Summary
Dette papir beskriver protokoller til konstruktion og drift af et køletrin for at immobilisere C. elegans på deres originale dyrkningsplader en masse.
Abstract
Højopløselige in vivo-mikroskopimetoder kan afsløre subtile oplysninger og fine detaljer inde i modeldyret Caenorhabditis elegans (C. elegans), men kræver stærk dyreimmobilisering for at forhindre bevægelsessløring i billederne. Desværre kræver de fleste nuværende immobiliseringsteknikker en betydelig manuel indsats, hvilket giver billeddannelse i høj opløsning lav gennemstrømning. Immobilisering af C. elegans er stærkt forenklet ved hjælp af en kølemetode, der let kan immobilisere hele populationer direkte på deres dyrkningsplader. Køletrinnet kan etablere og opretholde en lang række temperaturer med en ensartet fordeling på dyrkningspladen. I denne artikel dokumenteres hele processen med at opbygge køletrinnet. Målet er, at en typisk forsker uden problemer kan opbygge et operationelt køletrin i deres laboratorium efter denne protokol. Udnyttelse af køletrinnet efter tre protokoller vises, og hver protokol har fordele for forskellige eksperimenter. Der vises også et eksempel på køleprofil af scenen, når den nærmer sig sin endelige temperatur og nogle nyttige tip til brug af køleimmobilisering.
Introduction
Højopløselig optisk mikroskopi giver et uundværligt værktøj til at studere in vivo biologiske strukturer på subcellulært niveau. Mange biologiske undersøgelser kræver submikronopløsningsbilleddannelse for at løse subtile anatomiske detaljer, herunder neuronmorfologi 1,2, membranstruktur3,4 og proteinlokalisering 5,6. Et billede i høj opløsning kræver en eksponeringstid på flere millisekunder til sekunder afhængigt af billedbehandlingsmodaliteten og sonden 7,8. For at opnå optimale resultater er det vigtigt omhyggeligt at planlægge og gennemføre mikroskopibaserede eksperimenter. Afgørende for denne indsats er en effektiv dyreforberedelsesmetode, der letter billeddannelse i høj opløsning.
Nematoden C. elegans er en meget anvendt modelorganisme til at studere mange biologiske processer9. Dette lille dyr dyrkes typisk på nematode vækstmedium (NGM) agarplader, og de reproducerer hurtigt ved selvbefrugtning, hvilket gør dem velegnede til store undersøgelser. Deres gennemsigtighed og en bred vifte af mærkningsteknikker tillader ligefrem visualisering af deres interne anatomi10,11. De fine strukturer i C. elegans er ideelle til at studere biologiske processer på subcellulært niveau, såsom neuron regenerering 12, neuron degeneration13 og celledeling14. Sådanne undersøgelser kræver billeddannelse ved submikronopløsning og dyreimmobilisering, der er stærk nok til at forhindre billedsløring. Stærk immobilisering er især afgørende for teknikker, der involverer flere billeder i rum eller tid, såsom 3D-billedstakke (dvs. z-stakke) og time-lapse-billeddannelse. Enhver dyrebevægelse mellem eksponeringerne kan skjule resultatet. For C. elegans involverer stærk immobilisering typisk manuel manipulation af individuelle dyr og montering af dem på dias med et bedøvelsesmiddel15,16. Disse tids- og arbejdskrævende procedurer gør store eksperimenter meget vanskelige. En immobiliseringsstrategi, hvor dyr direkte og reversibelt immobiliseres på deres originale dyrkningsplader, kan muliggøre billeddannelse med høj kapacitet og høj opløsning.
