一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

摘要

本文介绍了一种用于建立和验证良好实验室规范的方案，通过数字液滴式聚合酶链式反应法对人体泪液中的腺相关病毒载体进行合规性检测，以支持基因治疗载体的临床开发。

摘要

近年来，利用病毒载体治疗遗传性疾病的研究显著增加，迄今已有超过2000项研究注册。腺相关病毒（AAV）载体在治疗眼部相关疾病方面取得了尤为突出的进展，例如voretigene neparvovec-rzyl的获批即为明证。为了将新疗法推向市场，监管机构通常要求开展经过认证或验证的生物排泄研究，以评估载体向环境中的释放情况。然而，美国食品药品监督管理局（FDA）尚未发布针对支持此类排泄研究的分子检测方法开发的官方指南，导致研发人员需自行确定最佳实践方案。本实验方案旨在提供一种可验证的检测方法，通过微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）检测人泪液中的AAV载体，以支持临床生物排泄研究。本文讨论了当前行业在分子检测方法验证方面的常用策略，并证明该方法的表现优于目前白皮书中提出的目标检测验收标准。最后，本文还探讨了无论何种应用背景下，开展任何ddPCR检测时均需关注的关键步骤。

引言

基因治疗的定义各不相同，但通常指有意地、且往往是永久性地改变细胞基因组中特定DNA序列，以调控或操纵基因表达，或改变活细胞的生物学特性，从而实现临床目的^1,2。由于病毒载体具有高效的转导能力，其作为基因治疗载体的应用日益广泛，有报告指出，目前超过70%的基因治疗临床试验采用病毒载体³。人们对用于基因治疗的病毒载体的兴趣持续增长。美国基因与细胞治疗学会（American Society of Gene and Cell Therapy）发布的2022年第四季度《基因、细胞和RNA治疗领域季度数据报告》显示，2022年从临床前到注册前阶段的基因、细胞和RNA治疗研发管线增长了7%，进入开发阶段的疗法总数达到3,726种，其中2,053种（55%）为基因疗法⁴。美国食品药品监督管理局（USA FDA）目前已批准27种细胞和基因治疗产品用于人类临床，其中5种明确使用病毒载体⁵。

腺相关病毒（AAVs）作为基因治疗的载体已受到特别关注。最近的一项荟萃分析显示，在过去二十年中，已有约136项临床试验研究了AAVs的应用⁶。此外，美国食品药品监督管理局（USA FDA）批准的五种基因疗法中，有三种基于AAV。这归因于AAV具有高度可编辑性、广泛的宿主范围（可根据特定天然或人工改造载体的使用进行调整）、在人类中低致病性和低毒性，以及通常较低的免疫原性^7,8。AAV还已在获批的临床环境中成功用于治疗眼部疾病。Voretigene neparvovec-rzyl 是一种基于AAV2的疗法，于2017年获得美国FDA批准，2018年获得欧洲药品管理局（EMA）批准，用于治疗与RPE65基因双等位基因突变相关的视网膜营养不良⁹。

随着人们对基于腺相关病毒（AAV）疗法开发的兴趣日益增加，相关检测方法的监管指导需求也相应上升。准确检测和定量任何病毒载体都是产品开发过程中发现、生产以及临床前/临床测试阶段不可或缺的组成部分。美国食品药品监督管理局（FDA）已开始发布一些针对基因疗法的指导文件，包括人类基因治疗研究性新药申请中的化学、制造和控制方面的指南¹⁰、基因治疗给药后的长期随访指南¹¹、复制型逆转录病毒检测指南¹²，以及用于基因疗法的微生物载体使用建议¹³。欧洲药品管理局（EMA）也发布了一系列关于基因治疗产品开发的指南，总体上与FDA的建议一致，尽管存在某些差异¹⁴。需要特别指出的是，这些指南本身并不构成具有法律约束力的责任，除非其中引用了具体的法规条文；但它们阐明了监管机构当前对该领域的思考及其对药物申报和监管审批所需检测方法的期望。

美国食品药品监督管理局（FDA）特别建议，应开展研究以评估载体从给药部位向靶向眼组织和非眼组织、眼内液体以及血液中的分布、持续性和清除情况¹⁵。这类研究通常表现为生物分布和排泄研究。生物分布研究通过考察产品从给药部位在患者体内各组织中的扩散情况，来评估暴露水平。排泄研究则专门评估产品从患者体内释放到环境中的情况，并涉及载体传播给未接受治疗个体的可能性¹⁶。FDA 就生物分布和排泄研究的设计提出了建议，包括样本采集频率、采样持续时间、采集样本类型以及储存条件。

此外，美国食品药品监督管理局（FDA）推荐使用定量聚合酶链式反应（qPCR，或实时 PCR）对载体基因组进行定量检测，原因是该方法操作简便、通量高、周转时间短且检测灵敏度高。然而，与小分子和大分子药物已有的指导原则相比，目前针对分子检测方法的设计及性能评估的相关建议相对缺乏。由于基因治疗产品及其检测方法本身具有独特而复杂的结构，许多现有的指导原则难以直接适用于分子检测方法，这引发了关于现有检测平台是否适用于推荐的评估项目，以及如何进行检测方法验证的疑问。迄今为止，FDA 尚未要求对基于 PCR 的检测方法进行正式验证，而欧洲药品管理局（EMA）已提出此项要求¹⁷。鉴于这一空白，多个研究团体和研讨会已发布白皮书和建议，供生产商和合同研究组织参考遵循^{18,19,20,21,22,23,24,25}。这些建议大多以 qPCR 检测方法为具体对象，仅在必要时对新兴平台（如微滴数字 PCR，ddPCR）提出建议或调整。近期发布的建议更多关注 ddPCR 检测方法的考量因素，但其重点仍主要集中于生产环境下的载体基因组定量，而非生物排泄研究中所遇到的复杂生物基质中的应用。

