Summary
Den præsenterede cervikale manipulationsmetode kan fremkalde pseudograviditet hos mus uden behov for avlshunner med vasektomiserede hanner. Induktion af pseudograviditet er nødvendig for succes med ikke-kirurgisk embryooverførsel og ikke-kirurgisk kunstig insemination, som begge også præsenteres.
Abstract
For at kunne opretholde graviditet med ægoplægning eller kunstig befrugtning skal hunrecipientmus induceres i en pseudogravid tilstand. Hunmus parres traditionelt natten over med vasektomiserede hanner, og den følgende morgen vurderes tilstedeværelsen af en kopulationsprop. For at øge effektiviteten af at producere pseudogravide kvinder er en cervikal manipulationsteknik blevet standardiseret til at blive brugt i kombination med ikke-kirurgisk embryooverførsel eller kunstig befrugtningsteknikker hos mus. Den stumpe ende af en lille plaststang indsættes vaginalt for at kontakte livmoderhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Proceduren er hurtig og kræver ikke anæstesi eller analgesi. Denne teknik øger pålideligheden og forudsigeligheden ved at producere pseudogravide kvinder og eliminerer helt kravet om vasektomiserede mænd. For CD1-mus var effektiviteten af pseudograviditetsinduktion ved hjælp af cervikal manipulation 83% for kvinder i østrus (N = 76), men kun 38% af hunnerne i østrus blev tilsluttet af vasektomiserede mænd (N = 24). Kunstig befrugtning i CD1-mus blev udført ved østrussynkronisering med hormoner, cervikal manipulation og livmoderoverførsel af sædceller. Modtagere af kunstig befrugtning, der fik cervikal manipulation (N = 76), havde en drægtighedsrate på 72% og en gennemsnitlig kuldstørrelse på 8,3 hvalpe. Denne metode kan også anvendes til fremstilling af pseudogravide hunner til ikke-kirurgisk embryooverførsel. Derfor er inducering af pseudograviditet ved cervikal manipulation et bekvemt og effektivt alternativ til parring med en vasektomiseret mand, når der udføres ikke-kirurgiske assisterede reproduktionsteknikker. Brug af cervikal manipulation giver 3R'er (udskiftning, reduktion og forfining) fordele for assisteret reproduktionsteknikker ved at reducere antallet af krævede dyr og eliminere behovet for kirurgisk ændrede mænd.
Introduction
Assisteret reproduktionsteknologi anvendes til fremstilling af genetisk modificerede musemodeller samt genopretning af stammer fra kryopræservering, rederivation af stammer fra en kompromitteret sundhedsstatus og strategisk vivariumstyring, herunder produktion af aldersmatchede kohorter. Alle assisterede reproduktionsteknikker i mus kræver brug af pseudogravide kvindelige modtagere til embryoudvikling. Historisk set er pseudogravide modtagere blevet genereret ved parring med sterile hanner, som enten er kirurgisk vasektomiserede eller genetisk ufrugtbare, og tilstedeværelsen af en kopulationsprop vurderes den følgende morgen1. For nylig er der udviklet en protokol til sonisk stimulering hos mus til kirurgisk overførsel af pronukleære eller tocellede museembryoner2. Vi har også udviklet en cervikal manipulation (CM) protokol til brug ved kunstig befrugtning og ikke-kirurgisk embryooverførsel af blastocyster. Begrundelsen for anvendelsen af proceduren er at give en 3R-reduktion i antallet af dyr, der kræves (kræver ikke længere hanmus) og en forbedring af de anvendte teknikker (hvilket ikke længere nødvendiggør kirurgisk vasektomiprocedure for hanmus). Beskrivelsen af denne protokol inkluderer den tilhørende assisterede reproduktionsteknik til at hjælpe med integrationen af CM i normale arbejdsgange. Det overordnede mål med CM-metoden er at erstatte brugen af hanmus i genereringen af pseudogravide hunner til assisteret reproduktionsteknik, herunder kunstig befrugtning og embryooverførsel.
CM-protokollen, der beskrives her, blev først udviklet til at hjælpe med kunstig befrugtning hos mus. Den kunstige inseminationsprotokol, som oprindeligt beskrevet, opnåede en drægtighedsrate på 50% med en gennemsnitlig kuldstørrelse på 7 hvalpe3. CD1-modtagermus blev brunst synkroniseret med en lav dosis hormoner, herunder drægtige hoppererumgonadotropin (PMSG) og humant choriongonadotropin (hCG), med et interval på 47 timer før insemination. En fordel ved østrussynkronisering var, at det tillod brugen af protokollen inden for normal arbejdstid. Kvinder blev parret med vasektomiserede mænd umiddelbart efter kunstig befrugtning, og parring blev bekræftet ved tilstedeværelsen af en kopulationsprop. Inkonsekvens i parringsraten med recipienterne blev rapporteret som et problem i proceduren. Derfor blev alternativer til parring søgt til induktion af pseudograviditet.