Køling immobilisering af C. elegans er blevet vist i nogle få undersøgelser, men er ikke bredt udnyttet. Det kombineres normalt med en mikrofluidisk enhed for yderligere at fastholde dyr17,18,19. Imidlertid er mikrofluidiske enheder komplekse, kræver betydelig operationel træning og kan ikke let integreres med typiske faste dyrkningsarbejdsgange i C. elegans-eksperimenter. Således anvendes mikrofluidik ikke i vid udstrækning til C. elegans immobilisering. Præsenteret her, i forbindelse med Chung Laboratory's nylige publikation20, er introduktionen af en ny køleimmobiliseringsmetode ved hjælp af et termoelektrisk køletrin (figur 1) for at løse disse mangler. Med køletrinnet kan en typisk 60 mm polystyrendyrkningsplade køles ned til enhver måltemperatur (T-indstilling) mellem -8 °C og stuetemperatur. Denne kølefasetilgang kan let og reversibelt immobilisere en hel dyrepopulation med minimal brugerindsats, hvilket eliminerer 98% af dyrebehandlingstiden20.
Nedenfor beskrives procedurerne for opbygning af et køletrin fra bunden. Bortset fra bearbejdning af dele og 3D-print forventes hele proceduren at tage 4 timer uden krav om specialværktøj eller ekspertise. Derefter beskrives yderligere tre forskellige kølestrategier med varierende kølehastigheder og brugerbestræbelser på at immobilisere C. elegans på et typisk opretstående mikroskop. Den foretrukne strategi kan afhænge af brugerapplikationen. Protokollerne for disse tre køleimmobiliseringsstrategier er beskrevet detaljeret.
Protocol
1. Fremstilling og klargøring af hver komponent i køletrinnet
BEMÆRK: Køletrinnet består af flere komponenter (se materialetabel). De fleste af komponenterne er hyldevarer. Safirvinduet kræver en brugerdefineret ordre, mens kobberpladen, holdebeslaget og isoleringspladen kan fremstilles på stedet med en computer numerisk kontrolmølle eller 3D-printer. Efter den indledende fremstilling tager den senere monteringsproces omkring 2-3 timer.
- Brug en computer numerisk kontrolmølle til at bearbejde kobberpladen fra en 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9% ren kobbermetalplade (figur 2A). 2D-tegningen til denne fremstilling findes i den supplerende fil 1. Brug finkornet sandpapir til at fjerne skarpe kanter og snavsede rester.
- Til fremstilling af holdebeslaget og isoleringspladen skal du bruge en 3D-printer og polymælkesyrefilament (PLA) med en diameter på 1,75 mm (figur 2B, C). For bedre kvalitet skal 3D-printeren give en laghøjde finere end 0,2 mm.3D modeller findes i supplerende fil 2 og supplerende fil 3.
2. Konstruktion af vandkølingsenheden
- Forbered det platinhærdede silikonerør, pumpetank, kobberkøleblok og radiator (figur 3A) til opbygning af vandkøleenheden. Forbered et barberblad, saks og hex-nøgle klar til brug. Vær opmærksom på elektriske farer på grund af brugen af vand under hele samlingen.
- Skær silikonerøret i tre sektioner med foreslåede længder på 40 cm, 50 cm og 80 cm. Juster længden, når det er nødvendigt.
- Sæt silikonerørsektionerne fra trin 2.2 i portene på radiatoren, pumpetanken og kobberkøleblokken som vist i figur 3B. Sørg for, at alle tilslutninger er vandtætte. Vandkølingsenheden er nu bygget.
- Forbered vandkøleenheden, en 12 V strømforsyning, tre røde og tre sorte jumperledninger, et brødbræt og 500 ml renset vand.
- Sørg for, at arbejdsbordet er fri for væske af hensyn til elektrisk sikkerhed.
- Tilslut pumpetankene og radiatorens ledninger til 12 V-strømforsyningen gennem brødbrættet (figur 3C). Brødbrættet bruges for nemheds skyld.
BEMÆRK: For en mere permanent og sikker forbindelse kan forskere udskifte brødbrættet med loddetråd. - Åbn pumpetankdækslet ved hjælp af en fladskruetrækker. Brug en tragt til at tilsætte vand, indtil pumpetanken er ca. 80% fuld (figur 3D). Sæt ikke låg på pumpetanken efter denne påfyldning.
- Tænd for vandkøleenheden ved at tilslutte 12 V-strømforsyningen eller tænde den (hvis der er en kontakt). Efter opstart strømmer vandet inde i samlingen, og ventilatorerne på radiatoren skal blæse.
