药物干粉制剂的开发需要可靠的体内测试，通常采用小鼠模型。目前可用于向小鼠准确且可重复地递送干粉气溶胶的装置技术较为有限。本研究介绍了一次性给药器，可在与小鼠相关的剂量范围内实现肺部药物递送，有助于开展初步的概念验证研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
干粉吸入器在向肺部递送药物方面具有多种优势，包括药物固态配方稳定性高、装置便携、可实现单次计量与给药，以及无需推进剂的分散机制。为了开发药用干粉气溶胶产品，需要具备可靠的 体内 测试至关重要。通常，初步研究会先采用小鼠模型进行初步评估，然后再在较大的动物物种中开展正式研究。然而，这种方法的一个显著局限在于缺乏合适的装置技术，无法对小型动物准确且可重复地递送干粉，从而限制了这些模型的应用价值。为应对这些挑战，已开发出专用于小鼠肺部递送适当剂量干粉的一次性注射器式给药器。这些给药器可从具有均匀体密度的粉床中加载并递送预定量的粉末。通过将钝针插入粉床至固定深度（压紧），每次取出固定量的粉末，从而实现离散化控制。值得注意的是，这种给药模式已被证明对多种喷雾干燥粉末有效。在涉及四种不同模型喷雾干燥粉末的实验中，给药器能够实现30至1100 µg范围内的剂量递送。实际递送剂量受压紧次数、给药器针头尺寸以及具体处方等因素影响。这些给药器的一个关键优势在于其易于制造，使其在概念验证初期研究中向小鼠递送干粉时具有良好的可及性和成本效益。给药器的一次性特性便于在动物实验室内使用，避免了重复使用系统所需的清洗、重新填充及物料称量等不便操作。因此，一次性注射器式给药器的开发解决了小鼠干粉递送在概念验证研究中的重大障碍，使研究人员能够在小动物模型中开展更准确、可重复的肺部药物递送初步研究。
引言
在过去三十年中，由于全球逐步淘汰氯氟烃推进剂，干粉吸入器（DPIs）在肺部药物递送中的应用引起了广泛关注1,2。与其他肺部递送系统（如定量吸入器和雾化器）相比，DPIs具有多种优势，包括制剂稳定性好、便携、使用方便以及无需推进剂的分散机制2。然而，在将DPI产品推进至临床转化之前，必须开展多项临床前研究，其中许多研究最初需借助小鼠模型完成。尽管如此，目前可用于向小型动物准确且可重复地递送干粉的技術仍十分有限。
向小动物（如小鼠）递送干粉的常用方法包括被动吸入3,4,5,6,7和直接给药8,9,10,11,12,13。被动吸入通常需要使用定制的暴露室，通过大剂量喷雾干燥粉末来生成足够浓度的气溶胶云。由于小鼠为强制性鼻呼吸动物14，被动吸入给药时粉末需经鼻腔和咽喉到达肺部，因此必须维持具有足够颗粒空气动力学特性的气溶胶云7,8。尽管该方法因依赖正常呼吸实现吸入，生理相关性优于直接给药，是一种有用的技术14，但在粉末质量有限的初步研究中可能不适用。
此外，已有多种用于直接递送干粉的经气管给药装置被报道8,9,10,11,12,13。经气管装置可绕过鼻腔和咽喉，将粉末直接递送至肺部，从而实现对给药剂量的更精确控制14。此外，某些装置（尤其是采用冲压装填法制备的装置9）可使用较少量材料制备，这对于初步的概念验证研究而言是一个重要考虑因素。由于缺乏普遍可获得的经气管给药装置，其应用潜力受到限制，导致不同实验室之间可用性差异以及实验结果的不一致14。在本研究中，我们提出一种简单、低成本、一次性使用的经气管给药剂量器，可用于干粉气溶胶研发中的小鼠概念验证研究。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均依照《动物福利法》和《公共卫生服务关于实验动物人道照护与使用的政策》进行。研究方案已获得田纳西大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会的批准。选取健康雌性BALB/c小鼠，年龄约为6-8周，通过肺部气溶胶递送方式给予一个剂量器的干粉内容物，用于基于1599号光谱霉素酰胺干粉的药代动力学研究9。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 剂量器及填充组件的准备
- 使用精密切片锯（见材料表）或砂带机修剪2.54 cm（1英寸）钝头不锈钢针（21–25 G）的塑料鲁尔接头部分，直至仅保留2–3 mm的塑料鲁尔接头（图1A和图2A）。
注意：若使用砂带机，可能需要使用更细的针或金属丝清洁不锈钢针，以清除可能产生的堵塞物。 - 切下0.6 mL锥形离心管的管尖部分（1–1.5 cm），并将30–35 mg粉末填充至管尖中。
注意：有关本研究中所用示例粉末的详细信息，请参见代表性结果部分。在将粉末用于本应用之前，应依据美国药典通则<601>中所述的标准方法对其气溶胶性能进行评估（见材料表）。 - 若需储存和/或运输粉末，可使用已切下的管帽封闭小瓶。如需储存和/或运输，应用石蜡膜密封，以尽量减少粉末暴露于环境湿气中。
2. 加载和组装定量加样器
- 根据所需剂量，将修剪好的不锈钢针头多次插入0.6 mL锥形离心管尖端的粉末床中（图2B）。使用低尘擦拭纸轻轻擦拭不锈钢针头的侧面，以去除多余的粉末（图3）。
- 将载有粉末的不锈钢针头轻轻插入一段3.81 cm（1.5英寸）聚丙烯或5.08 cm（2英寸）聚四氟乙烯（PTFE）针管（16–20 G）中，避免粉末脱落（参见材料表）（图1B、C 和 图2C）。
3. 驱动计量装置
- 将一次性注射器抽吸至所需体积，具体体积可根据应用而有所不同。
注意：对于小鼠的肺内给药，通常适宜的体积为 0.15–0.6 mL8,9。 - 将注射器连接至聚丙烯或聚四氟乙烯（PTFE）针头上的鲁尔锁接头（图 2D）。
- 将给药装置的针头端插入目标部位。为分析粉末含量和重现性，可将针头穿过带穿孔的橡胶隔垫或石蜡膜，插入含有少量水和/或有机溶剂（例如乙醇，体积约为 1–5 mL）的样品瓶中，溶剂种类和体积应根据活性药物成分（API）的物理特性和定量方法确定。
- 对小鼠给药时，应按照既定方案9,15，将针头插入麻醉小鼠气管的第一级支气管分叉处。
- 用力推动注射器，将粉末从装置中排出至收集瓶内（图 2E）。
注意：向小鼠肺部递送粉末时，必须采用相同的技术操作。 - 为分析收集瓶中的药物含量和重现性，应针对特定的活性药物成分（API）采用适当的分析方法，例如紫外-可见光谱法（UV-Vis）或高效液相色谱法（HPLC）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本研究在使用前已确定了各种喷雾干燥粉末的气溶胶性能。空气动力学粒径分布（APSD）以质量中值空气动力学直径（MMAD）描述，该直径表示将分布按质量分为两等份的粒径，即50%的颗粒质量小于该尺寸，50%大于该尺寸。细颗粒分数（FPF）定义为小于5 μm的颗粒质量占总药物质量的百分比，用于评估肺部沉积潜力。采用下一代撞击器（NGI）在设定流速为60 L/min的条件下测定上述参数，以模拟实际吸入过程中的空气动力学行为。th 百分位数（d50）以及反映分布宽度的几何标准差（GSD）。GSD 定义为 80 % 处空气动力学直径的比值的平方根th 百分位数除以第16百分位数th 百分位数（d84/d16)1/2，百分位数表示粒子质量相对于粒径呈对数正态分布时，均值两侧各一个标准差的范围。
本文所述的给药装置考虑了四种具有代表性的喷雾干燥粉末用于递送。这些喷雾干燥（SD）粉末包括含有辅料的替加环素（SD-1）
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于小鼠是强制性鼻呼吸动物，给药 通过 被动吸入法用于初步概念验证研究时，由于粉末需以依赖颗粒特性和粉末分散效率的方式通过鼻腔和咽喉，导致效率和剂量估算具有挑战性7,8,14使用本文开发的给药器可绕过鼻腔和咽喉，将给药器插入至第一级支气管分叉处9，并将完整剂量直接递送至小鼠肺部，从而在初步研究中实现更精确的剂量控制。这些给药装置代表了一种可重复且可定制的小鼠气管内给药递送方法 体外 粉末性能评估
使用21 G不锈钢内针和16 G聚丙烯外针的给药器，根据制剂类型和冲压次数的不同，可装载并递送200–1100 µg的剂量，通常适用于小鼠。对于某些制剂（如SD-1和SD-2），冲压次数超过4次仍可保持粉末分散性，最多可达至少5次冲压；但对于SD-3和SD-4等制剂，超过4次冲压则难以实现。若进一步冲压导致粉末在内针中过度...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者希望感谢美国国立卫生研究院（R01AI155922）提供的资金支持。显微成像实验在教堂山分析与纳米加工实验室（CHANL）完成，该实验室是北卡罗来纳研究三角区纳米技术网络（RTNN）的成员，RTNN 受美国国家科学基金会资助（项目编号 ECCS-1542015），属于国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的一部分。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.6 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | AR1140 | 任何具有足够量程的分析天平均可使用 |
| 钝头不锈钢针，1 英寸，21 G | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| 钝头不锈钢针，1 英寸，22 G | McMaster-Carr | 75165A683 | |
| 钝头不锈钢针，1 英寸，25 G | McMaster-Carr | 75165A687 | |
| 带鲁尔锁的一次性注射器（1 mL） | Fisher Scientific | 14-823-30 | 也可使用 3 mL 注射器 |
| 雌性 BALB/c 小鼠 | Charles River, Wilmington, MA, USA | ||
| 高性能级联撞击器 | Next Generation Impactor | Apparatus 5 | |
| 实验室薄膜（例如 Parafilm） | Fisher Scientific | S37440 | |
| 低尘擦拭纸（例如 Kimwipes） | Kimberly-Clark Professional | 34133 | |
| 低阻力干粉吸入器 | RS01 mod 7 | ||
| 聚丙烯针，1.5 英寸，16 G | McMaster-Carr | 6934A111 | |
| 聚丙烯针，1.5 英寸，18 G | McMaster-Carr | 6934A53 | |
| 聚丙烯针，1.5 英寸，20 G | McMaster-Carr | 6934A55 | |
| 精密切片锯 | TedPella | 812-300 | 可使用带式砂光机作为替代 |
| PTFE 针，2 英寸，20 G | McMaster-Carr | 75175A694 | |
| USP 通则 <601> | http://www.uspbpep.com/usp31/v31261/usp31nf26s1_c601.asp |
参考文献
- Wu, X., Li, X., Mansour, H. M. Surface analytical techniques in solid-state particle characterization for predicting performance in dry powder inhalers. KONA Powder and Particle Journal. 28, 3-18 (2010).
- Maloney, S. E., Mecham, J. B., Hickey, A. J. Performance testing for dry powder inhaler products: towards clinical relevance. KONA Powder and Particle Journal. 40, 172-185 (2023).
- Maloney, S. E., et al. Spray dried tigecycline dry powder aerosols for the treatment of nontuberculous mycobacterial pulmonary infections. Tuberculosis. 139, 102306(2023).
- Kaur, J., et al. A hand-held apparatus for "nose-only" exposure of mice to inhalable microparticles as a dry powder inhalation targeting lung and airway macrophages. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 34 (1), 56-65 (2008).
- Yi, J., et al. Whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposures. Journal of Visualized Experiments. (75), e50263(2013).
- Chung, Y. H., Han, J. H., Lee, Y. -H. A study on subchronic inhalation toxicology of 1-chloropropane. Toxicological Research. 31 (4), 393-402 (2015).
- Kuehl, P. J., et al. Regional particle size dependent deposition of inhaled aerosols in rats and mice. Inhalation Toxicology. 24 (1), 27-35 (2012).
- Manser, M., et al. Design considerations for intratracheal delivery devices to achieve proof-of-concept dry powder biopharmaceutical delivery in mice. Pharmaceutical Research. 40, 1165-1176 (2023).
- Stewart, I. E., et al. Development and characterization of a dry powder formulation for anti-tuberculosis drug spectinamide 1599. Pharmaceutical Research. 36 (9), 136(2019).
- Durham, P. G., et al. Disposable dosators for pulmonary insufflation of therapeutic agents to small animals. Journal of Visualized Experiments. (121), e55356(2017).
- Miwata, K., et al. Intratracheal administration of siRNA dry powder targeting vascular endothelial growth factor inhibits lung tumor growth in mice. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 12, 698-706 (2018).
- Duret, C., et al. Pharmacokinetic evaulation in mice of amorphous itraconazole-based dry powder formulations for inhalation with high bioavailability and extended lung retention. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 46-54 (2014).
- Maloney, S. E., et al. Preparation strategies of the anti-mycobacterial drug bedaquiline for intrapulmonary routes of administration. Pharmaceuticals. 16 (5), 729(2023).
- Price, D. N., Kunda, N. K., Muttil, P. Challenges associated with the pulmonary delivery of therapeutic dry powders for preclinical testing. KONA Powder and Particle Journal. 36, 129-144 (2019).
- Qiu, Y., Liao, Q., Chow, M. Y. T., Lam, J. K. W. Intratracheal administration of dry powder formulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61469(2020).
- Fiegel, J., et al. Preparation and in vivo evaluation of a dry powder for inhalation of capreomycin. Pharmaceutical Research. 25 (4), 805-811 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