根据临床应用和研究目标的不同，在支持生物分布和排毒研究方面，数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR）可能优于定量聚合酶链式反应（qPCR），因为与qPCR相比，ddPCR具有更高的灵敏度以及更强的抗基质干扰能力。此外，由于样本被分割成约20,000个微滴，因此可通过泊松统计学方法实现对拷贝数的准确定量，而无需使用标准曲线，从而简化了方法开发与验证过程。本实验方案的目标是描述一种标准化的方法，用于开发和验证基于ddPCR的技术，以检测从眼部表面采集的泪液样本中的腺相关病毒（AAV）载体，支持临床生物排毒研究。

方案

1. 合成DNA片段的制备

1. 设计并订购含有目标扩增区域的合成DNA片段，用于质量控制。
   1. 确保该序列包含从目标基因的正向引物到反向引物的完整扩增子序列，并在每个引物结合序列的5'端额外延伸4至6个碱基。
   2. 避免腺嘌呤和胸腺嘧啶的同聚物超过12个碱基，或鸟嘌呤和胞嘧啶的碱基对超过8个碱基，因为长同聚物可能干扰基因片段的合成。
      注意：如果扩增子包含此类序列，可在保持引物和探针退火位点不变的前提下进行碱基替换。
   3. 或者，可采用常规克隆策略制备含有扩增子的线性化质粒。
2. 将含有合成DNA片段的离心管在微量离心机中离心约10秒，确保样品沉降至管底。
3. 使用Tris-EDTA（TE）缓冲液将合成DNA片段重悬，浓度为1.0 × 10¹⁰ 拷贝/µL，或根据目标检测范围调整至适当浓度。
4. 短暂涡旋混匀，随后在50 °C孵育20 ± 5分钟，然后置于冰上冷却。
5. 制备多个（理想情况下为一次性使用）分装样品，储存于-70至-90 °C直至使用。
   注意：以本方法制备的合成DNA片段通常自重悬之日起至少24个月内稳定。
6. 如需要，可在用作质量控制前测定所制备合成DNA原液的精确浓度，或根据重悬条件估算其标称浓度。

2. 引物和探针的制备

1. 采用典型的引物设计策略，设计并订购用于靶向目标扩增区域的引物和水解探针^26,27。
   1. 使用与数字PCR（ddPCR）系统兼容的5'端荧光报告染料（例如FAM）和3'端淬灭基团（例如Iowa Black暗淬灭剂）。
      注意：目前存在多种PCR引物设计软件，均可使用。例如，美国国家生物技术信息中心（NCBI）开发的Primer-BLAST²⁸因其强大的引物设计选项以及可通过生物信息学方法便捷评估特异性、识别潜在脱靶效应而被广泛使用。需注意的是，引物和探针的制备步骤可能因供应商提供的形式不同而有所差异。
2. 将含有正向引物、反向引物和探针的离心管在微量离心机中离心约10秒，使管壁附着物完全沉降至管底。
3. 使用TE缓冲液将引物重悬至20 µM浓度，短暂涡旋混匀。
4. 使用TE缓冲液将探针重悬至10 µM浓度，短暂涡旋混匀。
5. 建议分装为多个 aliquot（最好为单次使用量），并于至少-20 °C保存至使用。
   ​注意：以本方法制备的引物和探针通常在重悬后至少24个月内保持稳定。

3. 样品稀释缓冲液的制备

1. 在室温下解冻PCR缓冲液和剪切的鲑鱼精子DNA。充分涡旋混匀。
2. 按照表1配制样品稀释缓冲液。
3. 充分涡旋混匀。配制后可于2-8 °C保存最多1个月。

表1：样品稀释缓冲液的配制。 请点击此处下载该表格。

4. 主混合液的制备

1. 将探针法 ddPCR 预混液、正向引物、反向引物和探针在室温下解冻，解冻后至少静置 10 分钟再使用。使用前保持在室温下储存。
   注：这些试剂必须完全恢复至室温，以确保有效形成液滴。配制过程中不得将试剂置于冰上。
   1. 使用前充分涡旋振荡，并在小型离心机中短暂离心。
      注：限制性内切酶通常含有甘油，应即取即用。轻轻混匀，切勿涡旋振荡。
2. 为每个扩增靶标配制 PCR 预混液。PCR 预混液的推荐组成参见 表 2，并根据需要调整引物和探针的浓度。
   1. 加入限制性内切酶前，充分涡旋振荡并短暂离心。加入限制性内切酶后通过倒置混匀。
      注：此步骤中需准备 22 µL 的 PCR 反应体系，以便在液滴生成后获得 40 µL 的最终 PCR 反应体积（包含 15 µL PCR 预混液、5.0 µL 模板和 20 µL 液滴生成油）。
3. 根据板图向各孔中加入 16.5 µL 预混液。验证准确性和精密度实验的板图示例参见 图 1。
   1. 确保每块板包含三份独立制备的质量控制（QC）系列样本、三份独立检测的内源性泪液等分试样（分别添加高浓度和低浓度标准品以及未添加标准品的样本），以及三个独立的无模板对照（NTC）。
   2. 在板上以不同方式排列这些孔位：Set 1 按浓度递减顺序加样，Set 2 按浓度递增顺序加样，Set 3 采用随机顺序加样，以评估是否存在孔位位置特异性影响。
   3. 尽可能将样本排列成完整的列，并在列中未使用的孔内加入对照缓冲液。如有需要，可在剩余孔中加入多个内源性对照批次（例如，更多泪液混合样本或来自不同个体的泪液样本）。
   4. 用透明粘性封膜密封板。在模板制备期间将板置于室温下。或者，可将板在 2–8 °C 下保存最多 4 小时，但在加入模板前需至少恢复至室温 10 分钟。