- På grund af vandstrømmen fra pumpetanken falder væskeniveauet i tanken. Tilsæt mere vand til pumpetanken, indtil den stabiliserer sig ved næsten 2/3 fuld (figur 3E).
- Ryst radiatoren for at slippe af med luftbobler, og dæk derefter køletanken.
- Sluk for strømforsyningen, før du går til næste trin.
3. Test af Peltier kolde og varme overflader
BEMÆRK: Peltier, en nøglekomponent i køletrinnet, er en solid state aktiv varmepumpe, der overfører varme fra den ene side til den anden21. Den ene overflade af Peltier bliver varm, og den anden overflade bliver kold, når den leverer elektrisk strøm. Som standard markerer Peltier-producenter den kolde overflade, før de sælger, men det er stadig nyttigt at teste den manuelt inden montering.
- Forbered den justerbare strømforsyning og Peltier, som vist i figur 4A.
- Sørg for, at den justerbare strømforsyning er slukket for at forhindre mulige elektriske farer.
- Tilslut den røde ledning på Peltier til den positive udgang og den sorte ledning til den negative udgang fra den justerbare strømforsyning med alligatorklemmer, der leveres med strømforsyningen (figur 4B).
- Tænd for den justerbare strømforsyning, og indstil den til ca. 2 V ved at modulere både spændings- og strømknapperne på strømforsyningens øverste række. Brug straks en bar finger til at føle på de to overflader af Peltier. En overflade bliver kold inden for få sekunder.
- Når du har identificeret, hvilken overflade der er kold, skal du straks slukke for strømforsyningen og afbryde Peltier.
- Brug en markør til at angive den kolde overflade til fremtidig samling.
4. Konstruktion af enheden til afkøling af Peltier ved hjælp af vandkølingsenhed
- Som vist i figur 4A skal du forberede den slukkede vandkøleenhed, Peltier (kold overflade markeret) og termisk pasta (for forbedret termisk ledning).
- Rengør alle overflader på kobberkøleblokken med 70% ethanol (eller anden renere opløsning) i vandkøleenheden.
- Påfør omkring 0,4 g termisk pasta på en overflade af kobbervandkøleblokken, og sørg for, at denne overfladeorientering forhindrer rørene i at krydse eller bøje, når de vender nedad. Brug en handske til at beskytte huden, og prøv at fordele den termiske pasta tyndt og jævnt (figur 4C).
- På samme måde skal du rengøre den varme overflade af Peltier og derefter anvende den termiske pasta på overfladen (figur 4D).
- Tilslut Peltiers varme overflade til kobberkøleblokkens overflade med termisk pasta. Anvend pres for at sikre, at det er sikkert. Følg retningen af ledningerne på Peltier og rørene på kobberkøleblokken, som vist i figur 4E. Rengør overskydende termisk pasta.
- Hold både 12 V-strømforsyningen og den justerbare strømforsyning slukket. Tilslut Peltier til den justerbare strømforsyning, som i afsnit 3.
- Kontroller både de elektriske og vandkølende tilslutninger igen, og tænd derefter 12 V strømforsyningen og den justerbare strømforsyning sekventielt.
- Drej gradvist den justerbare strømforsyning til 12 V. Med den foreslåede Peltier skal strømmen være omkring 7,3 A.
- Vent i 2 minutter; temperaturen på Peltiers kolde overflade bør blive koldere end -35 °C. Mål denne temperatur med et infrarødt termometer (figur 4F). Rør ikke ved den kolde overflade for at forhindre skade på hænderne.
- Kontroller alle tilslutninger og komponenter, hvis temperaturen ikke kan nå under -30 °C. Luftbobler inde i vandkøleenheden er en mulig årsag til suboptimal køleydelse.
- For at sikre sikkerheden i senere trin skal du slukke for den justerbare strømforsyning, vente 1 minut og derefter slukke for 12 V-strømforsyningen.
5. Konstruktion af kobberplade og safirvinduessamling
- Forbered kobberpladen, safirvinduet med en diameter på 80 mm, termisk pasta, et 4 tommer bredt bånd og et skarpt blad til skæring (figur 5A).
