛ m / z: 335.0686 ، M + K) في الورقة ، كما هو موضح في الشكل 4E-H. يمكن استخدام توزيع المركبات لتوجيه استخدام الجزء النباتي في التطبيقات الطبية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق بيانات MVA المصدرة لإجراء مزيد من تحليل الأيض.

Figure 1
الشكل 1: طريقة تحضير العينة. أ: النبات (Salvia miltiorrhiza) المستخدم في هذا البحث. يشير السهم الأحمر إلى الأنسجة التي تم جمعها كعينة. (ب، ج) رسم تخطيطي يوضح كيفية عمل عينة شطيرة. (د) فراغ الهواء للعينات. ضبط درجة الحرارة هو -83.1 ± 3 درجة مئوية ، ونطاق الفراغ هو 3-5 باسكال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المعدات والأجهزة في وحدة DESI-MSI . (أ) منظر أمامي لتجميع DESI. ب: مضخة حقنة. ج: شعيرات شعرية بالبخاخ. (د) منظر علوي لتجميع DESI. (ه) تحسين الإشارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الاستحواذ وتحليل البيانات والتصور بواسطة DESI-MSI. ( أ) قم بتحميل الصورة في برنامج معالجة الصور الجماعية وحدد زوايا الشريحة لضبط الصورة على الاتجاه الصحيح. (B) اضبط معلمات MS ، واضبط نطاق المسح الضوئي m / z ، وحدد الوضع الإيجابي أو السلبي. (ج) حدد منطقة المسح الضوئي ودقة الصورة ومعدل المسح. (د) اضبط معلمات المعالجة: عدد الكتل المستهدفة ، وكتلة القفل ، وتردد العينة ، والمدة. (ه) تحميل الناتج وتطبيع البيانات. حدد m / z المتوقع من قائمة الكتلة لعرض صورة MS ل m / z. (F) ارسم مناطق الاهتمام (ROIs) على صورة MS ، وقم بتصدير MVA لتحليل الأيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصوير قياس الطيف الكتلي لأقسام الجذور والأوراق الكاملة. (أ-د) صور توضح التوزيع المكاني لمركبين محددين في الجذر. (ه-ح) صور توضح التوزيع المكاني لمركبين مختارين في الورقة. يمثل لون كل بكسل واحد الكثافة النسبية ل m / z وبالتالي يمكن أن يرتبط بالتوزيع الطبيعي ووفرة أيون المستقلب في جميع أنحاء العينة. كلما زادت وفرة المادة الكيميائية في موضع التجميع ، كان اللون أكثر إشراقا. يظهر الشريط في الصور تدرج الألوان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فتح ظهور تقنية MS رؤية جديدة في أبحاث المنتجات الطبيعية على المستوى الجزيئي خلال السنوات الأخيرة24. يتيح جهاز MS ، بحساسيته العالية وإنتاجيته العالية ، التحليل المستهدف وغير المستهدف للمستقلبات في المنتجات الطبيعية ، حتى مع تركيزالتتبع 25. لذلك ، يستخدم مرض التصلب العصبي المتعدد حاليا على نطاق واسع في مجال كيمياء الطب الصيني التقليدي (TCM). يمكن أن يوفر البحث النوعي والكمي حول التركيب الكيميائي للطب الصيني التقليدي معلومات حول مكونات الدواء والمركب المرتبط به ، والذي لا يوفر مرجعا مناسبا للبحث الدوائي فحسب ، بل يوفر أيضا الأساس لبناء نظام معايير الجودة ل TCM26. إلى جانب ذلك ، في المنتجات الطبيعية ، ترتبط التوقيعات الأيضية عادة بالخصائص المورفولوجية والنسيجية27 ؛ لذلك ، من المفيد جدا إجراء تحليل في الموقع لتحديد آلية واستجابة النباتات لمختلف ظروف الإجهاد الحيوي وغير الحيوي28. ومع ذلك، نظرا لأن عينات تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد التقليدي هي حلول لمقتطفات من منتج طبيعي معين أو أجزائه المحددة، فإن التصلب المتعدد لا يحصل على معلومات فيما يتعلق بالتوزيع المكاني أو الزماني للمستقلبات في العينات. تحصل تقنية MSI ، وهي تقنية جديدة نسبيا تم تطويرها قبل عقدين فقط ، على المستقلبات من عينات المنتجات الطبيعية ، وتحلل المعلومات الجزيئية نوعيا وكميا ، وتسجل المعلومات الزمانية المكانية. بعد ذلك ، بمساعدة أدوات رسم الخرائط ، يمكن محاكاة إحداثيات 2D أو 3D لجزيئات معينة29.