Denne undersøgelse præsenterer en standardiseret CM-teknik til at øge effektiviteten af at producere pseudogravide kvinder. For kvinder i østrus eller proestrus indsættes den stumpe ende af en lille plaststang vaginalt for at kontakte livmoderhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Proceduren udføres på et trådstoppet bur. Ingen anæstesi eller analgesi er påkrævet. CM-teknikken er praktisk til fremstilling af pseudogravide kvinder, som kan producere kuld efter ikke-kirurgisk kunstig befrugtning uden behov for parring med vasektomiserede mænd. CM kan også anvendes til produktion af pseudogravide hunner som modtagere af embryooverførsel. Specifikt kan CM-teknikken parres med ikke-kirurgisk embryooverførsel, som beskrevet her. Ikke-kirurgiske metoder har vist sig at være effektive til embryooverførsel af blastocyst-embryoner hos mus 4,5og rotter 6,7. Da denne ikke-kirurgiske metode er et effektivt alternativ til kirurgiske metoder, betragtes det som en 3R-forfining af teknikken. Baseret på tidligere forskning indikerer fækale corticosteronniveauer som et mål for stress, at procedurens ikke-kirurgiske karakter ikke øger stressniveauet hos gnavere 7,8. Procedurerne er mindre teknisk udfordrende end kirurgisk embryooverførsel og er meget hurtigere at udføre. Da embryonerne overføres til livmoderen, skal embryoner af det korrekte stadium for livmoderudvikling overføres. For mus overføres blastocyster til 2,5 dage efter coitum (dpc) pseudogravide modtagere.
For de to ikke-kirurgiske teknikker, der er beskrevet her, er timingen af hormonadministrationen og CM-teknikken forskellig. Tidspunktet for CM-proceduren i forhold til østrus er vigtig for succes, da den erstatter naturlig parring til produktion af pseudogravide modtagere. Ved at eliminere behovet for vasektomiserede mænd til at fremkalde pseudograviditet giver denne procedure 3R-fordele ved både at reducere antallet af dyr, der kræves, og eliminere behovet for kirurgisk ændrede mænd. Selve proceduren er hurtig (30 s) og kræver ikke anæstesi eller analgesi. Teknikken øger i høj grad pålideligheden og forudsigeligheden ved at producere pseudogravide kvinder til assisteret reproduktion.
Protocol
Alle gældende internationale, nationale og institutionelle retningslinjer for pasning og brug af dyr blev fulgt. Alle procedurer udført i undersøgelser, der involverede dyr, var i overensstemmelse med de etiske standarder fra ParaTechs Corporation Institutional Animal Care and Use Committee og udført i henhold til de standarder, der er dikteret af Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Mandlige og kvindelige CD1 (ICR) og kvindelige C57Bl / 6J mus i alderen >8 uger gamle blev anvendt til denne undersøgelse. Dyrene blev hentet fra kommercielle kilder (se materialetabel).
1. Procedure for cervikal manipulation til brug ved kunstig befrugtning i CD1-mus
- Synkroniseret ægløsning af hunmus på dag 1 og dag 3
- Injicer hunmus med 2,5 IE PMSG (se materialetabel) ved intraperitoneal injektion (IP) på dag 1, 0,5 timer før starten på den mørke vivariumcyklus.
BEMÆRK: Hver mandlig donor vil give nok sæd til 10 kvindelige modtagere. - Injicer hunnerne med 2,5 IE hCG (se materialetabel) ved IP-injektion på dag 3, 1 time før starten på vivarium dark cycle.
BEMÆRK: Tidspunkterne for injektionerne, sædoverførsel og lyscyklus i forhold til hinanden er meget vigtige. De angivne tider for alle procedurer i denne protokol er baseret på en 12 timers lys/mørke-cyklus.
- Injicer hunmus med 2,5 IE PMSG (se materialetabel) ved intraperitoneal injektion (IP) på dag 1, 0,5 timer før starten på den mørke vivariumcyklus.
- Opsamling og kapacitation af frisk sæd på dag 4
- Forbered en 500 μL dråbe sædpræinkubationsmedium (PM, se materialetabel) i en 60 mm vævskulturskål under paraffinolie. Forbered en skål pr. Mandlig donor. Ligevægt i mindst 30 minutter ved 37 °C og 5% CO2 før sædopsamling.