- Rengør forsigtigt kobberpladen og safirvinduet med 70% ethanol, og brug finkornet sandpapir til at glatte ru overflader.
- Påfør den termiske pasta på tre indre overflader, som vist i figur 5B. Sørg for, at den termiske pasta dækker alle tre overfladearealer, men ikke er for tyk, omkring 0,5 mm.
- Læg kobberpladen på bordpladen beskyttet med printerpapir. Papiret gør den senere oprydning lettere.
- Indsæt safirvinduet i kobberpladehullet (figur 5C). Sørg for, at safiren ikke roterer under indsættelsen for at forhindre, at den termiske pasta bevæger sig til andre områder. Fjern overskydende termisk pasta.
- Fastgør det 4 tommer brede bånd til den øverste overflade af kobberplade-safirvinduesenheden (overfladen, der har det firkantede fordybningsområde, som vist i figur 5D). Undgå luftbobler mellem båndet og kobberoverfladerne under klistring ved at lede vedhæftningen langsomt fra den ene side til den anden.
- Klip de angivne blå stiplede områder af båndet ud ved hjælp af et skarpt blad efter figur 5E. Skæring blotlægger de to trådhuller, den firkantede fordybning og safirvinduets areal på 70 mm i diameter.
- Tape den nederste overflade af kobberplade-safirvinduesenheden til, og gentag derefter skæreproceduren (kun safirarealet) på denne overflade som vist i figur 5F.
BEMÆRK: Nu er safirvinduet fastgjort til kobberpladen, og kobberoverfladerne er beskyttet mod rust.
6. Afsluttende samling af køletrin
- Sørg for, at alle vigtige underenheder og komponenter er klar.
- Påfør ca. 0,4 g termisk pasta på kobberpladens firkantede fordybning (figur 6A).
- Påfør ca. 0,4 g termisk pasta på den kolde overflade af Peltier. Bemærk, at Peltier allerede er fastgjort til kobberkøleblokken (figur 6B).
- Tilslut Peltiers kolde overflade til kobberpladefordybningen med nedadgående tryk. Rengør al overskydende termisk pasta (figur 6C).
- Monter det 3D-printede beslag på toppen af kobberkøleblokken, og brug derefter en hex-nøgle til at stramme to 8-32, 0,5 tommer lange skruer til at fastgøre beslaget til kobberpladen (figur 6D). Brug tilspænding med lavt drejningsmoment, så det trykte beslag ikke går i stykker eller deformeres for at sikre korrekt termisk ledning fra Peltier til kobberet.
- Anbring kobberpladen i den 3D-printede isolationsbase for termisk isolering fra bordpladen eller mikroskopbasen under drift (figur 6D).
- Køletrinnet er samlet og klar til brug (figur 6E).
- Til mikroskopi placeres det færdige køletrin på en opretstående mikroskopplatform (figur 7A).
- Montering af køletrinnet er afsluttet. Yderligere detaljer er tilgængelige fra Chung Laboratory's ledsagende publikation, som fuldt ud karakteriserer de detaljerede strategier og dyrebevægelser20.
BEMÆRK: I de følgende afsnit diskuteres langsomme, hurtige og pludselige køleprotokoller. N2-hermafroditter ved L4 eller ung voksenalder blev anvendt til at producere følgende data. Strategien for langsom afkøling er nyttig til immobilisering af 20 °C dyrkede N2-dyr ved 6 °C; 15 °C-dyrkede N2-dyr er stærkest immobiliseret ved 1 °C20. En kort sammenligning mellem disse tre køleprotokoller er vist i tabel 1.
7. Langsom afkøling immobiliseringsprotokol
- Flyt dyrkningspladen med låg til et køleskab på 4 °C.
- Når du har flyttet dyrkningspladen til køleskabet, skal du tænde for køletrinnets 12 V strømforsyning og indstille den justerbare strømforsyningsspænding til 5,5 V.