表2：PCR预混液制备示例。 请点击此处下载该表格。

图1：用于验证准确度与精密度实验的孔板布局示例。 缩写：ULQC = 上限质控；HQC = 高浓度质控；MQC = 中浓度质控；LQC = 低浓度质控；LLQC = 下限质控；NTC = 无模板对照。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 准备质控样本

1. 在室温下解冻合成DNA片段或线性化质粒，解冻后至少静置10分钟再使用。将模板恢复至室温，以确保有效形成液滴。
   1. 使用前于室温保存。使用前充分涡旋振荡，并在小型离心机中短暂离心。
2. 使用样本稀释缓冲液作为稀释液，制备质控品（QC）稀释液。进行方法学验证时，推荐制备的浓度示例见表3。
   ​注意：在完成准确度和精密度验证运行后，每块板仅需运行高质控（HQC）、中质控（MQC）和低质控（LQC）。对于准确度和精密度验证运行，每个质控品至少需制备三个独立的稀释样本，用于评估板内准确度和精密度。完成准确度和精密度验证后，每块板仅需包含一个稀释系列。
3. 稀释液制备完成后，若未立即使用，应于室温保存直至加入反应板中。
4. 如需保存，可将稀释液置于冰上或2–8 °C环境中。再次使用前，需将其恢复至室温，静置至少10分钟后再使用。质控品应在当日使用结束后丢弃。

表3：使用合成双链DNA片段进行质量控制（QC）的示例制备方法。 缩写：ULQC = 上限质量控制；HQC = 高质量控制；MQC = 中等质量控制；LQC = 低质量控制；LLQC = 下限质量控制；NTC = 无模板对照。请点击此处下载该表格。

6. 样品制备

1. 将从临床试验中采集的泪液样本在室温下解冻至完全融化，解冻后至少静置复温10分钟，方可使用。
   1. 使用前于室温保存。使用前充分涡旋振荡，并在微量离心机中短暂离心。
2. 用样本稀释缓冲液将泪液样本按1:10（或更高比例）稀释，加入0.2 mL PCR管或8联排PCR管中。密封管盖。
   注意：根据泪液中目标物的预期浓度，可能需要对样本进行进一步稀释，或对每个样本检测多个不同稀释度。
3. 将样本在热循环仪中于95 °C加热10分钟，随后在4 °C保持至少5分钟以冷却，升温速率为3 °C/s。
   注意：样本可在同一天内保留在热循环仪中置于4 °C待用，或于-70至-90 °C冷冻以长期保存。此步骤旨在使载体衣壳变性，从而释放基因组。由于质控用的合成DNA片段或线性化质粒为双链结构，不应进行此加热步骤。
4. 冷却后的样本恢复至室温（若已冷冻，则在室温下解冻），并静置复温至少10分钟。
   ​注意：样本必须完全恢复至室温，以确保有效形成微滴。

7. 添加模板

1. 取出含有预混液的数字微滴PCR（ddPCR）板。充分涡旋振荡每个样本或质控稀释管，并短暂离心以收集管壁液体。
2. 去除粘性封膜，根据板图将5.5 µL的质控品（QCs）或样本加入96孔板的相应孔中。
   注：所需加样体积的说明请参见步骤4.2.1
3. 向无模板对照（NTC）孔中加入5.5 µL样本稀释缓冲液。
4. 为进行微滴生成，每列的所有孔必须包含反应液或缓冲液对照。若某列中存在未使用的孔，则需使用无核酸酶水将2倍浓度的ddPCR缓冲液对照按1:2比例稀释，并向该列的每个空孔中加入22 µL的1倍浓度ddPCR缓冲液对照。
   注：若整列均未使用，则无需向这些孔中添加缓冲液对照。
5. 在板上覆盖可穿刺铝箔封膜。将板放入封膜机中，在180 °C条件下密封5秒。
   1. 或者，按照ddPCR系统制造商推荐的方法对板进行封膜。
6. 将板在最大转速下涡旋振荡至少30秒（使用连续涡旋模式；不要使用点动涡旋），然后在板式离心机中短暂离心。
   ​注：此步骤中对板的充分且彻底混匀对于将PCR反应液正确分割成微滴至关重要。确保各孔中无可见气泡。如有需要，可在微滴生成前将板置于2–8 °C环境中最多4小时。若进行了低温保存，则在微滴生成前需将板恢复至室温至少10分钟。