- 1 time efter starten af vivarium-lyscyklussen aflives hannen (e) i henhold til institutionelle retningslinjer. Hver mand vil give nok sæd til 10 kunstige befrugtninger.
- Disseker hurtigt cauda epididymiderne fra musen. Udfør et tværgående abdominal snit over blæren ved hjælp af dissektionssaks og tandtang.
- Testikulære fedtpuder er placeret på hver side af blæren. Tag fat i en af testikelfedtpuderne med buede tang, og fjern testiklerne og epididymis fra kropshulen. Identificer cauda epididymis som en flad oval rørformet struktur lige under testiklerne.
- Hold cauda epididymis med buede tang, og resekter ved hjælp af lille, vinklet saks. Fjern begge cauda epididymider, og overfør dem til et absorberende væv for at fjerne fedt og blod under et dissekerende mikroskop.
- To cauda epididymider anbringes i hver 500 μL dråbe ligevægtigt PM under paraffinolie ved 37 °C. Skær vævet ved at lave seks snit ved hjælp af en lille saks. Hvis der anvendes mere end én mandlig donor, skal du bruge en epididymis fra hver donor til hver sædprøve for at reducere variationen mellem prøverne.
- Hvirvl forsigtigt skålen, og lad sædcellerne forlade vævet i 3 minutter, hvirvlende en gang i minuttet. Fjern alt væv.
- Sædprøven inkuberes i 45 min til 1 time ved 37 °C og 5% CO2 for at kapacitere.
- Valgfrit: Mål sædtal, og vurder motiliteten under et mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer. Til tælling fortyndes sædcellerne i PM efter behov.
- Bekræftelse af østruscyklussynkronisering ved cytologisk evaluering
- Brug en lille, fugtet vatpind (se materialetabel) til forsigtigt at samle vaginale celler fra vaginalvæggen ved at rulle vatpinden mod vævet, smøre dem ind i en 20 μL dråbe sterilt vand på et mikroskopglas og lufttørre.
- Under et mikroskop ved hjælp af 100x forstørrelse med lysstyrkebelysning skal du evaluere for tilstedeværelsen af cornified epitelceller. Kvinder i østrus eller sen proestrus vil have cornified epitelceller til stede og bør vælges til cervikal manipulation.
- Valgfrit: Registrer vægten af de kvindelige modtagere inden insemination.
- Udførelse af cervikal manipulation (CM)
- Ca. 0,5 time før insemination placeres en modtagerhun på toppen af et bur med et rist, så musen kan "gribe" burstangens overflade. Tag fat nær bunden af halen med tommel- og pegefinger og vinkl halen opad, mens du stabiliserer dyret (figur 1).
BEMÆRK: Musen holder stille under hele proceduren, når håndteringsteknikken udføres korrekt. Hvis musen bevæger sig ud af position, skal du forsigtigt flytte og fortsætte. Hvis et aggressivt dyr vælges som modtager, kan det være beroligende at lade dyret træde ind i en berigelsestunnel under proceduren. Brug af tunnelen er valgfri, men det kan hjælpe forskere med at håndtere dyrene ved at give en distraktion under denne procedure. - Indsæt den stumpe ende af en lille plaststang (se Materialetabel) vaginalt i kontakt med livmoderhalsen, og vibrer i 30 sekunder ved kontakt med en trimmer (se Materialetabel).
BEMÆRK: Placer stangen på plads, inden trimmeren startes. Begge holdes i den ene hånd under proceduren. Ingen anæstesi eller analgesi er påkrævet.
- Ca. 0,5 time før insemination placeres en modtagerhun på toppen af et bur med et rist, så musen kan "gribe" burstangens overflade. Tag fat nær bunden af halen med tommel- og pegefinger og vinkl halen opad, mens du stabiliserer dyret (figur 1).
- Ikke-kirurgisk sædoverførsel til kunstig befrugtning
- Insemineringsapparatet (se materialetabellen) anbringes på en P200-pipette, der er indstillet til 40 μL, og beskyttelsesdækslet fjernes.
- En prøve af den kapaciterede sædprøve tages ud af skålen ved 37 °C og 5 % CO2, og den overføres til en 35 mm vævskulturskål uden olie ved 37 °C. Sædprøven vil straks blive brugt til overførsel.
BEMÆRK: Sædcellerne mister hurtigt bevægelighed uden for CO2 -inkubatoren. Opbevar den kapaciterede sædprøve ved 37 °C og 5% CO2 så meget som muligt. - Tryk pipettestemplet ned til første stop, sænk kateterspidsen ned i sædprøven ved 37 °C, og læg langsomt sædcellerne ned i overførselsanordningen. Undgå klumper. Fjern resterende olie fra ydersiden af inseminationsanordningen ved hjælp af et absorberende væv. Sæt pipetten til side.
BEMÆRK: Overførsel af paraffinolie til livmoderhornet skal undgås. Fjern resterende olie fra ydersiden af inseminationsanordningen ved hjælp af et absorberende væv. - Placer modtagerhunnen på trådstativets burplade. Hold musen på plads ved hjælp af den samme håndteringsteknik, der anvendes til CM; Tag fat nær bunden af halen ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren, og vinkl halen opad, mens du stabiliserer dyret.
- Placer det lille spekulum (se tabel over materialer) i skeden.
- Indsæt inseminationsenhedens kateter i spekulumet, gennem livmoderhalsen og ind i livmoderen. Når enhedens hub er i kontakt med spekulummet, skal du dispensere sædcellerne ved at trykke pipettestemplet mod første stop. Undgå overførsel af ekstra luft til livmoderhornet.
BEMÆRK: Hvis kateteret ikke er placeret korrekt, vil det ramme vævet omkring livmoderhalsen, hvilket får det til at bøje og til sidst bøje. Hvis kateteret ikke glider gennem livmoderhalsen ved første forsøg, skal du forsigtigt bakke kateteret ud og forsøge igen, indtil det lykkes. Det kan være nødvendigt at flytte spekulummet. - Fjern enheden og spekulumet. Der kræves ingen overvågning efter proceduren.
- Valgfrit: Graviditetstjek på dag 10-12
- Brug vægtøgning til at bestemme graviditetsstatus. Vægtøgning vil være belastningsafhængig, men en stigning på mindst 1-2 g korrelerer med graviditet.
Figur 1: Musens holdeteknik til cervikal manipulation. Musen hviler på en trådburtop og stabiliseres ved halen og på begge sider foran på bagbenene. Den stumpe ende af en lille plaststang indsættes vaginalt for at kontakte livmoderhalsen og vibreres ved kontakt med en trimmer. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Ikke-kirurgisk embryooverførselsprocedure til brug ved cervikal manipulation i CD1-mus
- Synkroniseret ægløsning af hunmusene på dag 1 og dag 3
- Injicer hunmus med 2,5 IE PMSG ved IP-injektion på dag 1, ca. 6 timer efter starten af vivarium-lyscyklussen.
- Hunnerne injiceres med 2,5 IE hCG ved IP-injektion på dag 3 med et interval på 47 timer efter PMSG-injektionen eller ca. 5 timer efter starten af vivarium-lyscyklussen.
- Bekræftelse af østruscyklussynkronisering ved cytologisk evaluering
- På dag 3, ca. 1 time før CM, udføres cytologi på de potentielle modtagere. Brug en lille, fugtet vatpind til forsigtigt at samle vaginale celler fra vaginalvæggen ved at rulle vatpinden mod vævet, smøre dem ind i en 20 μL dråbe sterilt vand på et mikroskopglas og lufttørre.
- Under et mikroskop ved hjælp af 100x forstørrelse med lysstyrkebelysning skal du evaluere for tilstedeværelsen af cornified epitelceller. Kvinder i østrus eller sen proestrus vil have cornified epitelceller til stede og bør vælges til cervikal manipulation.
- Valgfrit: Registrer vægten af de potentielle kvindelige embryorecipienter.
- Udførelse af CM
- På dag 3, 1 time før starten af vivarium mørke cyklus, skal du placere en modtagerkvinde på toppen af et bur med et trådstativ, så dyret kan "gribe" burstangens overflade. Tag fat nær bunden af halen ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren, og vinkl derefter halen opad, mens du stabiliserer dyret (figur 1).
BEMÆRK: Musen holder stille under hele proceduren, når håndteringsteknikken udføres korrekt. Hvis musen bevæger sig ud af position, skal du forsigtigt flytte og fortsætte. Hvis et aggressivt dyr vælges som modtager, kan det være beroligende at lade dyret træde ind i en berigelsestunnel under proceduren. - Indsæt den stumpe ende af en lille plaststang vaginalt for at kontakte livmoderhalsen, og vibrer den i 30 s ved kontakt med en trimmer.
BEMÆRK: Placer stangen på plads, inden trimmeren startes. Begge holdes i den ene hånd under proceduren. Ingen anæstesi eller analgesi er påkrævet.
- På dag 3, 1 time før starten af vivarium mørke cyklus, skal du placere en modtagerkvinde på toppen af et bur med et trådstativ, så dyret kan "gribe" burstangens overflade. Tag fat nær bunden af halen ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren, og vinkl derefter halen opad, mens du stabiliserer dyret (figur 1).
- Ikke-kirurgisk ægoplægning på dag 6
- En dråbe M2-substrat på 20 μL (se materialetabellen) anbringes på låget af en vævskulturskål.
BEMÆRK: Låget er valgt, da det har en kortere kant og dermed er praktisk til at få adgang til embryonerne i dråben. Lag ikke på noget tidspunkt paraffinolie over dråben M2, da tilførsel af olie i livmoderhornet ser ud til at påvirke embryooverførslen negativt. - Under et mikroskop og ved hjælp af reflekterende belysning lægges 10-20 blastocyster i mediumdråben ved hjælp af en standard embryohåndteringspipette (se materialetabel).
BEMÆRK: Det optimale antal embryoner, der skal overføres, afhænger af musestammen og eventuelle manipulationer, embryonerne har gennemgået. For sunde umanipulerede embryoner bør oplægning af 10-15 embryoner være tilstrækkelig. For rederivation eller genetisk modificerede embryoner er det hensigtsmæssigt at overføre flere embryoner. - Fastgør den ikke-kirurgiske embryooverførselsanordning (se materialetabel) på en P2-pipette indstillet til 1,8 μL. Fjern det beskyttende kateterdæksel.
- Tryk pipettens stempel til det første stop, sænk spidsen af kateteret ned i mediet, og træk langsomt embryonerne ind i kateterspidsen på enheden. Fjern spidsen fra mediet.
BEMÆRK: Visualisering af embryonerne under lav forstørrelse giver mulighed for lettere indlæsning af embryonerne i enheden. Hvis embryonerne er spredt i dråben, skal du forsigtigt ryste skålen fra side til side for at koncentrere embryonerne i midten af dråben eller flytte dem igen ved hjælp af en embryohåndteringspipette. - Indstil pipettens volumen til 2,0 μL for at generere en lille luftboble ved spidsen af kateteret. Læg forsigtigt pipetten med embryonerne lastet nær museburet.
- Placer modtagerhunnen på trådstativets burplade. Hold musen på plads ved hjælp af den samme håndteringsteknik, der anvendes til CM; Tag fat nær bunden af halen ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren, og vinkl derefter halen opad, mens du stabiliserer dyret.
- Placer et lille spekulum (se Tabel over materialer) i skeden.
- Indsæt overførselsenhedens kateter i spekulumet, gennem livmoderhalsen og ind i livmoderen. Når enhedens hub er i kontakt med spekulummet, doseres embryonerne ved at trykke pipettestemplet mod første stop. Undgå overførsel af ekstra luft til livmoderhornet.
- Uden at slippe pipettestemplet fjernes enheden og spekulumet. Der kræves ingen overvågning efter proceduren.
- En dråbe M2-substrat på 20 μL (se materialetabellen) anbringes på låget af en vævskulturskål.
Representative Results
Da elektrisk9 og sonisk10 cervikal stimulering er blevet brugt til at fremkalde pseudograviditet hos rotter, præsenterer dette arbejde en standardiseret mekanisk procedure, der kan bruges til mus. Vaginal cytologi kan hjælpe med identifikation af kvinder i forskellige stadier af østrus. For at bekræfte pseudograviditet hos kvinder blev den samme metode anvendt. For det første blev cytologiprofiler for kvinder sammenlignet for CD1- og C57Bl/6-mus gennem brunstcyklusser, under graviditet og under pseudograviditet induceret af parring eller CM. Vaginale vatpinde blev taget fra hunnerne og farvet ved hjælp af et Papanicolaou-farvningssystem (se materialetabel). Cellerne blev observeret under 100x forstørrelse med lysstyrke. De observerede celler omfattede leukocytter, nukleerede epitelceller og anucleatcornified epitelceller. Bestemmelsen af østruscyklustrinnet var baseret på den relative procentdel af hver celletype11,12. Estrus er kendetegnet ved overvejelsen af cornified epitelceller. Når østrus slutter, begynder metestrus, og leukocytter begynder at dukke op, mens cornified epitelceller bliver mindre tydelige. Diestrus har moderat til lav cellularitet, hvor leukocytter dominerer og nukleerede epitelceller begynder at dukke op. Proestrus er kendetegnet ved tabet af leukocytter, en stigning i nukleerede epitelceller og udseendet af cornified epitelceller. Efter proestrus begynder østrus, og cyklussen fortsætter.
For at udvikle en baselineprofil blev vaginal cytologi registreret i mindst to fulde østruscyklusser for hver hun (N = 20 for CD1, N = 20 for C57Bl / 6) før parring. Cykluslængderne og individuelle profiler varierede blandt musene; De forventede generelle tendenser blev dog observeret. Den gennemsnitlige længde af en brunstcyklus for CD1- og C57Bl/6-musene var 3,8 dage med et interval på 3-5 dage. Dagen før naturlig parring fandt sted, var alle hunmusene i proestrus. Efter parring blev cytologi udført igen 1,5 dage efter coitum (dpc), indtil østruscykling blev genoptaget. Figur 2 viser den cytologiske profil for pseudogravide CD1- og C57Bl/6-hunner parret med vasektomiserede hanner.
Figur 2: Cytologisk profil for pseudogravide hunmus. De gennemsnitlige procentdele af hver celletype for leukocytter, nukleerede epitelceller og cornified epitelceller vises som en funktion af dage efter coitum (DPC) for (A) CD1 (N = 20) og (B) C57Bl / 6 (N = 20) mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
I dette arbejde er en CM-teknik blevet standardiseret for at øge effektiviteten af at producere pseudogravide kvinder. For kvinder i østrus eller proestrus indsættes den stumpe ende af en lille plaststang vaginalt for at kontakte livmoderhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Proceduren udføres på et trådstoppet bur. Ingen anæstesi eller analgesi er påkrævet. For at bestemme effektiviteten af CM-proceduren blev vaginal cytologi sammenlignet for kvindelige CD1 (N = 20) og C57Bl / 6 (N = 20) mus efter parring med vasektomiserede hanner og efter CM (total N = 40). Den cytologiske profil af pseudograviditet induceret af CM svarede til profilen af pseudograviditet induceret ved parring, som vist i figur 3.
Figur 3: Cytologisk profil for pseudogravide hunmus efter cervikal manipulation (CM). Procentdelen af hver celletype for leukocytter, nukleerede epitelceller og cornified epitelceller vises som en funktion af dage efter coitum (DPC) eller dage efter cervikal manipulation (DPCM). De gennemsnitlige celletypeprocenter vises for CD1- og C57Bl/6-musene (N = 40), (A) parret med vasektomiserede hanner eller (B) efter CM. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at afgøre, om CM-teknikken er tilstrækkelig til at etablere graviditet til assisteret reproduktion, blev CM udført som en del af en ikke-kirurgisk kunstig befrugtning (NSAI) protokol hos CD1-kvinder. Den kunstige inseminationsprotokol omfattede østrussynkronisering af hunnerne med en lav dosis af hormonerne PMSG og hCG før sædoverførsel. CM blev udført lige før sædoverførslen. For CD1-mus var effektiviteten af pseudograviditetsinduktion ved anvendelse af CM til kvinder i østrus (N = 76) med denne teknik 83%. I et kontrolforsøg blev kun 38% af kvinderne i østrus tilsluttet af vasektomiserede mænd (N = 24). De kunstige inseminationsmodtagere, der fik cervikal manipulation (N = 76), havde en graviditetsrate på 72% og en gennemsnitlig kuldstørrelse på 8,3 hvalpe. Således er induktion af pseudograviditet ved CM en bekvem og effektiv erstatning for parring med en vasektomiseret mand, når der udføres NSAI. Brug af CM til at forberede CD1-modtagere (N = 4) i østrus til ikke-kirurgisk embryooverførsel af friske CD1-blastocyster resulterede i en graviditetsrate på 100%. Oplægningen af 9-15 fostre gav tre sunde kuld med en fødselsrate på 45% og en gennemsnitlig kuldstørrelse på 6 unger. Til sammenligning havde CD1-modtagerne (N = 20), der blev parret med vasektomiserede mænd for at fremkalde pseudograviditet, en graviditetsrate på 80% og en fødselsrate på 46% efter overførsel af 20 friske B6C3F2-blastocyster.
Resultaterne for assisteret reproduktionsteknikker vil sandsynligvis være stammespecifikke, da variabler som dosis og tidspunkt for hormonadministration til superovulation har vist sig at være stammeafhængige13. Derudover kan faktorer som modtagerens alder og vægt påvirke reaktionen på hormoner14. I dette arbejde, når man udførte CM-proceduren for kunstig befrugtning, viste det sig, at kun kvinder i sen proestrus eller østrus var lydhøre. Generelt, for at øge antallet af tilgængelige modtagere i en befolkning, er hunnerne først østrus-synkroniseret med en lav dosis hormoner3. Østrussynkronisering med 2,5 IE PMSG og hCG var 78% effektiv for 11-14 uger gamle CD1-hunner (N = 27) og 60% effektiv for 18-32 uger gamle C57Bl/6-hunner (N = 22) i dette arbejde. Effektiviteten af pseudograviditetsinduktion ved hjælp af cervikal manipulation på CD1-kvinder var 83% for kvinder i østrus (N = 76) og 82% (N = 100) for C57Bl / 6 kvinder i østrus med denne teknik.
Discussion
3R'erne er en etisk ramme for dyrebrug i forskning, som beskrevet i 1959 af Russel og Burch i "The Principles of Humane Experimental Technique"15. 3R'erne repræsenterer udskiftning, reduktion og forfining i dyrebrug. De protokoller, der er fremhævet her, er i overensstemmelse med 3R'erne. Den cervikale manipulationsteknik reducerer antallet af dyr, der er nødvendige ved ikke længere at kræve brug af mænd til at producere pseudogravide kvinder. Teknikken eliminerer også behovet for at udføre vasektomier på hannerne, hvilket giver forfining ved at reducere smerte og nød. De assisterede reproduktionsteknikker, der er beskrevet her (kunstig befrugtning og embryooverførsel), er ikke-kirurgiske og giver således begge en 3R-forfining ved at reducere smerte og nød8forårsaget af deres kirurgiske alternativer.
Anvendelsen af pseudogravide kvinder er nødvendig for genopretning af hvalpe, når der udføres assisteret reproduktion hos mus1. CM-proceduren er en effektiv metode til fremstilling af pseudogravide kvinder, men synkroniseringen af fasen af brunstcyklussen hos modtagerhunnerne er et kritisk første skridt i processen. Brunstsynkronisering kan drastisk reducere antallet af hunner, der er nødvendige i kolonien for at forberede potentielle modtagere og hjælper med at producere tidsbestemte pseudogravide hunner efter behov. Brug af en lav dosis hormoner synes ikke at forårsage nogen skadelige virkninger på genopretningen af levende kuld i CD1-mus. Der skal udvises forsigtighed med andre stammer for at finde den hormon- og koncentrationskombination, der producerer recipienthunner af bedste kvalitet til de overførte embryoner eller sædceller. Synkronisering kan opnås ved hjælp af PMSG og hCG16, men doser, der producerer superovulerede kvinder, er muligvis ikke egnede til en vedvarende graviditet17.
For at afgøre, om en kvinde er i østrus, blev der udført en cytologisk evaluering i dette arbejde. Brunstfasen kan også evalueres ved observation af vaginalåbningen11,18. Selvom denne metode er yderst nyttig og kan bruges alene eller som bekræftelse, er den mere subjektiv end brugen af cytologi. Vaginal cytologi uden farvning er både hurtig og effektiv til valg af kvinder i østrus, fordi cornified epitelceller let kan identificeres. I denne protokol udføres den cytologiske evaluering før CM for at bestemme potentielle modtagere. Det er vigtigt at udføre cytologi før CM, da proceduren har tendens til at fragmentere cellerne, der sloughed fra vaginalområdet, hvilket gør identifikation vanskelig. Cytologisk evaluering for pseudograviditet eller graviditet kan udføres 3,5-11,5 dage efter CM (dpcm) i 3 på hinanden følgende dage. Profilen af en østruscyklende kvinde skal have mindst 1 dag med betydelig infiltration af cornified epitelceller. Pseudogravide/gravide kvinder bør udvise en diestrusprofil (for det meste leukocytter med potentielt lave celletal) i 3 på hinanden følgende dage.
Gennem udviklingen af CM-teknikken viste det sig, at nogle mus var mere modtagelige for proceduren end andre. CD1 hunmus er fremragende kandidater på grund af deres rolige natur og fremragende plejeinstinkter. Denne stamme er nem at håndtere og fungerer godt under CM og ikke-kirurgiske assisterede reproduktionsteknikker. C57Bl/6-mus har tendens til at være mere aggressive og mindre plejende. Mens denne protokol effektivt producerede pseudogravide C57Bl / 6-kvinder ved hjælp af CM, var de mindre tilbøjelige til at være konsekvent eftergivende over for proceduren. Dette syntes at korrelere noget med østrusfasen under CM. Kvinder i østrus eller proestrus var mere modtagelige. Brugen af et berigelsesrør for dyret at komme ind tillod adgang til vagina til proceduren og hjalp med at berolige kvinden. Selve proceduren begrænser ikke kvinden fuldt ud, så dyret kan trække sig væk til enhver tid. Hvis dette sker, kan dyret flyttes, og proceduren kan derefter fortsættes. Tidspunktet for proceduren stopper, hvis kvinden går væk og genoptages, når proceduren genoptages. Kritisk for procedurens succes er fasen af østruscyklussen (sen proestrus og østrus) og stangens kontakt med livmoderhalsen. Trimmerens vibrationer giver standardiseret CM. For at sikre kontakt med livmoderhalsen påføres stangen et let tryk, og stangens placering mod livmoderhalsen sikres med små frem og tilbage bevægelser af stangen.
Brugen af CM har forbedret NSAI-protokollen, da kvinder i den korrekte fase af østruscyklussen kan vælges inden sædoverførsel, og protokollen er ikke længere betinget af parring med vasektomiserede hanner. Den kunstige befrugtning af østruscyklussynkroniseringen er tidsindstillet således, at oocytmodning svarer til sædoverførsel om morgenen på dag 4. Afgørende for protokollens succes er tilpasningen af tidspunktet for ægløsning, således at befrugtning kan forekomme. Der skal udvises forsigtighed med at administrere hCG 15-17 timer før forventet sædoverførsel, som det foreslås for de tidspunkter, der anvendes til in vitro-befrugtning 1. Kvaliteten af sædprøven vil direkte påvirke resultatet af kunstig befrugtning. Frisk sæd, der er blevet kapaciteret, vil fungere bedst. Kryopræserveret sæd af god kvalitet kan producere befrugtede embryoner in vivo. Der skal dog udvises forsigtighed ved direkte overførsel af optøet sæd, da resterende kryoprotektorer, der overføres til livmoderhornet, kan hæmme implantation (upublicerede observationer).
Brugen af CM i forbindelse med embryooplægning er konceptuelt en nem tilpasning. Synkronisering af østruscyklus reducerer antallet af kvinder, der er nødvendige for at producere modtagerpuljen. Bestemmelse af brunststadiet før CM øger sandsynligheden for at opnå pseudogravide modtagere. En ulempe ved metoden er, at modtagernes cytologi på tidspunktet for embryooverførsel er i et fluxstadium. Alle celletyper er til stede, hvis kvinden overgår fra østrus til pseudograviditetsprofilen, og pseudograviditet bliver kun indlysende, hvis cytologien spores i flere dage. Baseret på succesen (>80%) af overgangen fra østrus til pseudograviditet for CD1- og C57Bl/6-mus forventes denne metode at være egnet til embryooverførselsmodtagere. De foreløbige resultater viser god succes med begrænset ikke-kirurgisk embryooverførsel. Generelt er effektiviteten af ikke-kirurgisk embryooplægning sammenlignelig med effektiviteten af den kirurgiske teknik4,5, og ikke-kirurgisk oplægning kan erstatte kirurgisk embryooplægning på blastocyststadiet. For embryoner i tidligere stadier kræves embryodyrkning til blastocyststadiet. Men hvis en kirurgisk overførsel foretrækkes, er det muligt at tilpasse CM-teknikken til den korrekte timing, der er nødvendig for passende pseudogravide modtagere2. Generelt er embryorecipienterne 1 dag mindre fremskredne end embryoet. For eksempel høstes blastocyster ved 3,5 dpc fra donorer og overføres til 2,5 dpc-modtagere. Derfor skal CM udføres således, at modtageren er i en mindre udviklet pseudogravid tilstand end embryonerne.
Afslutningsvis viser CM-teknikken, der er skitseret her, fremragende løfte om integration med andre assisterede reproduktionsteknikker til mus. Vi har leveret vellykkede protokoller til kunstig befrugtning og embryooverførsel ved hjælp af ikke-kirurgiske teknikker. I kombination giver CM-teknikken 3R-fordele, herunder (1) en reduktion i antallet af dyr ved at eliminere behovet for vasektomiserede mænd og (2) en forfining af teknikker ved at erstatte kirurgiske teknikker med ikke-kirurgiske alternativer.
Disclosures
Barbara Stone og Sarah Srodulski er begge ansat hos ParaTechs Corporation, Lexington, KY, USA. ParaTechs har eksklusive licensrettigheder til at fremstille mNSET-enheden til mus. ParaTechs Corp har udviklet og sælger mNSET- og mC&I-enhederne, som kan bruges til henholdsvis ikke-kirurgisk embryooverførsel og ikke-kirurgisk kunstig befrugtning.
Acknowledgments
Den forskning, der blev rapporteret i denne publikation, blev støttet af Office of the Director, Office of Research Infrastructure Programs, fra National Institutes of Health under Award Number R43OD020304 og National Institute of Mental Health of the National Institutes of Health under Award Number R44MH122117. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