- Når dyrkningspladen med låg har ligget i 4 °C-køleskabet i 1 time, overføres pladen straks til afkølingstrinnet, og låget fjernes (figur 7A). Sådanne dyrkningsplader er normalt omkring 6 ° C. Det forkølede trin er stabilt og koldt nok til at holde agaroverfladen ved 6 °C.
- Hvis agarens overfladetemperatur ændrer sig, målt eller ved at notere dyrenes bevægelser, justeres spændingen lidt, indtil den stabiliseres ved 6 °C.
- Dyrene er korrekt immobiliseret på overførselstidspunktet.
8. Hurtig afkøling immobiliseringsprotokol
BEMÆRK: Hurtigkølingsstrategien er den mest grundlæggende immobiliseringsmetode (se film 1); agarplader indtager imidlertid passivt scenen i længere tid, mens de nårT-sættet. Når der er behov for en stærk immobilisering, ogT-sættet er 6 °C, forlænges tomgangstiden til ca. 1 time20.
- Tænd for køletrinnets 12 V strømforsyning, og indstil den justerbare strømforsyningsspænding til omkring 12 V. Vent i 10 minutter.
- Bring en dyrkningsplade fra inkubatoren direkte til køletrinnet og fjern låget.
- Når agarens overfladetemperatur falder til (T-sæt + ΔT) °C, justeres den justerbare strømforsyning tilV-indstillingen, og vent, indtil agaren nårT-indstillet. V-sættet er den passende spænding til stabilisering af agaren vedT-sæt. ΔT er en variabel, der forhindrer overkøling. Se tabel 2 for kombinationen af T-sæt, ΔT ogV-sæt.
BEMÆRK: Dataene i tabel 2 vedrører specifikt Chung Laboratory, og det skal derfor bemærkes, at eksperimentelle parametre kan variere baseret på de unikke miljø- og brugsforhold for hvert enkelt eksperiment. - Dyr immobiliseres, når agaren nårT-sæt. Immobilisering forbedres med tiden indtil ~ 50 minutter efter initiering af afkøling.
9. Abrupt afkølingsimmobiliseringsprotokol
BEMÆRK: Den pludselige kølestrategi bruger mest brugertid, men immobiliserer dyr hurtigst fra deres dyrkningstemperatur.
- Tænd for køletrinnets 12 V strømforsyning, og drej den justerbare strømforsyningsspænding til omkring 12 V. Opbevares i 10 min.
- Bring en ledig agarplade til køletrinnet. Brug trin 8.3 i immobiliseringsprotokollen til hurtig køling til at stabilisere agaroverfladetemperaturen vedT-indstilling.
- Flyt dyrene fra deres oprindelige dyrkningsplade til den afkølede plade, der sidder på køletrinnet.
- Baseret på den lille dyrestørrelse forventes dyrene at afkøle tilT-indstilling på få sekunder og blive immobiliseret. Immobilisering forbedres med tiden indtil ~ 50 minutter efter initiering af afkøling.
10. Genoplivning af dyr efter afkøling immobilisering
- Flyt den afkølede kulturplade tilbage til den oprindelige inkubator eller til stuetemperatur.
- Vent i 20 minutter til 1 time, indtil alle ormene på pladen genopliver deres normale kravle- og fodringsadfærd.
Representative Results
Måling af køletemperatur
For de indledende køleimmobiliseringseksperimenter er det vigtigt at spore agaroverfladetemperaturen for at sikre, at dyrene kan immobiliseres korrekt. Fremtidige eksperimenter, der replikeres fra den oprindelige, kan bruge de samme parametre, normalt uden hyppig temperatursporing. Til temperaturmåling steriliseres termoelementspidsen på termometeret ved hjælp af 70% ethanolopløsning og venter, indtil ethanolen fordamper helt, før den bruges. Derefter indsættes termoelementspidsen 1 mm i NGM-agaren for at sikre en nøjagtig temperaturaflæsning. Termometerspidsen holdes ved hjælp af en klemmeholder eller andre holdere (figur 7B).
Temperaturmåling med et infrarødt kamera
Køletrinnet er designet til at sikre, at temperaturfordelingen i pladens centrale 40 mm diameter er ensartet. Et fremadrettet infrarødt kamera (FLIR) bruges til at afbilde temperaturfordelingen på agaroverfladen. Den maksimale temperaturforskel er omkring 1 °C, nårT-indstillingen er 1, 3 eller 6 °C (figur 8A).
Vurdering af kølehastigheden med strategien for hurtig køling
Den hurtige kølestrategi bruges til at karakterisere kølehastigheden for et trin ved 12 V. En 20 ° C plade placeres på køletrinnet, og et termoelementtermometer bruges til at spore overfladetemperaturen. Trinnet køler 20 °C-pladerne ned til 6 °C på 6 minutter, til 1 °C på 10 minutter og stabiliserer sig til sidst under -7 °C på ca. 40 minutter (figur 8B).
Brug af køletrinnet på en opretstående mikroskopplatform
Et opretstående mikroskop omfatter typisk et mål for billeddannelse, et stadium til prøveopbevaring og belysning. Dette køletrin er designet til brug på et typisk opretstående mikroskoptrin med nem indsættelse og fjernelse (figur 8C). Når køleimmobilisering er nødvendig til billeddannelse eller screening, placeres køletrinnet simpelthen på mikroskoptrinnet for at afslutte afdraget og omvendt.
Immobilisering af orme på kølepladen er vist i film 1.
Figur 1: 3D-model af køletrinsapparatet. Elektroniske forbindelser vises ikke for klarhedens skyld. En tank pumper vand gennem køleblokken for at fjerne varme, der overføres af Peltier, der er indlejret i scenen. En typisk 60 mm polystyrendyrkningsplade kan sidde på det gennemsigtige safirvindue og afkøles efter trin. Model genereret i Solidworks. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: 3D-modeller af komponenter, der skal fremstilles. (A) Kobberplade. (B) 3D-printet holdebeslag. C) 3D-printet isoleringsplade. Modeller genereret i Solidworks. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vandkøleenhed . (A) Individuelle komponenter. Rør skåret til bestemte længder. B) Tilsluttede vandkølekomponenter. (C) Ledninger, der forbinder pumpetanken og radiatoren med 12 V strømforsyningen. Generelt forbinder røde ledninger til den positive ende og sorte ledninger til den negative ende. (D) Renset vand hældes i pumpen. (E) Tanken fyldes til mere end to tredjedele for optimal pumpeeffektivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tilslutning af Peltier og vandkølingsenhed. (A) Komponenter til betjening af Peltier. (B) Brug af den justerbare strømforsyning til at bestemme de varme og kolde sider af Peltier. For sikkerheden anvendes ikke mere end 2 V. (C) Jævn påføring af termisk pasta på overfladen af kobberblok. (D) Jævn påføring af termisk pasta på Peltiers varme overflade. (E) Den varme side af Peltier presset på kobberblokken med termisk pasta. (F) Infrarødt termometer, der bruges til at måle Peltiers kolde overfladetemperatur. Ideelt set kan den kolde temperatur nå tæt på -35 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Montering af kobberpladen og safirvinduet . (A) Påkrævede komponenter. (B) Termisk pasta påført tre indre overflader af kobberpladen, hvor safirvinduet kommer i berøring. To nedadrettede billeder af kobberpladen, der viser placeringen af de tre overflader. (C) Safirvindue i kobberpladehullet. D) Tape påført enhedens overside. (E) Overside: Blå stiplede linjer angiver de steder, hvor tape skal klippes og fjernes: firkantet fordybning, to huller og et safirområde med en diameter på 70 mm. (F) Underside: Tapen klippes og fjernes som vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Endelig samling i køletrinnet . (A) Termisk pasta påført kobberpladens fordybning. (B) Termisk pasta påført den kolde side af Peltier. (C) Kold overflade af Peltier forbundet med depressionen. D) Kobberkøleblok fastgjort til kobberpladen ved hjælp af skruer. Køletrin i isolationsbasen. E) Afsluttet afkølingsfase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Afkølingstrin på mikroskop og termoelementmåling . (A) Køletrin placeret på mikroskopbasen til billeddannelse. Safirvinduet er gennemsigtigt, hvilket tillader transillumination. (B) Termoelementtermometer, der anvendes til måling af NGM agars overfladetemperatur. Spidsen indsættes ca. 1 mm i NGM-agaren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Karakterisering og anvendelse af køletrin . (A) Termiske billeder, der viser agaroverfladen afkølet til 1, 3 og 6 °C. Jævn temperaturfordeling inden for det centrale område på 40 mm (hvid stiplet cirkel). B) NGM-agaroverfladens temperatur over tid på afkølingstrinnet ved 12 V. NGM agar-overfladen kan afkøles til under -7 °C. Temperatur målt efter metoden i figur 7B. C) Afkølingstrin i brug på et typisk opretstående mikroskop. Køletrinnet kan let installeres eller fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.
| langsom afkøling | hurtig afkøling | abrupt afkøling | |
| Stage besættelse | minimum | lang | Medium |
| tid, indtil dyrene er immobiliseret | lang | Medium | meget kort |
| immobilisering styrke | stærk | Medium | Medium |
| Brugerindsats | minimum | lidt mere end minimum | maksimal |
Tabel 1: Sammenligning af kølestrategier.
| T-sæt (°C) | ΔT (°C) | V-sæt (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
Tabel 2: Parametre for at opnå den ønskede temperatur i hurtigkølingsstrategien.
Supplerende fil 1: Kobberplade i metrisk. A2D tegning til bearbejdning af kobberpladen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Holdebeslag. En 3D-tegning af et holdebeslag, der kan åbnes eller ændres af Solidworks og eksporteres til 3D-printsoftware. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Isolationsplade. En 3D-tegning af en isoleringsplade, der kan åbnes eller ændres af Solidworks og eksporteres til 3D-printsoftware. Klik her for at downloade denne fil.
Film 1: Køling af video. Immobiliseringsorme på NGM-agarpladen ved 2 °C. Pladen blev kølet ned fra stuetemperatur til 2 °C og forblev ved 2 °C i flere minutter. Derefter blev køletrinnet slukket, og pladerne begyndte at varme op til stuetemperatur naturligt. Videoen er speeded op med 10x til at passe en 1 time video i 6 min. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende tabel 1: Prisoverslag Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Fremstilling, samling og brug af køletrinnet er vist i dette manuskript. De fleste af komponenterne er hyldevarer, der kan købes online. Nogle komponenter, som kobberpladen og safirvinduet, har brug for en brugerdefineret ordre og kan tage op til 1 måned at fremstille. Andre komponenter, der kan 3D-printes, fremstilles let i de fleste forskningsinstitutioner (supplerende tabel 1). Monteringsprocessen kræver kun få værktøjer og kan hurtigt udføres af en ikke-ekspert på få timer. Således bør de fleste biologiske laboratorier nemt kunne implementere denne enhed.
Køletrinnet og køleimmobiliseringsmetoden har flere væsentlige forbedringer i forhold til eksisterende immobiliseringsmetoder, omhyggeligt beskrevet i den oprindelige publikation20. Kort sagt muliggør afkølingsfasen stærk immobilisering af store populationer af C. elegans i alle aldre, herunder embryoner og dauers, på deres typiske dyrkningsplader under standard mikroskopiarbejdsgange. Det eliminerer behovet for komplekse hardwareopsætninger, som mikrofluidik, samtidig med at det giver en stærkere immobiliseringseffekt. Derudover minimerer det den mulige giftige kemiske eksponering for dyr og forskere, da der ikke anvendes kemikalier, samtidig med at det giver en lignende immobiliseringseffekt. Disse tekniske muligheder muliggør bred anvendelse af denne enhed og tilgang til mange forsøg, der kræver høj opløsning in vivo mikroskopi på et stort antal dyr.