8. 自动化液滴生成、热循环及液滴读取

1. 按以下步骤在自动液滴生成仪中生成液滴。
   1. 在触摸屏上选择板图中包含样本的列。仪器台面将亮灯提示所需耗材（DG32芯片、吸头、废液容器、液滴生成油）。黄灯表示需要添加耗材，绿灯表示耗材充足。
   2. 从后向前装载液滴生成仪。
   3. 对于水解探针，请确保已安装适用于探针的液滴生成油，并且油量足以满足孔数需求。若使用其他PCR化学体系，请确保已安装兼容的液滴生成油。
   4. 将预冷块置于液滴板架中，确保冷块完全呈蓝色，无粉红色区域可见。将新的96孔ddPCR板放入冷块中。
   5. 将准备好的PCR板放入样本板架中。关闭仪器盖子，按下开始按钮进行液滴生成。
2. 液滴形成后，每反应共40 µL将自动转移至新的PCR板中。
3. 液滴生成完成后30分钟内，从冷块中取出含液滴的板。操作应轻柔，因此时液滴最为脆弱。
4. 在板上加装可穿刺的铝箔封膜。将板放入封膜机中，在180 °C下密封5秒。
   1. 或者，按照ddPCR系统制造商的建议进行封膜。
5. 将板放入兼容的热循环仪中。输入循环条件（见表4）。
6. 热循环结束后，可将板保留在热循环仪中并转移至2–8 °C，或立即进行读数。
   注意：在4–12 °C下保存12小时可能提高液滴计数，但此步骤非必需。不进行保存也应能获得足够数量的液滴。
7. 将板装入液滴读取仪，确保读取油充足且废液容器有足够空间。读取液滴。应在热循环启动后24小时内完成液滴读取。

表4：典型的热循环条件。 请点击此处下载该表格。

9. 数据分析

注意：使用泊松统计法准确计算浓度时，每个孔至少需要 10,000 个液滴。液滴数量少于 10,000 的孔不得进行分析。

1. 需要设定一个阈值，以将液滴定义为阳性或阴性。ddPCR 分析软件会自动应用一个可能在不同孔之间变化的阈值。然而，为了获得更一致、准确和精确的结果，建议手动为整块板的所有孔设置一个阈值，该阈值应略高于无模板对照（NTC）孔的荧光强度。
   注：阈值的合理设置可能需要根据阳性和阴性液滴的分离程度以及液滴“雨”（droplet rain）的程度进行优化（见图 2）。在此示例中，液滴振幅图显示了每个质量控制（QC）水平及 NTC 的代表性孔，紫色线表示设定为 1,000 的阈值，略高于阴性液滴群。
2. 泊松统计模型要求至少有三个阳性液滴，才能以 95% 的置信度计算浓度。所有包含零个、一个或两个阳性液滴的孔均视为阴性，并将其浓度设为零²⁷。
3. 反推每份泪液样本中的拷贝数。
   1. 数据报告中会提供以拷贝数/µL 为单位的浓度。使用该值确定原始样本（即泪液样本）中拷贝数/µL 的浓度。
   2. 为计算 ddPCR 反应的稀释倍数，将液滴生成前的初始 PCR 反应体积除以加入的模板体积。当采用本方法中所述体积时，该值为 4。
      
   3. 根据原始样本的系列稀释倍数（步骤 6.2）确定稀释因子。
   4. 为确定样本中拷贝数/µL，将报告中的拷贝数/µL 乘以 ddPCR 反应稀释倍数，再乘以系列稀释因子。例如，数据报告中生成的拷贝数/µL 浓度为 966；每 22 µL 反应体系中加入 5.5 µL 模板；样本使用了 1:50,000 的系列稀释。
      
      
   5. 如果对同一样本的多个稀释度进行了检测，应分析所有有效且在检测范围内的稀释度，并计算其平均值。
4. 对于每个 QC 样本，通过将给定 QC 稀释液的浓度（拷贝数/µL）除以 ddPCR 反应体积（20 µL），计算预期的拷贝数/µL PCR 反应值。此方法可直接将该标称值与数据报告中提供的拷贝数/µL 值进行比较，无需进一步计算。
   注：该方法也用于代表性结果中所用加标泪液样本的分析。
5. 利用重复孔（如适用，包括多个稀释度）计算样本或 QC 值的平均值、标准差、变异系数（%CV）以及相对于标称浓度的相对误差百分比（%RE）。
   1. 评估孔间精密度时，若包含孔的重复，应对每对重复孔分别进行计算。
   2. 评估单次检测内的准确度和精密度时，应对同一批次内使用的每个稀释系列或等分试样进行计算。
   3. 评估批次间准确度和精密度时，应使用各批次内单次检测的平均值进行计算。

图 2：设定阈值的示例。 缩写：ULQC = 上限质控；HQC = 高值质控；MQC = 中值质控；LQC = 低值质控；LLQC = 下限质控；NTC = 无模板对照。请点击此处查看此图的放大版本。

10. 检测验收标准

1. 使用以下标准对每批计算数据进行评估，以确定该批次是否可接受。若未满足这些条件，则判定该批次无效并重新进行实验。
   注意：这些标准是基于已发表的关于基于PCR检测方法验证的白皮书共识而确定的^{18,19,20,21,22,23,24,25}。根据临床应用的具体情况，可能需要适当调整目标标准。
2. 无模板对照（NTC）
   1. 确保每个NTC孔包含至少10,000个液滴。
   2. 确保每个NTC孔中阳性液滴数少于3个。
3. 质控品（QCs）及检测范围
   1. 确保每个质控品孔包含至少10,000个液滴。
   2. 确保同一浓度质控品的重复孔之间的精密度≤25.0% CV，但在定量上限和下限处，≤30.0% CV可接受。需针对每组质控品及每个浓度水平独立评估。
   3. 确保在每个平均质控浓度水平下，回算浓度的相对误差（RE）在标称浓度（拷贝数/PCR反应）的±25.0% RE范围内，但在定量上限和下限时，±30.0% RE可接受。需针对每组质控品及每个浓度水平独立评估。
   4. 确保至少有2/3的质控样品（例如六次结果中的四次）以及每个浓度水平（低、中、高）至少50%的质控样品符合上述标准。
4. 样本
   1. 确保待分析的样本孔包含至少10,000个液滴。
   2. 确保待分析样本稀释液的重复孔之间的精密度≤25.0% CV。
   3. 确保给定样本至少有一个纳入分析的稀释度处于本检测方法定义的定量范围内，该范围根据上述高、低浓度质控品所确定。
   4. 如果所有纳入分析的稀释度结果均高于定义的定量上限，且样本剩余体积充足，则应使用更高稀释度的样本重复检测。
   5. 如果所有纳入分析的稀释度结果均低于定量下限，且样本剩余体积充足，则应使用更低稀释度的样本重复检测。
      注意：含有超过三个阳性液滴但浓度低于定量下限的样本，可描述为“可检出但不可定量”。

结果

为演示目的，本研究建立了一种检测 commercially available 的表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的 AAV2 载体的检测方法，并采用含有 eGFP 的合成双链 DNA 片段作为质量控制。目前，关于应使用载体本身还是合成 DNA 片段或线性化质粒作为质量控制仍存在争议。通常情况下，若在方法开发中能够证明其与载体具有等效性，则可使用合成 DNA 片段或线性化质粒（数据未显示）。引物和探针经设计并优化以检测 eGFP 转基因。本研究所用序列详见补充表 S1。质量控制片段原液的浓度通过滴定数字聚合酶链式反应（ddPCR）进行经验性测定。所有检测均采用本方案部分所列示例中的浓度和 PCR 条件进行。

对于 qPCR 检测，建议评估标准曲线的线性、灵敏度、动态范围、准确性和精密度。由于 ddPCR 不依赖标准曲线进行靶标定量，因此需要对这些建议进行调整。取而代之的是，使用由合成的双链 DNA 片段组成的质控样本（QCs），将其稀释至不同浓度，以覆盖基于泊松统计模型预测的 ddPCR 反应可定量范围^29,30,31,32，用于定义动态范围和灵敏度，并评估准确性和精密度。QC 浓度的选择主要基于在特定浓度下，反应孔中阳性液滴占总液滴的预期比例。从数学理论上讲，当约 80% 的分区发生阳性扩增时，ddPCR 的准确性最高。当阳性液滴与总液滴的比例超过 0.8 时，由于分区饱和，准确性会下降，一旦所有液滴均为阳性，则无法进行定量。在低浓度端，理论上仅需一个阳性液滴即可被检测和定量，但此时准确性较差，且检测易受低水平假阳性的影响。通常，至少需要三个阳性液滴才能以 95% 的置信度计算结果，这也是本研究中用于计算浓度的阈值。

配制了一系列五种不同浓度的质控样本，其目标拷贝数/µL PCR反应体积经计算可产生覆盖ddPCR定量范围的阳性液滴与总液滴比例，如表5所示。这些样本用于评估该检测方法的准确性和精密度。在本项评估中，定量的上下限并未扩展至ddPCR理论上可能达到的最大范围。在高于或低于本实验所展示的水平下，仍有可能实现准确的定量。该定量范围应根据本方法的下游应用需求进行相应开发。

为评估方法的批内准确度和精密度，每批实验均使用样本稀释缓冲液制备上述质控品的三份独立稀释系列，并对每个质控品稀释度设置复孔。为模拟实际的验证方案，由多位分析人员在不同日期共完成六批准确度和精密度实验。通过分析这六批实验的结果，确定该方法的批内和批间准确度、精密度以及方法的动态范围。

针对每个批次在每个质控（QC）水平下评估了批内性能。我们预期所有质控（QC）和无模板对照（NTC）孔的液滴数均至少达到10,000个。在全部六个批次共216个检测孔中，该标准全部满足，平均每孔液滴数为19,748个（表6）。接下来，各质控样本每组重复孔之间的孔间变异系数（%CV）预期应≤25.0%，仅上限和下限质控样本允许放宽至≤30.0%。在全部六个批次共90组检测中，所有质控样本均满足该标准，各质控水平的平均孔间%CV为3.9%（表7）。所有质控样本的阳性液滴数与总液滴数之比的均值均处于上述预期范围内（表6）。

在每批实验中，针对独立配制的各个稀释系列点计算其批内均值和标准差，并以此计算每次实验中每个浓度的批内均值，用于评估实验的准确性和精密度（表8）。精密度是指在常规实验条件下，对同一样品进行重复测定时数据的变异程度，通过计算多个重复样本的%CV来评估。我们预期每批实验中检测的三个重复样本的批内%CV应≤25.0%，仅上限和下限质控样本（QC）可放宽至≤30.0%。该标准在60批实验（共30次完整运行）中的全部五个质控水平均得到满足。通常情况下，批内精密度优于预设目标，所有质控水平的平均批内%CV为7.7%。准确度是指实验测定值与理论标称值之间的一致性程度，通过计算各质控样本实测浓度与其理论标称浓度之间的相对误差百分比（%RE，或%Bias）进行评估。我们预期三个重复样本的批内均值与标称浓度的相对误差应在±25.0%范围内，仅上限和下限质控样本可放宽至±30.0%。该标准在60批实验（共30次完整运行）中的全部五个质控水平均得到满足。通常情况下，批内准确度优于预设目标，所有质控水平的平均绝对批内%RE为4.2%。在所有阴性对照（NTC）实验运行中（共30次），均未检测到阳性液滴。