تقنية DESI-MSI المستخدمة في هذه الدراسة هي تقنية MSI جديدة تم تطويرها في عام 2004 من قبل مجموعة Cooks في جامعة بوردو (الولايات المتحدة الأمريكية) 30. بالمقارنة مع تقنيات MSI الأخرى المستخدمة في وقت مبكر ، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي (SIMS) 31 ، والتأين بالامتزاز بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) 32 ، والتأين بالرش الكهربائي بالاجتثاث بالليزر (LAESI) 33 ، فإن DESI له العديد من المزايا. يحتاج كل من SIMS و MALDI إلى بيئة فراغ عالية لتأين العينات ، وبالنسبة ل MALDI ، يجب تركيب العينات على سطح موصل7. إلى جانب ذلك ، يتضمن تحضير العينة لجميع هذه التقنيات الثلاث عدة خطوات معقدة. تعتمد DESI ، كتقنية ESI جديدة ، على مبدأ التأين الناعم المشابه للتأين بالرش الكهربائي (ESI) في قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) 30. لذلك ، فإن الأيونات المكتشفة هي في الغالب أيونات شبه جزيئية ، ويمكن أيضا إجراء التجزئة إذا لزم الأمر ، مما يتغلب على عيب التأين الصلب في تقنية SIMS ، مما يولد أيونات ثانوية قد تهين فقدان المعلومات7. يعمل DESI في الظروف المحيطة ، لذلك لا يحتاج إلى الكثير من الوقت للوصول إلى حالة العمل بعد وضع العينات في الجهاز. بسبب مبدأ التأين المدمر المصغر ، من الممكن إجراء التجارب بشكل متكرر على عينة واحدة ، وبالتالي لا توجد حاجة إلى عينات إضافية للوضع الثاني (سلبي أو إيجابي).

توضح هذه المقالة بشكل أساسي طريقة فعالة من حيث التكلفة لإعداد عينات النبات والتصوير باستخدام تقنية DESI-MSI. في هذه الطريقة ، لا يلعب سمك المقطع العرضي للعينة أي دور رئيسي ؛ بدلا من ذلك ، يعد السطح المسطح للعينة أمرا بالغ الأهمية ، وهو ما يضمنه شطيرة فراغ الهواء. في حالة النباتات ، يمكن تحقيق تحضير عينات DESI بطرق مختلفة وتلعب دورا رئيسيا في تصوير مرض التصلب العصبي المتعدد. غالبا ما تكون الأوراق مشكلة لأنها تظهر سطحا غير منتظم وناعم وبشرة شمعي ، مما قد يؤدي إلى انخفاض الإشارة أثناء التصوير ، بينما يحتوي الجذر على نسبة عالية من اللجنين ويسهل كسره أثناء التصوير. أظهرت الأعمال السابقة أن جذر S. miltiorrhiza تم تقطيعه بالتبريد على ميكروتوم cryostat عندما كان في تحليل DESI-MSI ، في حين تم تحضير الورقة عن طريق طباعة34. ومع ذلك ، قد تؤدي طريقة الطباعة إلى فقدان شدة الإشارة أثناء تصوير MSI بسبب الذوبان السريع للمستقلبات المودعة على سطح الزجاج. مع هذا البروتوكول (الخطوة 1.2) ، كما هو متوقع ، تظل أقسام الجذر (الشكل 4A ، B) والورقة (الشكل 4E ، F) سليمة أثناء تصوير MS. إلى جانب ذلك ، فإن طريقة تحضير العينات ، عن طريق التقسيم الخلوي باستخدام ميكروتوم cryostat ، عالية التكلفة بسبب الآلة باهظة الثمن.

على الرغم من أن طريقتنا لها العديد من المزايا مقارنة بالتقنيات الأخرى ، إلا أنه لا تزال هناك بعض القيود. أولا ، يتطلب القطع اليدوي للعينات (الخطوة 1.1) ممارسة للحفاظ على سمك المقطع العرضي مناسبا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاستبانة المكانية وكثافة الذروة ل DESI منخفضة نسبيا مقارنة ب MALDI. على الرغم من النقص ، فإن جميع المزايا تجعل تقنية DESI طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في التوزيع الزماني المكاني للمستقلبات في النباتات. علاوة على ذلك ، تم استخدام DESI-MSI بالفعل في مجال الطب وعلم الأحياء الدقيقة وكيمياء المنتجات الطبيعية35. مع تزايد الشعبية والتحسن السريع في عدة أبعاد لهذه التقنية ، ستحصل على المزيد والمزيد من التطبيقات في جميع المجالات النسبية في المستقبل7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة سيتشوان (رقم 2022NSFSC0171) وبرنامج Xinglin Talent التابع لجامعة تشنغدو في TCM (رقم 030058042).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Fisher CAS:67-63-0 HPLC grade
Acetonitrile Sigma-aldrich Number-75-05-8 LC-MS grade
Adhesion Microscope slides Citotest scientific 80312-3161 Microscope glass slides  can adhere to  the sample 
Air cooled dry vacuum pump EYELA FDU-2110 Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid ACS F1089 | 64-18-6 LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin) Waters 186006013-1 LC-MS grade
Methanol Sigma-aldrich Number-67-56-1 LC-MS grade
Parafilm  Bemis Company sc-200288 Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde Sigma-aldrich V900894 Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source Waters Synapt XS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
  3. Qiu, Z. -D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
  4. Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
  5. Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
  6. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
  7. Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
  8. Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
  9. Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
  10. Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
  11. Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
  12. Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
  13. Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
  14. Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
  15. Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
  16. Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
  17. Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
  18. Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
  19. Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
  20. Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
  21. Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
  22. Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
  23. Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
  24. Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
  25. Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
  26. Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
  27. Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
  28. Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
  29. Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
  30. Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
  31. Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
  32. Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  33. Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
  34. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  35. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 190 ،
تصور المستقلبات المحددة في الأيض المكاني للطب الصيني التقليدي باستخدام DESI-MSI
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, B., Chen, L., Lv, F., Pan, Y.,… More

Xu, B., Chen, L., Lv, F., Pan, Y., Fu, X., Pei, Z. Visualization of Metabolites Identified in the Spatial Metabolome of Traditional Chinese Medicine Using DESI-MSI. J. Vis. Exp. (190), e64912, doi:10.3791/64912 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter