Summary
Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van goede laboratoriumpraktijken in de conforme detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in menselijke tranen door druppel digitale polymerasekettingreactie ter ondersteuning van de klinische ontwikkeling van gentherapievectoren.
Abstract
Het gebruik van virale vectoren voor de behandeling van genetische ziekten is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen, met meer dan 2.000 studies die tot nu toe zijn geregistreerd. Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren hebben bijzonder succes gevonden bij de behandeling van ooggerelateerde ziekten, zoals geïllustreerd door de goedkeuring van voretigene neparvovec-rzyl. Om nieuwe therapieën op de markt te brengen, vragen regelgevende instanties doorgaans om gekwalificeerde of gevalideerde biosheddingstudies om de afgifte van de vector in het milieu te evalueren. Er zijn echter geen officiële richtlijnen voor de ontwikkeling van moleculaire testen ter ondersteuning van dergelijke afscheidingsstudies vrijgegeven door de Food and Drug Administration van de Verenigde Staten, waardoor ontwikkelaars zelf de beste praktijken kunnen bepalen. Het doel van dit protocol is om een valideerbaar protocol te presenteren voor de detectie van AAV-vectoren in menselijke tranen door druppel digitale polymerasekettingreactie (ddPCR) ter ondersteuning van klinische biosheddingstudies. Dit manuscript bespreekt de huidige industriële benaderingen van moleculaire assayvalidatie en toont aan dat de methode de acceptatiecriteria voor doeltests overschrijdt die momenteel in white papers worden voorgesteld. Ten slotte worden stappen besproken die van cruciaal belang zijn voor de prestaties van elke ddPCR-test, ongeacht de toepassing.
Introduction
Gentherapiedefinities variëren, maar induceren over het algemeen een opzettelijke en vaak verwachte permanente afwisseling van een specifieke DNA-sequentie van het cellulaire genoom om de expressie van een gen te wijzigen of te manipuleren of om de biologische eigenschappen van een levende cel voor een klinisch doel te veranderen 1,2. Virale vectoren worden steeds vaker gebruikt als voertuigen voor gentherapie vanwege hun efficiëntie van transductie, waarbij één rapport suggereert dat meer dan 70% van de huidige klinische onderzoeken naar gentherapie virale vectoren gebruiken3. De belangstelling voor virale vectoren voor gentherapie neemt gestaag toe. Het kwartaalrapport van 4 2022 over het landschap van gen-, cel- en RNA-therapie van de American Society of Gene and Cell Therapy meldde dat in 2022 de pijplijn voor gen-, cel- en RNA-therapie van preklinisch naar pre-registratie met 7% groeide, waardoor het totale aantal therapieën in ontwikkeling op 3.726 kwam, waarvan 2.053 (55%) gentherapieënwaren 4. De Amerikaanse Food and Drug Administration (USA FDA) heeft momenteel 27 cel- en gentherapieën goedgekeurd voor klinisch gebruik bij mensen, waarvan er vijf specifiek virale vectoren gebruiken5.
Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) hebben specifieke interesse gekregen als voertuigen voor gentherapie. Een recente meta-analyse onthulde dat er in de afgelopen twee decennia ongeveer 136 klinische onderzoeken zijn geweest naar het gebruik van AAV's6. Bovendien zijn drie van de vijf door de FDA goedgekeurde gentherapieën van de VS gebaseerd op AAV. Dit komt door hun zeer bewerkbare aard, breed gastheerbereik dat kan worden afgestemd op basis van het gebruik van specifieke natuurlijk voorkomende of kunstmatig gemanipuleerde vectoren, lage pathogeniteit en toxiciteit bij de mens, en over het algemeen lage immunogeniciteit 7,8. AAV's zijn ook met succes gebruikt om oogziekten te behandelen in een goedgekeurde klinische omgeving. Voretigene neparvovec-rzyl is een op AAV2 gebaseerde therapie die in 2017 werd goedgekeurd door de Amerikaanse FDA en in 2018 door het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) voor de behandeling van biallelische RPE65-mutatie-geassocieerde retinale dystrofie9.
Met de toenemende belangstelling voor de ontwikkeling van op AAV gebaseerde therapieën komt de behoefte aan regelgevende begeleiding bij assays. Nauwkeurige detectie en kwantificering van elke virale vector is een integraal onderdeel van de ontdekkings-, productie- en preklinische / klinische testfasen van productontwikkeling. De Amerikaanse FDA is begonnen met het uitgeven van enkele richtlijnen voor gentherapieën, waaronder over de chemie, productie en controle voor experimentele nieuwe medicijntoepassingen voor menselijke gentherapie 10, follow-up op lange termijn na toediening van gentherapie 11, replicatie-competente retrovirustests12 en aanbevelingen voor microbiële vectoren die worden gebruikt in gentherapieën 13. Het EMA heeft ook een reeks richtlijnen vrijgegeven met betrekking tot de ontwikkeling van gentherapieproducten die over het algemeen overeenkomen met de aanbevelingen van de FDA, hoewel er enkele verschillen bestaan14. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel deze richtsnoeren geen juridisch afdwingbare verantwoordelijkheden vastleggen, behalve wanneer naar specifieke voorschriften wordt verwezen, ze duidelijkheid bieden over het huidige denken van regelgevende instanties over het onderwerp en hun verwachtingen voor testen die vereist zijn voor geneesmiddelenaanvragen en wettelijke goedkeuring.
De FDA beveelt specifiek aan dat studies moeten worden uitgevoerd om de distributie, persistentie en klaring van een vector vanaf de plaats van toediening te beoordelen om oculaire en niet-oculaire weefsels, intraoculaire vloeistoffen en bloed te targeten15. Deze nemen de vorm aan van biodistributie- en afstotingsstudies. Biodistributiestudies evalueren de blootstelling door te onderzoeken hoe een product zich vanaf de plaats van toediening door het lichaam van een patiënt verspreidt. Shedding evalueert specifiek de afgifte van het product van de patiënt in het milieu en verhoogt de mogelijkheid van overdracht van de vector naar onbehandelde personen16. De FDA doet aanbevelingen voor het ontwerp van biodistributie- en afscheidingsstudies met betrekking tot de frequentie van monsterverzameling, de duur van de monsterverzameling, soorten verzamelde monsters en opslagomstandigheden.
Bovendien beveelt de FDA het gebruik van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR of real-time PCR) aan voor de kwantitatieve detectie van vectorgenomen vanwege het gemak van prestaties, het formaat met hoge doorvoer, snelle doorlooptijden en testgevoeligheid. Er is echter een relatief gebrek aan aanbevelingen voor het ontwerp en de prestatiebeoordeling van moleculaire methoden in vergelijking met die voor kleine en grote moleculen. Veel van de richtlijnen voor dergelijke studies zijn moeilijk toe te passen op moleculaire methoden vanwege het unieke en complexe ontwerp van zowel de producten als de testen zelf, wat vragen oproept over de geschiktheid van de beschikbare platforms voor de aanbevolen beoordelingen en geschikte methoden voor testvalidatie. Tot op heden heeft de FDA geen formele validatie van PCR-gebaseerde testen vereist, hoewel het EMA deze vereiste heeft opgelegd17. In het licht van deze leegte hebben verschillende groepen en workshops white papers en aanbevelingen uitgegeven die fabrikanten en contractonderzoeksorganisaties hebben geprobeerd te volgen 18,19,20,21,22,23,24,25. De meeste van deze aanbevelingen zijn specifiek geschreven met qPCR-assays in gedachten, met suggesties of wijzigingen voor opkomende platforms, zoals droplet digital PCR (ddPCR), alleen opgenomen als relevant geacht. Meer recente aanbevelingen hebben zich gericht op overwegingen voor ddPCR-assays, maar hebben zich grotendeels gericht op hun toepassingen voor vectorgenoomkwantificering in een productieomgeving in plaats van in de complexe biologische matrices die worden aangetroffen in biosheddingstudies.
Afhankelijk van de klinische toepassing en doelen, kan ddPCR de voorkeur krijgen boven qPCR ter ondersteuning van biodistributie- en afstotende studies vanwege de verhoogde gevoeligheid van ddPCR en het vermogen om matrixinterferentie te verwerken in vergelijking met qPCR. Bovendien kan, door de verdeling van monsters in ongeveer 20.000 druppels, een nauwkeurige kwantificering van het kopienummer worden bereikt zonder het gebruik van een standaardcurve met behulp van Poisson-statistieken, waardoor de ontwikkeling en validatie van de methode wordt vereenvoudigd. Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde aanpak te beschrijven voor de ontwikkeling en validatie van een ddPCR-gebaseerde methode voor de detectie van AAV-vectoren in tranen verzameld van het oculaire oppervlak ter ondersteuning van klinische biosheddingstudies.
Protocol
1. Bereiding van een synthetisch DNA-fragment
- Ontwerp en bestel een synthetisch DNA-fragment met het doelversterkingsgebied voor gebruik als kwaliteitscontrole.
- Zorg ervoor dat de sequentie de volledige ampliconsequentie bevat van de voorwaartse primer tot de omgekeerde primer van het doelgen van belang, met een uitbreiding van vier tot zes basenparen van sequentie aan de 5'-uiteinden van elke primerbindingssequentie.
- Vermijd homopolymeren van adenine en thymine groter dan 12 basenparen of guanine- en cytosinebasenparen groter dan acht basenparen, omdat lange homopolymeren de synthese van het genfragment kunnen verstoren.
OPMERKING: Als amplicons dergelijke sequenties bevatten, kunnen basisvervangingen worden uitgevoerd zolang de gloeiplaatsen voor de primers en sondes worden gehandhaafd. - Als alternatief, bereid een lineair plasmide met het amplicon met behulp van typische kloonstrategieën.
- Centrifugeer de buis met het synthetische DNA-fragment in een microcentrifuge gedurende ~ 10 s om ervoor te zorgen dat materiaal op de bodem van de buis wordt verzameld.
- Resuspendeer het synthetische DNA-fragment met behulp van tris-EDTA (TE) buffer tot een concentratie van 1,0 × 1010 kopieën/μL, of indien van toepassing op basis van het doeltestbereik.
- Vortex kort, dan incubeer bij 50 °C gedurende 20 ± 5 minuten. Afkoelen op ijs.
- Bereid meerdere, idealiter aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar bij -70 tot -90 °C tot gebruik.
OPMERKING: Synthetische DNA-fragmenten die op deze manier zijn bereid, zijn doorgaans stabiel gedurende ten minste 24 maanden vanaf de datum van resuspensie. - Bepaal indien gewenst de exacte concentratie van de geprepareerde synthetische DNA-voorraad voorafgaand aan gebruik als kwaliteitscontrole, of schat de nominale concentratie op basis van de gebruikte resuspensie.
2. Voorbereiding van primers en sonde
- Ontwerp en bestel primers en een hydrolysesonde om het gewenste versterkingsgebied te richten met behulp van typische ontwerpstrategieën26,27.
- Gebruik een 5' fluorescerende reporter kleurstof (bijv. FAM) en een 3' quencher (bijv. Iowa Black dark quencher) die compatibel is met het ddPCR-systeem.
OPMERKING: Er bestaan talloze softwarepakketten voor het ontwerpen van PCR-tests en deze kunnen worden gebruikt. Primer-BLAST van het National Center for Biotechnology Information28 wordt bijvoorbeeld veel gebruikt vanwege de robuuste opties voor testontwerp en het gemak waarmee specificiteit bioinformatisch kan worden beoordeeld om mogelijke off-target effecten te identificeren. Opgemerkt moet worden dat de voorbereiding van primers en sondes kan verschillen van de hier vermelde stappen, afhankelijk van het formaat waarin ze worden geleverd.
- Gebruik een 5' fluorescerende reporter kleurstof (bijv. FAM) en een 3' quencher (bijv. Iowa Black dark quencher) die compatibel is met het ddPCR-systeem.
- Centrifugeer de buizen met de voorwaartse primer, omgekeerde primer en sonde in een microcentrifuge gedurende ~ 10 s om materiaal naar de bodem van de buis te pelleteren.
- Resuspendeer de primers tot 20 μM met behulp van TE-buffer. Vortex kort.
- Resuspendeer de sonde tot 10 μM met behulp van een TE-buffer. Vortex kort.
- Bereid meerdere, idealiter aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar bij minimaal -20 °C tot gebruik.
OPMERKING: Primers en sondes die op deze manier zijn bereid, zijn meestal stabiel gedurende ten minste 24 maanden vanaf de datum van resuspensie.
3. Bereiding van de verdunningsbuffer van het monster
- Ontdooi PCR-buffer en geschoren zalmsperma-DNA bij kamertemperatuur. Vortex grondig te mengen.
- Bereid een monsterverdunningsbuffer voor overeenkomstig tabel 1.
- Vortex grondig. Bewaren bij 2-8 °C tot 1 maand na bereiding.
Tabel 1: Bereiding van de verdunningsbuffer van het monster. Klik hier om deze tabel te downloaden.
4. Bereiding van mastermix
- Ontdooi de ddPCR-mastermix voor sondes, voorwaartse primer, omgekeerde primer en sonde bij kamertemperatuur en laat deze voor gebruik ten minste 10 minuten na het ontdooien opwarmen. Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik.
OPMERKING: Deze reagentia moeten volledig op kamertemperatuur worden gebracht om een efficiënte druppelvorming te garanderen. Houd reagentia niet op ijs tijdens de bereiding.- Vortex centrifugeer grondig en kort in een minicentrifuge voor gebruik.
OPMERKING: Restrictie-enzymen worden meestal geleverd in glycerol en moeten onmiddellijk voor gebruik uit de opslag worden verwijderd. Meng voorzichtig. Niet vortexen.
- Vortex centrifugeer grondig en kort in een minicentrifuge voor gebruik.
- Bereid een PCR-mastermix voor voor elk versterkingsdoel. Zie tabel 2 voor een voorgestelde PCR-mastermixsamenstelling en wijzig de concentraties van primers en sondes indien nodig.
- Grondig vortex en kort centrifugeren voorafgaand aan de toevoeging van restrictie-enzym. Voeg het restrictie-enzym toe en keer om om te mengen.
OPMERKING: In deze stap is 22 μL PCR-reactie vereist om een eindvolume van 40 μL PCR-reactie na druppelvorming te verkrijgen (bestaande uit 15 μL PCR-mastermix, 5,0 μL sjabloon en 20 μL druppelgeneratieolie).
- Grondig vortex en kort centrifugeren voorafgaand aan de toevoeging van restrictie-enzym. Voeg het restrictie-enzym toe en keer om om te mengen.
- Voeg 16,5 μL mastermix toe aan elke put volgens de plaatkaart. Zie Figuur 1 voor een voorbeeld van een plaatkaart voor een validatienauwkeurigheid en precisie-uitvoering.
- Zorg ervoor dat een plaat drie onafhankelijke preparaten van de kwaliteitscontrole (QC) -serie bevat, drie onafhankelijk geteste endogene traanaliquots getest, gepiekt tot een hoog en laag niveau en niet-geprikt, en drie onafhankelijke no template controls (NTC's).
- Varieer de lay-out van deze putten over de plaat, waarbij set 1 wordt geladen in volgorde van afnemende concentratie, set 2 wordt geladen in volgorde van toenemende concentratie en set 3 in een willekeurige volgorde wordt geladen om te evalueren of er plaatsspecifieke effecten zijn.
- Array de monsters om zoveel mogelijk van een kolom te vullen en vul ongebruikte putten in een kolom met besturingsbuffer. Neem meerdere endogene controlepartijen op (bijvoorbeeld meer plassen tranen of tranen verzameld van individuen) in de resterende putten, indien gewenst.
- Sluit de plaat af met doorzichtige zelfklevende folie. Houd de plaat op kamertemperatuur tijdens het voorbereiden van de sjabloon. U kunt de plaat ook maximaal 4 uur bij 2-8 °C houden, maar deze gedurende ten minste 10 minuten weer op kamertemperatuur brengen voordat de sjabloon wordt toegevoegd.
Tabel 2: Voorbeeld PCR master mix voorbereiding. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: Voorbeeld plaatkaart voor validatienauwkeurigheid en precisie-uitvoering. Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. QC's voorbereiden
- Ontdooi synthetische DNA-fragmenten of gelineariseerde plasmiden bij kamertemperatuur en laat ze vóór gebruik minstens 10 minuten na het ontdooien opwarmen. Breng de sjablonen op kamertemperatuur om een efficiënte druppelvorming te garanderen.
- Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik. Vortex centrifugeer grondig en kort in een minicentrifuge voor gebruik.
- Bereid QC-verdunningen met behulp van de monsterverdunningsbuffer als verdunningsmiddel. Een voorbeeld van de aanbevolen concentraties ter voorbereiding op een validatienauwkeurigheid en precisie-uitvoering wordt weergegeven in tabel 3.
OPMERKING: Na de succesvolle voltooiing van nauwkeurigheids- en precisieruns hoeven alleen de hoge kwaliteitscontrole (HQC), gemiddelde kwaliteitscontrole (MQC) en lage kwaliteitscontrole (LQC) op elke plaat te worden uitgevoerd. Voor nauwkeurigheid en precisieruns zijn ten minste drie onafhankelijke verdunningen van de QC's opgenomen voor de beoordeling van de nauwkeurigheid en precisie binnen de assay. Na nauwkeurigheid en precisieruns hoeft slechts één verdunningsreeks te worden opgenomen. - Bewaar de verdunningen na bereiding bij kamertemperatuur totdat ze aan de plaat worden toegevoegd.
- Bewaar de verdunningen op ijs of bij 2-8 °C indien nodig. Laat de verdunningen vóór het volgende gebruik gedurende ten minste 10 minuten voor gebruik opwarmen tot kamertemperatuur. Gooi de QC's aan het einde van de dag weg.
Tabel 3: Voorbeeld van een kwaliteitscontrole (QC) voorbereiding met behulp van synthetische dubbelstrengs DNA-fragmenten. Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om deze tabel te downloaden.
6. Bereiding van de monsters
- Ontdooi traanmonsters die zijn verzameld uit een klinisch onderzoek bij kamertemperatuur totdat ze zijn ontdooid en laat ze vóór gebruik ten minste 10 minuten na het ontdooien opwarmen.
- Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik. Vortex centrifugeer grondig en kort in een microcentrifuge voor gebruik.
- Verdun traanmonsters 1:10 (of meer) met behulp van monsterverdunningsbuffer als verdunningsmiddel in 0,2 ml PCR-buizen of 8-well PCR-strips. Sluit de buizen af.
OPMERKING: Afhankelijk van de verwachte concentratie van het doelwit in tranen, kan het nodig zijn om de monsters verder te verdunnen of om meerdere verdunningen van elk monster te testen. - Verwarm de monsters in een thermische cycler gedurende 10 minuten bij 95 °C, gevolgd door een temperatuur van ten minste 5 minuten bij 4 °C te houden om af te koelen. Gebruik een hellingsnelheid van 3 °C/s.
OPMERKING: Monsters mogen in de thermische cycler bij 4 °C blijven tot gebruik op dezelfde dag of kunnen worden ingevroren bij -70 tot -90 °C voor langere opslag. Deze stap dient om de vector capside te denatureren, waardoor het genoom vrijkomt. Omdat QC synthetische DNA-fragmenten of gelineariseerde plasmiden dubbelstrengs zijn, mogen ze deze verwarmingsstap niet ondergaan. - Breng de monsters na afkoeling terug tot kamertemperatuur (of, indien bevroren, ontdooi bij kamertemperatuur) en laat ten minste 10 minuten opwarmen.
OPMERKING: De monsters moeten volledig op kamertemperatuur worden gebracht om een efficiënte druppelvorming te garanderen.
7. Template toevoeging
- Haal de ddPCR-plaat op die de mastermix bevat. Vortex elk monster of QC-verdunningsbuis grondig en kort centrifugeren om het materiaal op te vangen.
- Verwijder zelfklevende film en voeg 5,5 μL QC's of monsters toe aan de juiste putjes van de 96-putplaat, volgens de plaatkaart.
OPMERKING: Raadpleeg stap 4.2.1 voor uitleg over de vereiste volumes - Voeg 5,5 μL monsterverdunningsbuffer toe aan de NTC-putten.
- Druppelgeneratie vereist dat alle putjes van een kolom een reactie- of buffercontrole hebben. Als putjes van een kolom geen monsterreacties bevatten, verdun dan 2x ddPCR buffercontrole 1:2 met nucleasevrij water. Voeg 22 μL 1x ddPCR buffercontrole toe aan lege putten van een kolom.
OPMERKING: Als een hele kolom niet wordt gebruikt, is het niet nodig om bufferbeheer aan deze putten toe te voegen. - Voeg een doorboorbare folieafdichting toe aan de plaat. Plaats de plaat in de plaatsealer en sluit gedurende 5 s af bij 180 °C.
- U kunt de plaat ook afdichten in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant van het ddPCR-systeem.
- Vortex de plaat op maximale snelheid gedurende ten minste 30 s (met behulp van de continue vortexing-instelling; gebruik geen touch vortexing) en centrifugeer kort in een plaatspinner.
OPMERKING: Grondig en volledig mengen van de plaat in deze stap is van cruciaal belang voor een goede verdeling van de PCR-reactie in druppels. Zorg ervoor dat er geen bubbels zichtbaar zijn in de putten. Indien nodig kan de plaat maximaal 4 uur op 2-8 °C worden gehouden voordat de druppel wordt gegenereerd. Indien vastgehouden, laat de plaat minimaal 10 minuten op kamertemperatuur komen voordat de druppel wordt gegenereerd.
8. Geautomatiseerde druppelgeneratie, thermische cycli en druppelaflezing
- Genereer als volgt druppels in de geautomatiseerde druppelgenerator.
- Selecteer op het aanraakscherm de kolommen op de plaatkaart met monsters. Het dek van het instrument zal oplichten om aan te geven welke verbruiksartikelen (DG32-patronen, tips, afvalcontainer, druppelgeneratieolie) nodig zijn. Gele lampjes geven aan dat het nodig is om een verbruiksartikel toe te voegen, terwijl groene lampjes aangeven dat er voldoende verbruiksartikelen beschikbaar zijn.
- Laad de druppelgenerator van achter naar voren.
- Zorg er voor hydrolysesondes voor dat de druppelgeneratieolie voor sondes is geïnstalleerd en dat er voldoende olie overblijft voor het aantal putten. Als alternatieve PCR-chemicaliën worden gebruikt, zorg er dan voor dat er een compatibele druppelgeneratieolie is geïnstalleerd.
- Plaats een koud blok in de druppelplaathouder. Zorg ervoor dat het blok volledig blauw gekleurd is en er geen roze zichtbaar is. Plaats een nieuwe 96-well ddPCR plaat in het koude blok.
- Plaats de voorbereide PCR-plaat in de monsterplaathouder. Sluit het deksel van het apparaat. Druk op start voor het genereren van druppels.
- Na druppelvorming wordt in totaal 40 μL per reactie automatisch overgebracht naar de nieuwe PCR-plaat.
- Verwijder binnen 30 minuten na het voltooien van de druppelgeneratie de plaat met de druppels uit het koude blok. Werk voorzichtig, want de druppels zijn in dit stadium het meest kwetsbaar.
- Voeg een doorboorbare folieafdichting toe aan de plaat. Plaats de plaat in de plaatsealer en sluit gedurende 5 s af bij 180 °C.
- U kunt de plaat ook afdichten in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant van het ddPCR-systeem.
- Plaats de plaat in een compatibele thermische cycler. Voer de fietscondities in (zie tabel 4).
- Houd na het einde van de thermische cyclus de plaat in de thermische cyclus, overgebracht naar 2-8 °C, of lees deze onmiddellijk af.
OPMERKING: Het vasthouden van de plaat gedurende 12 uur bij 4-12 °C kan het aantal druppels verbeteren, maar dit is niet vereist. Voldoende druppels moeten worden verkregen zonder de hold. - Laad de plaat in de druppellezer, zorg ervoor dat er voldoende lezer olie overblijft en de afvalcontainer voldoende ruimte heeft. Lees de druppeltjes. Voer druppelaflezing uit binnen 24 uur na de start van de thermische cyclus.
Tabel 4: Typische thermische cyclusomstandigheden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
9. Data-analyse
OPMERKING: Een minimum van 10.000 druppels per put is nodig voor de juiste berekening van de concentratie met behulp van Poisson-statistieken. Probeer geen analyse uit te voeren op putten met minder dan 10.000 druppels.
- Er is een drempel nodig om de druppels als positief of negatief te definiëren. De ddPCR-analysesoftware past automatisch een drempel toe die per put kan verschillen. Stel echter handmatig een drempel in voor alle putten van de plaat op iets boven de fluorescerende intensiteit van de NTC-putten voor consistentere, nauwkeurigere en nauwkeurigere resultaten.
OPMERKING: Een juiste plaatsing van de drempel kan optimalisatie vereisen, afhankelijk van de scheiding van de positieve en negatieve druppels en hoeveel druppelregen er bestaat (zie figuur 2). In dit voorbeeld toont de druppelamplitudegrafiek voorbeeldputten op elk QC-niveau en de NTC. De paarse lijn geeft een drempel van 1.000 aan, iets boven de negatieve druppelpopulatie. - Poisson statistische modellering vereist ten minste drie positieve druppels om de concentratie met 95% betrouwbaarheid te berekenen. Beschouw alle putten die nul, één of twee positieve druppels bevatten als negatief en ingesteld op een concentratie van nul27.
- Bereken het kopienummer in elk scheurmonster opnieuw.
- De concentratie, in kopieën/μL, wordt vermeld in het gegevensrapport. Gebruik deze waarde om de concentratie in kopieën/μL van het oorspronkelijke monster (d.w.z. in het traanmonster) te bepalen.
- Om de ddPCR-reactieverdunning te berekenen, deelt u het initiële PCR-reactievolume voorafgaand aan druppelvorming door het volume van de toegevoegde sjabloon. Wanneer de volumes die in deze methode worden gepresenteerd, worden gebruikt, levert dit een waarde van 4 op.
- Bepaal de seriële verdunningsfactor van het oorspronkelijke monster (stap 6.2).
- Om de kopieën/μL in het monster te bepalen, vermenigvuldigt u de kopieën/μL met de ddPCR-reactieverdunning en vervolgens met de seriële verdunningsfactor. De concentratie in kopieën/μL gegenereerd in het gegevensrapport was bijvoorbeeld 966; Er werd 5,5 μL sjabloon toegevoegd per reactie van 22 μL. Een 1:50.000 seriële verdunning van het monster werd gebruikt.
- Als meerdere verdunningen van hetzelfde monster zijn getest, analyseert u alle geldige, binnen het bereik verdunningen en berekent u het gemiddelde.
- Bereken voor elke QC de verwachte kopieën/μL PCR-reactie door de concentratie van de gegeven QC-verdunning (in kopieën/μL) te delen door het ddPCR-reactievolume (20 μL). Dit maakt het mogelijk om deze nominale waarde direct te vergelijken met de kopieën/μL-waarde in het gegevensrapport zonder verdere berekeningen.
OPMERKING: Deze aanpak werd ook gebruikt voor de analyse van de spiked tear samples die in de representatieve resultaten werden gebruikt. - Bepaal de gemiddelde waarde, de standaardafwijking, de variatiecoëfficiënt (%CV) en de procentuele relatieve fout ten opzichte van de nominale concentratie (%RE) van het monster of de QC-waarde met behulp van de replicatieputten (inclusief meerdere verdunningen indien van toepassing).
- Voor de beoordeling van de precisie van de tussenput, bepaalt u dit voor elk van de putduplicaten, indien inbegrepen.
- Voor de beoordeling van de nauwkeurigheid en precisie binnen de assay, bepaalt u dit voor elke verdunningsreeks of aliquot die binnen een batch wordt gebruikt.
- Voor de beoordeling van de nauwkeurigheid en precisie tussen de assays bepaalt u dit met behulp van de intra-assaymiddelen van elk van de opgenomen batches.
Figuur 2: Voorbeeld van het instellen van de drempel. Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
10. Acceptatiecriteria voor de test
- Gebruik de volgende specificaties voor de berekende gegevens voor elke batch om te bepalen of de batch acceptabel is. Als niet aan deze voorwaarden wordt voldaan, maakt u de batch ongeldig en herhaalt u deze.
OPMERKING: Deze criteria zijn vastgesteld als een consensus van gepubliceerde white papers over PCR-gebaseerde assayvalidatie 18,19,20,21,22,23,24,25. Het kan nodig zijn de streefcriteria te wijzigen naargelang van de klinische toepassing. - Geen sjabloonbesturingselement (NTC)
- Zorg ervoor dat elke NTC-put ten minste 10.000 druppels heeft.
- Zorg ervoor dat elke NTC-put minder dan 3 positieve druppels heeft.
- QC's en assay bereik
- Zorg ervoor dat elke QC-put ten minste 10.000 druppels heeft.
- Zorg ervoor dat de nauwkeurigheid van replicatieputten met een QC-concentratie ≤25,0% CV is, behalve bij de boven- en ondergrenzen van kwantificering, waar ≤30,0% acceptabel is. Beoordeel dit onafhankelijk voor elke QC-set en concentratieniveau.
- Zorg ervoor dat de relatieve fout van de naberekende concentratie bij elk gemiddeld QC-niveau binnen ±25,0% RE van de nominale concentratie (kopieën/PCR-reactie) ligt, behalve bij de boven- en ondergrenzen van de kwantificering, waar ±30,0% RE aanvaardbaar is. Beoordeel dit onafhankelijk voor elke QC-set en concentratieniveau.
- Zorg ervoor dat ten minste 2/3 van de QC-monsters (bijv. Vier van de zes resultaten) en 50% van de QC-monsters op elk niveau (laag, gemiddeld, hoog) aan deze richtlijnen voldoen.
- Monsters
- Zorg ervoor dat de te analyseren monsterputten ten minste 10.000 druppels bevatten.
- Zorg ervoor dat de precisie van replicatieputten van een te analyseren monsterverdunning ≤25,0% CV is.
- Zorg ervoor dat ten minste één opgenomen verdunning van het gegeven monster binnen het gedefinieerde kwantificeringsbereik van de bepaling valt, zoals hierboven gedefinieerd op basis van de bovenste en onderste grens-QC's.
- Als alle verdunningen inbegrepen resultaten opleveren die groter zijn dan de gedefinieerde bovengrens van de kwantificering en als er voldoende monstervolume overblijft, herhaalt u de bepaling met een hogere verdunning van het monster.
- Als alle verdunningen inbegrepen een resultaat opleveren dat lager is dan de ondergrens van de kwantificering en als er voldoende monstervolume overblijft, herhaalt u de bepaling met een lagere verdunning van het monster.
OPMERKING: Monsters die meer dan drie positieve druppels bevatten, maar die een concentratie hebben die onder de ondergrens van de kwantificering ligt, kunnen worden beschreven als detecteerbaar, maar niet kwantificeerbaar.
Representative Results
Voor demonstratieve doeleinden werd een test ontwikkeld die is ontworpen om een commercieel verkrijgbare, verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) -expressie AAV2-vector te detecteren, met een synthetisch dubbelstrengs DNA-fragment dat eGFP bevat als kwaliteitscontrole. Momenteel is er een voortdurende discussie over de vraag of de vector zelf of een synthetisch DNA-fragment of gelineariseerd plasmide het meest geschikt is voor gebruik als de QC. Over het algemeen kan een synthetisch DNA-fragment of gelineariseerd plasmide worden gebruikt als gelijkwaardigheid met de vector wordt aangetoond bij de ontwikkeling van de methode (gegevens niet getoond). Primers en probes zijn ontworpen en geoptimaliseerd om het eGFP-transgen te detecteren. Zie aanvullende tabel S1 voor de sequenties die in dit werk worden gebruikt. De concentratie van de QC-fragmentvoorraad werd empirisch bepaald met behulp van ddPCR. Alle testen werden uitgevoerd met behulp van de concentraties en PCR-condities die als voorbeelden in de protocolsectie worden gegeven.
Voor qPCR-assays wordt aanbevolen om de lineariteit, gevoeligheid, dynamisch bereik, nauwkeurigheid en precisie van de standaardcurve te evalueren. Aangezien ddPCR niet afhankelijk is van een standaardcurve voor doelkwantificering, moeten deze aanbevelingen worden gewijzigd. In plaats daarvan werden QC's bestaande uit synthetische dubbelstrengs DNA-fragmenten verdund tot verschillende concentraties om het verwachte kwantificeerbare bereik van een ddPCR-reactie op basis van de Poisson statistische modellering te overbruggen, gebruikt 29,30,31,32 om het dynamische bereik en de gevoeligheid te definiëren en om nauwkeurigheid en precisie te evalueren. De keuze van QC-concentraties was voornamelijk gebaseerd op de verwachte verhouding van positieve tot totale druppels in een put bij een bepaalde concentratie. Wiskundig gezien is ddPCR theoretisch het meest nauwkeurig wanneer ongeveer 80% van de partities positief versterken. Naarmate de positieve tot totale druppelverhouding boven 0,8 stijgt, neemt de nauwkeurigheid af als gevolg van verzadiging van de scheidingswanden, waarbij kwantificering niet mogelijk is zodra 100% van de druppels positief is. Aan de lage kant kan theoretisch zo weinig als één positieve druppel worden gedetecteerd en gekwantificeerd, hoewel de nauwkeurigheid slechter is en de test onderhevig is aan valse positieven op laag niveau. Meestal moeten ten minste drie druppels positief zijn om een resultaat te berekenen met een betrouwbaarheid van 95%, wat de drempel is om een concentratie te berekenen die we hier hebben gebruikt.
Er werd een reeks van vijf verschillende QC-concentraties opgesteld, waarbij het beoogde kopieaantal/μL PCR-reactievolumes naar verwachting positieve tot totale druppelverhoudingen zouden opleveren die het kwantificeerbare bereik van ddPCR omvatten, zoals weergegeven in tabel 5. Deze werden gebruikt om de nauwkeurigheid en precisie van de test te evalueren. In de beoordeling hier werden de boven- en ondergrenzen van kwantificering niet naar het theoretisch mogelijke maximum in ddPCR geduwd. Nauwkeurige kwantificering kan mogelijk zijn op hogere en lagere niveaus dan hier wordt aangetoond. Het bereik moet worden ontwikkeld in overeenstemming met de downstream-toepassingen van deze methode.
In totaal werden drie onafhankelijk bereide verdunningsreeksen van deze QC's bereid in monsterverdunningsbuffer voor elke batch om de nauwkeurigheid en precisie binnen de test te evalueren. Dubbele putjes van elke QC-verdunning werden opgenomen. Om een echt validatieprotocol te simuleren, werden in totaal zes nauwkeurigheids- en precisiebatches uitgevoerd door meerdere analisten gedurende meerdere dagen. De resultaten van deze zes batches werden geanalyseerd om de intra-assay en inter-assay nauwkeurigheid en precisie van de methode te definiëren en om het dynamische bereik van de assay te definiëren.
De intra-assay prestaties werden beoordeeld voor elke batch op elk QC-niveau. We verwachtten dat alle QC- en NTC-putten minstens 10.000 druppels zouden hebben. Hieraan werd voldaan in 216 van de 216 geteste putten in alle zes batches, met een gemiddeld aantal druppels van 19.748 druppels / put (tabel 6). Vervolgens werd verwacht dat de inter-well %CV van elke set dubbele putten van elke QC ≤25,0% zou zijn, behalve voor de boven- en ondergrens QC, waar ≤30,0% werd verwacht. Hieraan werd voldaan in sets van 90 van de 90 geteste putten in alle zes batches voor de QC's, met een gemiddelde inter-well %CV van 3,9% over alle QC-niveaus (tabel 7). Alle QC's leverden gemiddelde positieve tot totale druppelverhoudingen op binnen de hierboven geschetste verwachte marges (tabel 6).
Binnen elke batch werden het intra-assaygemiddelde en de standaardafwijking berekend voor elk van de onafhankelijk bereide verdunningsreekspunten, en deze werden gebruikt om een intra-assaygemiddelde te berekenen voor elke concentratie in elke assay. Dit werd gebruikt om de nauwkeurigheid en precisie van de test te beoordelen (tabel 8). Precisie verwijst naar de variabiliteit in de gegevens van replicaties van hetzelfde homogene monster onder normale testomstandigheden en wordt geëvalueerd door het %CV van de meervoudig geïncludeerde aliquots te berekenen. We verwachtten dat de drie geteste aliquots binnen elke batch een intra-assay %CV ≤25,0% zouden opleveren, behalve voor de boven- en ondergrens QC waar ≤30,0% werd verwacht. Hieraan werd voldaan voor alle vijf QC-niveaus in elk van de 60 batches (30 van de 30 totale prestaties). Over het algemeen kan een grotere intra-assay precisie dan de doelcriteria worden bereikt, met een gemiddelde intra-assay %CV van 7,7% op alle QC-niveaus. Nauwkeurigheid verwijst naar de mate van overeenstemming tussen de experimenteel bepaalde waarde en de nominale waarde. Dit wordt geëvalueerd door de procentuele relatieve fout (%RE of %Bias) te berekenen tussen de berekende concentraties van elke QC en hun theoretisch verwachte nominale concentraties. Verwacht werd dat het intra-assaygemiddelde van de drie aliquoten ±25,0% RE van de nominale concentratie zou bedragen, met uitzondering van de boven- en ondergrens QC, waar ±30,0% werd verwacht. Hieraan werd voldaan voor alle vijf QC-niveaus in elk van de 60 batches (30 van de 30 totale prestaties). Over het algemeen kon een grotere intra-assay nauwkeurigheid dan ons doel worden bereikt, met een gemiddelde absolute intra-assay %RE van 4,2% over alle QC-niveaus. In alle uitvoeringen van de NTC (30 in totaal) waren geen positieve druppeltjes waarneembaar.
De nauwkeurigheid en precisie tussen de assays werden ook berekend met behulp van het intra-assay gemiddelde van elk QC-niveau binnen elke batch. De inter-assay precisie werd verwacht ≤25,0% CV, met uitzondering van de boven- en ondergrens QC waar ≤30,0% werd verwacht. Evenzo werd voor de nauwkeurigheid van de inter-assay ±25,0% RE verwacht, behalve voor de boven- en ondergrens QC waar ±30,0% werd verwacht. Een significant grotere inter-assay nauwkeurigheid en precisie dan deze doelen werden waargenomen (tabel 9), met een inter-assay precisie variërend van 4,0% tot 8,5% en een inter-assay absolute nauwkeurigheid variërend van 1,0% tot 3,2%. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat deze methode voldoende intra- en inter-assay nauwkeurigheid en precisie kan bereiken binnen de huidige industriedoelstellingen. Een dynamisch bereik van deze test van 2.500-2,5 kopieën per μL PCR-reactie kan worden gedefinieerd op basis van deze resultaten, met een totale testgevoeligheid van 2,5 kopieën per μL PCR-reactie. Zoals eerder vermeld, kan het mogelijk zijn om bredere dynamische bereiken te valideren.
Vervolgens was het noodzakelijk om de nauwkeurigheid en precisie van de assay binnen de doelmatrix te evalueren - in dit geval tranen. Doorgaans worden assays gevalideerd voorafgaand aan de start van klinische studies, wat betekent dat tranen verzameld van vectorbehandelde patiënten waarschijnlijk niet beschikbaar zijn voor validatiedoeleinden. Dit kan kunstmatig worden gecreëerd door de doel-AAV-vector in tranen te steken die zijn verzameld van vrijwillige donoren om matrix-spiked QC's te maken. Gepoolde menselijke tranen werden verzameld door een derde partij (BioIVT). Voor het bewijs van het principe werd een eGFP-uitdrukkende AAV2-vector gebruikt die was verkregen uit een commerciële bron. De concentratie van de AAV2-vectorvoorraad werd empirisch bepaald met behulp van ddPCR, zonder het gebruik van een DNA-isolatiestap, zoals beschreven in dit protocol. In elke run werd de AAV2 onafhankelijk in de drie tear aliquots geprikt op een hoog (verwacht 1,41 x 103 kopieën / μL PCR-reactie) en laag (28,2 kopieën / μL PCR-reactie) niveau. Niet-gespikede aliquots werden opgenomen als een controle om de specificiteit van de methode aan te tonen.
De intra-assay prestaties werden beoordeeld voor elke batch op elk spikeniveau. De verwachting was dat alle traanmonsters minstens 10.000 druppels zouden bevatten. Hieraan werd voldaan in 108 van de 108 geteste putten in alle zes batches, met een gemiddeld totaal druppelgetal van 20.208 druppels / put (tabel 10). Vervolgens werd verwacht dat de inter-well %CV van elke set dubbele putten van elke QC ≤25,0% zou zijn voor de hoge en lage piekniveaus. Hieraan werd voldaan in 36 van de 36 sets putten die in alle zes batches voor de QC's werden getest, met een gemiddelde inter-well %CV van 3,2% (tabel 11).
Binnen elke batch werden het intra-assaygemiddelde en de standaarddeviatie berekend voor elk van de onafhankelijk bereide traanpieken, en deze werden gebruikt om een intra-assaygemiddelde te berekenen voor elke concentratie in elke assay. Dit werd gebruikt om de nauwkeurigheid en precisie van de bepaling in matrix te beoordelen (tabel 12). We verwachtten dat de intra-assay %CV ≤25,0% zou zijn en hoge en lage piekniveaus. Hieraan werd voldaan in zes van de zes batches voor elk niveau. Over het algemeen kon een grotere intra-assay precisie in matrix dan het doel worden bereikt, met een gemiddelde intra-assay %CV van 3,7% op het hoge niveau en 12,2% op het lage niveau (totaal 8,0%). Er werd ook verwacht dat de intra-assay %RE ±25,0% zou zijn op beide piekniveaus. Hieraan werd voldaan in zes van de zes batches voor elk niveau. Evenzo werd over het algemeen vastgesteld dat een grotere intra-assay nauwkeurigheid in matrix dan het doel kon worden bereikt, met een gemiddelde intra-assay absolute %RE van 8,1% op het lage niveau en 11,3% op het hoge niveau (totaal 9,7%). Voor de niet-gespikede controle was in geen van de aliquots een eGFP-signaal detecteerbaar (tabel 12), wat de specificiteit van de methode in de menselijke traanmatrix aantoont.
Inter-assay nauwkeurigheid en precisie in scheurmatrix werden ook berekend met behulp van het intra-assay gemiddelde van elk spikeniveau binnen elke batch. Er werd verwacht dat de inter-assay precisie ≤25,0% CV zou zijn, en voor inter-assay nauwkeurigheid verwachtten we ±25,0% RE. Een significant grotere inter-assay nauwkeurigheid en precisie dan deze doelen werden waargenomen (tabel 13), met een inter-assay precisie van 5,5% op het hoge niveau en 7,1% op het lage niveau, en met een absolute inter-assay nauwkeurigheid van 11,3% op het hoge niveau en 8,1% op het lage niveau. Gezamenlijk tonen deze resultaten de nauwkeurigheid, precisie en specificiteit van de methode in traanmatrix.
Tabel 5: Kwaliteitscontroles die worden gebruikt om het dynamisch bereik van de test te definiëren. Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: Totale druppeltellingen en positieve tot totale druppelverhoudingen van synthetische dubbelstrengs DNA-kwaliteitscontrole en NTC. Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 7: QC inter-well statistieken (copy targets/μL PCR reaction). Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 8: Intra-assay nauwkeurigheid en precisie van QC's (copy targets/μL PCR reaction). Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 9: Inter-assay nauwkeurigheid en precisie van QC's (copy targets/μL PCR reaction). Afkortingen: ULQC = bovengrens kwaliteitscontrole; HQC = hoge kwaliteitscontrole; MQC = gemiddelde kwaliteitscontrole; LQC = lage kwaliteitscontrole; LLQC = ondergrens kwaliteitscontrole; NTC = geen sjabloonbesturingselement. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 10: Totaal aantal druppels van traanmonsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 11: Statistieken van traanmonsters (copy targets/μL PCR-reactie). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 12: Intra-assay nauwkeurigheid en precisie van traanmonsters (copy targets/μL PCR reactie). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 13: Inter-assay nauwkeurigheid en precisie van traanmonsters (copy targets/μL PCR reactie). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Sequenties van primer, sondes en synthetische dubbelstrengs DNA-kwaliteitscontrole die in deze studie worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Er zijn verschillende stappen van het ddPCR-protocol die van cruciaal belang zijn voor een goede uitvoering van de test. De eerste kritische stap is het ontwerp en de optimalisatie van de primers en sonde. Over het algemeen wordt het gebruik van hydrolyse-sonde-gebaseerde chemie boven op kleurstof gebaseerde chemie (bijv. SYBR Green) in een preklinische of klinische setting aanbevolen vanwege hun superieure specificiteit. Bovendien is de keuze van het versterkingsdoel van cruciaal belang. Meestal is het transgen van belang van de vector gericht. In eerdere preklinische stadia of in vectoren waar het mogelijk niet mogelijk is om vectortransgen versus genomisch DNA te onderscheiden, kan het echter passend zijn om gestandaardiseerde vectordoelen te gebruiken. Men kan zich bijvoorbeeld richten op het omgekeerde terminale herhalingsgebied, de promotor, de poly-A-staart of de intersegmentverbindingen tussen deze vectorcomponenten. De keuze van het doel zal variëren op basis van vectorontwerp. Traditionele qPCR primer en probe ontwerpstrategieën en software zijn meestal geschikt voor ddPCR. Ontwerpparameters die naar verwachting een consistente gloeitemperatuur opleveren (bijvoorbeeld 60 °C) moeten worden geselecteerd om de vereiste mate van optimalisatie te verminderen. Het is ook aanbevolen om ten minste drie verschillende sets voor elk doel te ontwerpen, te bestellen en te evalueren. Men moet dan de verzameling selecteren die de grootste specificiteit (geen amplificatie in de negatieve controleput of in een matrix van gerelateerd doel-DNA) en sensitiviteit (d.w.z. detectiegrens) vertoont20.
Als het voordelig is om de assay tussen qPCR en ddPCR te kunnen overzetten, wordt aanbevolen om eerst de testcondities te optimaliseren met qPCR en om voorwaarden voor de geselecteerde set te identificeren die resulteren in amplificatie-efficiënties van 90% -110% met een R2 ≥ 0,98. ddPCR als eindpuntmethode is echter doorgaans minder gevoelig dan qPCR vanwege variaties in versterkingsefficiëntie. Het wordt ten minste aanbevolen om een thermische temperatuurgradiënt uit te voeren in de gloei-/uitbreidingsstap om temperaturen boven en onder de verwachte gloeitemperaturen te dekken en om de regen- en fluorescerende amplitudescheiding tussen de negatieve en positieve druppelclusters te evalueren als functie van de temperatuur. Als de werkruimte dit toelaat, wordt aanbevolen om individuele speciale werkstations te hebben voor mastermixvoorbereiding, sjabloontoevoeging en versterking. Waar mogelijk moeten deze fysiek worden gescheiden door een unidirectionele workflow met ingebouwde technische controles, zoals gecontroleerde toegang en differentiële luchtdruk, om het risico op kruisbesmetting en valse positieven te verminderen. Als dit niet mogelijk is, moet uiterste voorzichtigheid worden betracht om kruisbesmetting te voorkomen.
Er zijn twee stappen in dit protocol die ongebruikelijk kunnen lijken voor degenen die meer gewend zijn aan de ontwikkeling van qPCR-tests. De eerste is de opname van een restrictie-enzym in de PCR-mastermix. Tijdens ddPCR-versterking wordt elke druppel gethermocycled naar het eindpunt. In een goed geoptimaliseerde test resulteert dit in twee populaties van druppels, één set met een consistent hoog niveau van fluorescerende signalen - de positieven - en een andere die consistent een laag niveau van fluorescerend signaal vertoont - de negatieven. Als PCR-interferentie optreedt, kan dit de initiatie van PCR-versterking desynchroniseren, waardoor de druppel geen versterkingsplateau bereikt en dus inconsistente fluorescerende eindpunten. In dit geval worden de druppels verdeeld tussen de negatieven en positieven, wat resulteert in een fenomeen dat ddPCR-regen wordt genoemd. Dit kan leiden tot een onnauwkeurige kwantificering van het doel en inconsistent en subjectief toegepaste drempels. Onze aanbeveling om de drempel iets boven het signaal van de NTC te plaatsen, wat de effecten van regen in de uiteindelijke kwantificering zou moeten minimaliseren, omdat alle druppels nog steeds als positief worden beschouwd, zelfs als ze niet volledig naar het eindpunt zijn gefietst. AAV's hebben een zeer complexe secundaire structuur die, afhankelijk van het versterkingsdoel, de toegankelijkheid tot de primers en sondes kan verminderen, wat resulteert in PCR-interferentie en dus regen. De opname van het restrictie-enzym in het hoofdmengsel splitst deze secundaire structuur om de toegang door de primers en sondes te vergroten, waardoor de regen wordt verminderd, wat daardoor de nauwkeurigheid van de test kan verbeteren. De effecten van de opname van een restrictie-enzym in de ddPCR-reactie zijn eerder beschreven25,32. Elk restrictie-enzym kan worden gebruikt, zolang wordt bevestigd dat het niet binnen het doelversterkingsgebied snijdt. Er zijn geen voorvergistingsstappen of alternatieve buffersamenstellingen nodig.
De tweede ongebruikelijke stap is de voorbereiding van het traanmonster dat AAV bevat. In dit protocol werd een verhouding van 1:10 (of meer) van tranen gebruikt en vervolgens werd het monster verwarmd. Typisch, wanneer tranen worden verzameld via een capillaire buis, wat een veel gebruikte verzamelmethode is, kan gemiddeld ongeveer 10,0 μL worden verzameld33. De verdunning helpt om het beperkte monstervolume aan te pakken en voldoende materiaal te leveren voor het testen van dubbele putten. Hoewel dit de theoretische detectiegrens vermindert, zou de robuuste gevoeligheid van ddPCR nog steeds moeten resulteren in de detectie van alle, behalve een extreem klein aantal vectordeeltjes. Deze aanpak creëert bovendien een "back-up" goed als er onverwacht een zou falen. In dit geval, of in gevallen van onvoldoende monstervolume om twee putten te laten draaien, kan de Poisson-fout worden gebruikt om de precisie te beoordelen. Bovendien, in gevallen waarin de concentratie onder de detectiegrens ligt, creëert het een mogelijkheid om putgegevens samen te voegen om een concentratie te bepalen. Het is noodzakelijk om de AAV-vectoren te bevrijden van de virale capsiden voor ddPCR-detectie. Sommige methoden voor de kwantificering van AAV omvatten een proteïnase K-verteringsstap om de virale capsid34,35,36 te verwijderen. Alle van nature voorkomende AAV-serotypen hebben smelttemperaturen van ongeveer 90 °C of lager, waarbij de meeste onder de 80 °C vallen; Dit lijkt dus een onnodige opname37. Verhitting alleen blijkt voldoende om vector-DNA vrij te maken.