还通过计算每批中各质量控制水平的批内均值来评估批间准确度和精密度。除上下限质量控制样本的批间精密度预期不超过30.0% CV外，其余样本的批间精密度预期不超过25.0% CV。同样，对于批间准确度， ±预期回收率为25.0%，但上下限质控样本除外 ±预期为30.0%。观察到的实验间准确度和精密度显著优于这些目标值（表9），批间精密度范围为4.0%至8.5%，批间绝对准确度范围为1.0%至3.2%。总体而言，这些结果表明，该方法可在当前行业目标范围内实现充分的批内和批间准确度与精密度。本检测方法的动态范围为每2,500至2.5拷贝 µL 的 PCR 反应可根据这些结果确定，整体检测灵敏度为每 2.5 个拷贝 µL 的 PCR 反应体系。如前所述，可能可以验证更宽的动态范围。

接下来，需要在目标基质（本例中为泪液）中评估检测方法的准确性和精密度。通常，在临床研究开始之前需完成方法学验证，这意味着经载体治疗患者的泪液样本不太可能用于验证目的。因此，可通过将目标AAV载体加入来自志愿者供体的泪液中，人工制备基质加标质控样本（matrix-spiked QCs）。人泪液池样本由第三方机构（BioIVT）收集。为验证原理，使用了来自商业来源的表达eGFP的AAV2载体。该AAV2载体原液的浓度通过ddPCR实验经验性测定，测定过程未进行DNA提取步骤，具体操作如本方案所述。在每次运行中，将AAV2分别独立加标至三份泪液等分样本中，设置高浓度（预期为1.41 × 10³ 拷贝/µL PCR反应）和低浓度（28.2 拷贝/µL PCR反应）两个水平。同时设置未加标的等分样本作为对照，以证明该方法的特异性。

针对每批样品在每个加标水平下评估了批内性能。预计所有泪液样本的液滴数均至少达到10,000个。在全部六批共108个检测孔中，该标准均得到满足，每孔平均总液滴数为20,208个（表10）。接下来，各批中每个质控样品（QC）的双复孔之间的孔间变异系数（%CV）在高、低加标水平下均预期不超过25.0%。在全部六批共36组检测孔中，该标准也全部满足，平均孔间%CV为3.2%（表11）。

在每批实验中，针对每个独立制备的人工泪液加标样本，计算其批内均值和标准差，并据此计算每次检测中各浓度的批内均值，用于评估方法在基质中的准确度和精密度（表12）。我们预期在高、低加标水平下，批内%CV均不超过25.0%。该标准在六个批次中的每个水平均得到满足。通常情况下，基质中的批内精密度优于目标要求，高浓度水平的平均批内%CV为3.7%，低浓度水平为12.2%（总体为8.0%）。同时预期在两个加标水平下，批内%RE应在±25.0%范围内。该标准在六个批次中的每个水平也均得到满足。同样地，基质中的批内准确度通常优于目标要求，低浓度水平的平均批内绝对%RE为8.1%，高浓度水平为11.3%（总体为9.7%）。对于未加标的阴性对照，所有等分试样中均未检测到eGFP信号（表12），表明该方法在人泪液基质中具有特异性。

批间准确度和精密度也通过计算每批中各加标水平的批内均值来评估。预期批间精密度应 ≤25.0% CV，批间准确度应在 ±25.0% 相对误差（RE）范围内。实际观察到的批间准确度和精密度显著优于上述目标（表13），其中高浓度水平的批间精密度为5.5%，低浓度水平为7.1%；高浓度水平的绝对批间准确度为11.3%，低浓度水平为8.1%。综合这些结果表明，该方法在泪液基质中具有良好的准确度、精密度和特异性。

表5：用于确定检测方法动态范围的质量控制参数。 缩写：ULQC = 上限质量控制；HQC = 高质量控制；MQC = 中等质量控制；LQC = 低质量控制；LLQC = 下限质量控制；NTC = 无模板对照。请点击此处下载该表格。

表6：合成双链DNA质控品和NTC的总液滴数及阳性液滴与总液滴的比值。 缩写：ULQC = 上限质控品；HQC = 高浓度质控品；MQC = 中浓度质控品；LQC = 低浓度质控品；LLQC = 下限质控品；NTC = 无模板对照。请点击此处下载该表格。

表7：孔间质控统计结果（拷贝靶标/µL PCR反应）。 缩写：ULQC = 上限质控；HQC = 高质控；MQC = 中质控；LQC = 低质控；LLQC = 下限质控；NTC = 无模板对照。 请点击此处下载该表格。

表8：质控品的批内准确度与精密度（拷贝靶标/µL PCR反应）。 缩写：ULQC = 上限定量质控；HQC = 高浓度质控；MQC = 中浓度质控；LQC = 低浓度质控；LLQC = 下限定量质控；NTC = 无模板对照。请点击此处下载该表格。

表9：质控品的批间准确度与精密度（拷贝靶标/µL PCR反应）。 缩写：ULQC = 上限定量质控；HQC = 高浓度质控；MQC = 中浓度质控；LQC = 低浓度质控；LLQC = 下限定量质控；NTC = 无模板对照。请点击此处下载该表格。