Der er nogle kritiske trin under opbygningen af enheden, herunder al termisk pastaapplikation og det brede bånd til fastgørelse af safirvinduet til bødkerpladen. Den termiske pasta sikrer stærk varmeledningsevne ved at erstatte huller med et materiale med lav termisk modstand. For at opnå den ønskede køleydelse skal pastaen indføres korrekt mellem alle tilstødende / kontaktflader, herunder Peltier-koldoverfladen til kobberpladen, Peltier-den varme overflade til kobberkøleblokken og kobberpladen til safirvinduet. Det brede bånd, der påføres scenen, isolerer kobberpladen for at forhindre opvarmning fra luft og kondens, hvilket fører til rust. Det styrker også forbindelsen mellem safirvinduet og kobberpladen. Således kræver både påføring af termisk pasta og det brede bånd ekstra pleje.
I et faktisk køleimmobiliseringseksperiment afhænger parametrene i dette manuskript, såsom spændinger og tider, af dyrkningspladernes og stadiets specifikke egenskaber, såsom mængden af agar i pladerne, trinets effektivitet og omgivelsestemperatur og fugtighed. I fremtidige modifikationer kan en feedback-controller installeres, som en proportional-integral-derivat (PID), for aktivt at justere spændingsindgangen til køletrinnet for at opnå den ønskede temperatur og stabilisere den.
Der er flere begrænsninger ved denne køletrins immobilisering, omhyggeligt beskrevet i den oprindelige publikation20. Kort sagt immobiliseres dyr, der opdrættes ved forskellige temperaturer, i forskellige grader, hvilket kan kræve ekstra finjustering. Dette nuværende køletrin er heller ikke designet til et omvendt mikroskop. Endvidere kan billeddannelse eller screening på en dyrkningsplade direkte medføre forurening af pladen.
Vi designer nye versioner af køletrinnet, der passer til forskellige billeddannelsesplatforme, herunder sammensatte opretstående mikroskoper og inverterede mikroskoper. Disse nye designs vil muliggøre direkte dyrekøling, immobilisering på kulturplader under billeddannelse på disse platforme. Billeddannelsen på disse køletrin vil bruge lange arbejdsafstandsluftnedsænkningsmål, svarende til den opretstående konfiguration. I dag kan luftnedsænkningsmål have en numerisk blænde på op til 0,9, hvilket giver omkring en opløsning på 300 nm til grøn fluorescensproteinbilleddannelse. Således kunne kombinationen af et nyt køletrin med et mikroskop tillade submikronopløsning fluorescensbilleddannelse rutinemæssigt.
Vi giver også nogle nyttige tip til brug af køletrinnet i henhold til vores erfaring. For eksempel bør enkeltpersoner kontrollere, om der er luftbobler inde i vandkølingsenheden. Luftbobler nedbryder kølingen til Peltiers varme overflade og forringer dermed køletrinnets køleeffektivitet. Hvis der er luftbobler, skal 12 V strømforsyningen tændes for at få vandet til at strømme, og alle komponenter i vandstrømmen skal rystes. Luftbobler kan skylles ud fra fangede områder og udluftes af pumpetanken. Forskere bør sikre, at vandstrømsrøret ikke bøjes eller krydses, når vandkøleenheden samles. Rørbøjning eller krydsning kan forhindre tilstrækkelig vandstrøm og reducere køleeffektiviteten. Rørforbindelser skal være korrekt pasform og tætte. Om nødvendigt kan et blødt rør med en anden diameter bruges i stedet for at sikre tæthed. Indsæt bør ikke anvendes, selvom forbindelsen ikke er tæt nok, da pasta kan indføre træsko under fremtidig brug. Rumfugtigheden påvirker køleydelsen og introducerer kondens og is på køletrinnet. Før du placerer en dyrkningsplade på køletrinnet, anbefales det at bruge et papirvæv til at fjerne kondens eller bruge en køleplade til hurtigt at fjerne is, der er dannet på safirvinduet. Pumpetanken og radiatorventilatorerne kan forårsage små vibrationer i mikroskopet, hvis de arbejder på samme bord. Mikroskopvibrationer slører det erhvervede billede og bør derfor undgås. En pude kan bruges til mekanisk isolering af tanken og radiatoren, eller de kan placeres på et separat nærliggende bord. Køletrinnet kan blive et opvarmningstrin ved at vende den elektriske forbindelse til Peltier.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkender Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) for kobberpladebearbejdningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