Bovendien is ddPCR over het algemeen minder gevoelig voor PCR-remmers die in een monster aanwezig kunnen zijn en die een qPCR-test kunnen beïnvloeden. Als een specifieke DNA-isolatiestap is opgenomen, zou dit ook specifieke validatie vereisen, wat in dit protocol wordt vermeden. Monsters worden vóór verhitting verdund vanwege de kinetiek van diffusie van de vectorgenomen in een vloeistof. Tijdens het verhitting en daaropvolgende afkoelingsproces kunnen de positieve en negatieve zintuigstrengen van het enkelstrengs DNA-genoom samengloeien om een dubbelstrengs tussenproduct te produceren als de concentraties voldoende hoog zijn. Verdunning voorafgaand aan verhitting verlaagt de concentraties en maakt het wiskundig onwaarschijnlijk dat zich voldoende dubbelstrengs tussenproducten vormen om een nadelig effect te hebben op de nauwkeurigheid van de kwantificering. Opgemerkt moet worden dat de synthetische DNA-fragmenten of gelineariseerde plasmiden die als kwaliteitscontroles worden gebruikt, deze verwarmingsstap niet mogen ondergaan. Aangezien deze dubbelstrengs zijn, zou verwarming resulteren in conversie naar enkelstrengs tussenproducten. Na onafhankelijke verdeling van deze enkelstrengs QC's in druppels, zou dit naar verwachting resulteren in een tweevoudige toename van de QC-concentratie ten opzichte van de nominale concentratie. Als alternatief, als QC's moeten worden verwarmd om de methode te standaardiseren, moet hiermee rekening worden gehouden bij de reconstitutie en toewijzing van een nominale concentratie.
Ten slotte, met betrekking tot monstervoorbereiding, bevelen veel protocollen ook de opname aan van een DNase-behandelingsstap om niet-ingekapseld vector-DNA te verwijderen. Deze stap is van cruciaal belang in gevallen waarin het niet gewenst is om vrij DNA geassocieerd met het vectorpreparaat te kwantificeren (zoals tijdens kwantificering voor doseringsdoeleinden). In de context van biodistributie- en biosheddingstudies wil men echter meestal weten waar elk vector-DNA naartoe is gereisd, ongeacht of het is ingekapseld of niet. Daarom wordt voorgesteld om tijdens dergelijke onderzoeken meestal geen DNase-behandelingsstap uit te voeren. Als wordt vastgesteld dat het nodig is om een DNase-stap op te nemen, moet deze stap vóór verdunningen en verhitting plaatsvinden.
In dit artikel worden gegevens gepresenteerd die representatief zijn voor de benadering van de beoordeling van het dynamisch bereik, de gevoeligheid, de nauwkeurigheid en de precisie van de methode in de context van een geschikte, aan de goede laboratoriumpraktijk conforme validatie. Het huidige gebrek aan richtlijnen over dit onderwerp laat validerende laboratoria over om zelf doeltestcriteria te bepalen, in overeenstemming met het huidige denken van de industrie. Verschillende groepen hebben zowel hogere als lagere doelcriteria gesteld dan gebruikt in deze studie 19,20,21,22,23,24,25. De doelcriteria voor de bepaling moeten, totdat zij strikter zijn gedefinieerd, vóór de validering worden geselecteerd op basis van de beoogde klinische toepassingen van de methode. Afhankelijk van de downstream beslissingen die op basis van de gegevens moeten worden genomen, kan een hogere mate van nauwkeurigheid en precisie nodig zijn. Omgekeerd kan een eenvoudig positief versus negatief resultaat voldoende zijn.
De aanpak ging ook in op aanbevelingen voor de beoordeling van specificiteit en een matrixeffect. Een pool van tranen verzameld van onbehandelde personen leverde geen positief resultaat op in deze test, terwijl het doelwit kon worden gedetecteerd wanneer de vector in de tranen werd geprikt met een hoge en lage concentratie binnen de aanbevolen herstelpercentages. Idealiter zou matrix met endogene vector (bijvoorbeeld verzameld na behandeling met virale vector) ook in deze beoordelingen worden opgenomen. Het is echter onwaarschijnlijk dat dergelijke monsters beschikbaar zullen zijn voor gebruik in een validatie. Om de robuustheid van de validatie te vergroten, kunnen meerdere pools van tranen of tranen verzameld van verschillende individuen worden beoordeeld om te bepalen of een patiëntspecifiek matrixeffect optreedt. Ten slotte wordt aanbevolen om de stabiliteit te evalueren. In workflows waar DNA-extractie plaatsvindt uit de biologische matrix, kan het nodig zijn om de stabiliteit van zowel het monster als het geëxtraheerde DNA te evalueren. In deze workflow wordt het monster direct in de test getest zonder dat DNA-extractie nodig is. Daarom moet men, met het oog op de evaluatie van de stabiliteit voor deze methode, de stabiliteit van de traanmonsters evalueren. Meestal worden benchtop-, koelkast-, vries- / dooi- en langetermijnstabiliteitsbeoordelingen aanbevolen. Deze werden niet uitgevoerd als onderdeel van deze studie, maar de hier ontwikkelde methoden kunnen worden gebruikt in deze beoordeling, na manipulaties van de invoermonsters.
Over het algemeen is aangetoond dat deze methode een robuuste, herhaalbare en valideerbare test is om op AAV gebaseerde vectoren in traanmonsters te detecteren. Het kan dienen als een platform dat moet worden aangepast aan specifieke vectoren ter ondersteuning van klinische proeven en biedt een basis voor validatie van een test die in overeenstemming is met goede laboratoriumpraktijken.
Disclosures
Alle auteurs zijn medewerkers van KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, een contractonderzoeksorganisatie die uitgebreide Good Laboratory Practices / Good Clinical Practices-conforme ontwikkelingsservices biedt, van ondersteuning bij vroege ontdekking tot productregistratie, inclusief ondersteuning van AAV-gebaseerde assays, zoals beschreven in dit protocol. KCAS financierde dit project en de publicatie van dit protocol. Hoewel er momenteel geen FDA-richtlijnen zijn voor het ontwerp en de validatie van de experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, hebben de experts en opinieleiders die dergelijke studies bij KCAS ontwikkelen, deze aanpak als basisbenadering aangenomen. Aanvullende criteria en parameters worden per project besproken en kunnen worden opgenomen op basis van het beoogde gebruik.
Acknowledgments
We willen Nick Russell en Brandon McKethan van Bio-Rad bedanken voor hun nuttige discussies tijdens de ontwikkeling van deze methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T.
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022).
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022).
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K.
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020).
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020).
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020).
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016).
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023).
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020).
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015).
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018).
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018).
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023).
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