表10：泪液样本的总液滴数。 请点击此处下载该表格。

表11：泪液样本孔间统计（拷贝数目标/µL PCR反应。 请点击此处下载此表格。

表12：泪液样本检测的批内准确度与精密度（拷贝靶标/µL PCR反应）。 请点击此处下载该表格。

表13：泪液样本检测的批间准确度与精密度（拷贝靶标/µL PCR反应）。 请点击此处下载该表格。

补充表 S1：本研究中使用的引物、探针及合成双链 DNA 质量控制序列。 请点击此处下载该表格。

讨论

数字PCR（ddPCR）实验方案中有多个步骤对实验的正确实施至关重要。第一个关键步骤是引物和探针的设计与优化。通常，在临床前或临床环境中，建议使用水解探针化学法（如TaqMan探针）而非染料法（例如SYBR Green），因为前者具有更高的特异性。此外，扩增靶点的选择也至关重要。通常以载体中的目的转基因序列作为靶点。然而，在早期临床前研究阶段，或当难以区分载体转基因与基因组DNA时，可采用标准化的载体靶点。例如，可选择反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）、启动子、poly-A尾或这些载体元件之间的连接区域作为靶点。靶点的选择需根据载体设计而定。传统的定量PCR（qPCR）引物和探针设计策略及软件通常也适用于ddPCR。应选择能够产生一致退火温度（例如60°C）的设计参数，以减少所需的优化工作量。此外，建议为每个靶点设计、订购并评估至少三组不同的引物-探针组合，然后选择特异性最高（在阴性对照孔或相关靶DNA基质中无扩增信号）且灵敏度最佳（即检出限最低）的一组²⁰。

如果需要在qPCR和ddPCR之间转换检测方法，则建议首先使用qPCR优化检测条件，并确定所选引物探针组合在扩增效率为90%–110%、R² ≥ 0.98时的反应条件。然而，由于扩增效率的差异，ddPCR作为一种终点检测方法通常比qPCR灵敏度较低。至少建议在退火/延伸步骤中进行温度梯度实验，涵盖预期退火温度上下范围的温度条件，并评估不同温度下阴性与阳性液滴簇之间的“雨滴”（rain）现象以及荧光信号幅度的分离情况。如果实验空间允许，建议分别设置独立的专用工作区，用于预混液配制、模板添加和扩增反应。在条件允许的情况下，这些工作区应通过单向工作流程在物理上分隔，并配备工程控制措施，如受控出入和差异气压，以降低交叉污染和假阳性结果的风险。如果无法实现上述条件，则必须采取极为严格的措施防止交叉污染。

本方案中有两个步骤对于更习惯于qPCR检测开发的研究者来说可能显得不同寻常。第一个步骤是在PCR主混合液中加入限制性内切酶。在ddPCR扩增过程中，每个液滴都会被热循环至终点。在一个优化良好的检测中，这将产生两类液滴群体：一类表现出持续高水平的荧光信号——即阳性液滴；另一类则持续表现出低水平的荧光信号——即阴性液滴。如果发生PCR干扰，可能会导致PCR扩增起始不同步，使得某些液滴无法达到扩增平台期，从而产生不一致的荧光终点信号。在这种情况下，液滴会分布在阴性和阳性群体之间，形成一种称为ddPCR雨状现象（ddPCR rain）的现象。这可能导致对靶标的定量不准确，并且阈值的设定会不一致且带有主观性。我们建议将阈值设置在阴性对照（NTC）信号略高的位置，这样可以最大限度地减少雨状现象对最终定量结果的影响，因为即使某些液滴未完全扩增至终点，仍会被视为阳性。腺相关病毒（AAV）具有高度复杂的二级结构，根据扩增靶点的不同，这种结构可能降低引物和探针的可及性，从而引起PCR干扰并导致雨状现象。在主混合液中加入限制性内切酶可切割这些二级结构，提高引物和探针的结合可及性，减少雨状现象，从而可能提升检测的准确性。此前已有文献描述过在ddPCR反应中加入限制性内切酶的效果^25,32。任何限制性内切酶均可使用，只要确认其不会在目标扩增区域内切割即可。无需进行预先消化步骤或更换缓冲液体系。

第二个不寻常的步骤是制备含有AAV的泪液样本。在本方案中，采用了1:10（或更高）比例的泪液，并随后对样本进行加热处理。通常情况下，当收集泪液时 通过 毛细管，这是一种广泛使用的采集方法，平均可采集约10.0 µL³³稀释有助于解决样本体积有限的问题，并提供足够的材料用于重复孔检测。尽管这会降低理论上的检测下限，但由于ddPCR具有高度灵敏性，仍应能够检测到除极少数载体颗粒外的所有目标。该方法还可额外产生一个 "备份" 如果其中一个意外失败。在这种情况下，或当样本体积不足以运行两个孔时，可使用泊松误差来评估精确度。此外，当浓度低于检测限时，可通过合并孔数据来确定浓度。为进行微滴数字PCR（ddPCR）检测，必须将AAV载体从病毒衣壳中释放出来。一些AAV定量方法中包含了蛋白酶K消化步骤，以去除病毒衣壳。^34,35,36所有天然存在的AAV血清型的熔解温度均在约90 °C或以下，其中大多数低于80 °C；因此，这一项似乎没有必要包含³⁷仅加热似乎就足以释放载体DNA。

此外，数字PCR（ddPCR）通常对样本中可能影响qPCR检测的PCR抑制剂具有较低的敏感性。如果包含特定的DNA提取步骤，则还需要进行特定的验证，而本方案避免了这一要求。由于液体中载体基因组扩散的动力学特性，样本在加热前需进行稀释。在加热及随后的冷却过程中，当浓度足够高时，单链DNA基因组的正链和负链可相互退火形成双链中间体。加热前进行稀释可降低浓度，从而在数学上使形成足量双链中间体的可能性大大降低，避免对定量准确性的不利影响。需要注意的是，作为质控使用的合成DNA片段或线性化质粒不得经历此加热步骤。由于这些质控品为双链结构，加热会导致其转化为单链中间体。这些单链质控品在独立分配到液滴后，预期其检测浓度将比标称浓度高出两倍。或者，如果为统一方法而对质控品进行加热处理，则在重新配制和确定其标称浓度时必须考虑这一因素。

最后，关于样品制备，许多实验方案还建议包含DNase处理步骤，以去除任何未被衣壳包裹的载体DNA。当不需要定量与载体制备相关的游离DNA时（例如在进行剂量定量时），该步骤尤为关键。然而，在生物分布和生物脱落研究中，通常需要了解载体DNA的所有去向，无论其是否被衣壳包裹。因此，建议在这些研究中通常不进行DNase处理步骤。如果确定有必要包含DNase处理步骤，则该步骤应在稀释和加热之前进行。

本文展示了在符合“用途明确”和良好实验室规范的验证背景下，对方法的动态范围、灵敏度、准确性和精密度进行评估的代表性数据。目前该领域尚缺乏明确指导，导致各验证实验室需根据当前行业共识自行确定方法学的目标标准。不同研究团队所提出的目标标准有的高于本研究采用的水平^{19,20,21,22,23,24,25}，有的则低于本研究。在相关标准尚未被更严格定义之前，应根据方法预期的临床应用，在验证开始前选定目标标准。根据基于数据所作的后续决策，可能需要更高水平的准确性和精密度；相反，有时仅需提供简单的阳性或阴性结果即可满足需求。

该方法还涵盖了特异性评估和基质效应评估的建议。由未接受治疗的个体采集的泪液样本池在本检测中未能产生阳性结果，而当在推荐回收率范围内以高浓度和低浓度将目标载体掺入泪液时，均可检测到目标。理想情况下，这些评估还应包括含有内源性载体的基质样本（例如，在使用病毒载体治疗后采集的样本）。然而，在方法验证过程中，此类样本通常难以获得。为了提高验证的稳健性，可评估多个泪液样本池或从不同个体采集的泪液，以确定是否存在患者特异性的基质效应。最后，建议进行稳定性评估。在需要将DNA从生物基质中提取出来的实验流程中，可能需要分别评估样本本身和提取后DNA的稳定性。而在本实验流程中，样本可直接用于检测，无需进行DNA提取。因此，针对该方法的稳定性评估，应重点评估泪液样本的稳定性。通常建议进行室温（台面）、冷藏、冻融循环以及长期稳定性评估。本研究中未开展这些测试，但所建立的方法可用于此类评估，只需对输入样本进行相应处理即可。

总体而言，该方法已被证明是一种可靠、可重复且可验证的检测泪液样本中腺相关病毒（AAV）载体的分析方法。该方法可作为平台，适用于特定载体的检测，以支持临床试验，并为建立符合良好实验室规范的检测方法验证提供基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV-eGFP 载体	Charles River Laboratories	RS-AAV2-FL	批号 AAV2-0720-FL，用作原理验证载体
AutoDG 微滴数字 PCR 系统	Bio-Rad	QX200	可按照制造商’s 协议使用其他 ddPCR 系统。
AutoDG 探针用油	Bio-Rad	1864110	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
探针用 ddPCR 缓冲液对照	Bio-Rad	1863052	或使用与 ddPCR 系统和 PCR 化学体系兼容的材料。
ddPCR 微滴读取油	Bio-Rad	1863004	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
ddPCR 可穿刺箔封膜	Bio-Rad	1814040	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
96 孔半裙边 ddPCR 板	Bio-Rad	12001925	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
探针用 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）	Bio-Rad	1863023、1863024 或 1863025	使用与引物/探针及 ddPCR 系统兼容的预混液。
DG32 AutoDG 微流控卡盒	Bio-Rad	1864108	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
微滴读取仪	Bio-Rad	QX200	可按照制造商’s 协议使用其他 ddPCR 系统。
GeneAmp PCR 缓冲液	Applied Biosystems	N8080129	不适用
无核酸酶水	Ambion	AM9906	不适用
PCR 板封膜	Bio-Rad	PX1	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
AutoDG 用移液器吸头	Bio-Rad	1864120	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。
Pluronic F-68 非离子型表面活性剂	Gibco	24040	不适用
引物与水解探针	多种来源	多种货号	根据靶序列采用通用引物/探针设计方法进行设计。选择与 ddPCR 系统兼容的荧光报告基团和淬灭基团。
限制性内切酶	多种来源	多种货号	根据靶扩增序列而定。使用在扩增区域内无切割位点的限制性内切酶。
剪切鲑鱼精子 DNA	ThermoFisher	AM9680	不适用
合成 DNA 基因片段或线性化质粒	多种来源	多种货号	设计包含靶扩增区域的合成 DNA 片段，用于质量控制
TE 缓冲液	Teknova	T0224	确保配制或购买的试剂为无核酸酶。10 mM Tris-HCl，1.0 mM EDTA，pH=8.0
Touch 梯度 PCR 仪	Bio-Rad	C1000	或使用与 ddPCR 系统兼容的材料。