我们描述了一种详细的方案,用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞,并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。
方法文章
* These authors contributed equally
我们描述了一种详细的方案,用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞,并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。
利用人多能干细胞再生光感受器细胞,是治疗遗传性和衰老性晚期视网膜疾病的一种有前景的疗法。我们已证明,人源重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞(hESCs)向光感受器前体细胞的分化。此外,将这些细胞进行视网膜下注射后,在rd10小鼠和兔的动物模型中均观察到部分功能恢复。视网膜下注射是一种成熟的技术,因其接近靶区域,已被广泛用于将药物化合物递送至光感受器细胞及视网膜色素上皮(RPE)层。该方法也已被用于将腺相关病毒载体递送至视网膜下腔,以治疗视网膜疾病。在小鼠模型中,由于眼球尺寸较小,视网膜下给药在操作上具有挑战性。本方案详细描述了用于注射的人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备流程,以及在遗传性视网膜色素变性突变小鼠(rd10小鼠)中进行视网膜下细胞递送的技术。该方法可将细胞治疗精准递送至靶区域,特别是光感受器变性类疾病发生的主要部位——视网膜外核层。
遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性可导致感光细胞丧失,最终引发失明。视网膜感光细胞位于视网膜的外层,由专门负责光转导(即将光信号转化为神经信号)的特化细胞组成。视杆细胞和视锥细胞紧邻视网膜色素上皮层(RPE)1。为弥补细胞丢失,感光细胞替代疗法已成为一种新兴且不断发展的治疗策略。目前已使用胚胎干细胞(ESCs)2,3,4、诱导性多能干细胞(iPSCs)来源的RPE细胞以及视网膜前体细胞(RPCs)4,5,6,7,8来修复受损的感光细胞。视网膜下腔是位于视网膜与RPE之间的一个受限空间,因其位置邻近,成为移植这些细胞以替代受损的感光细胞、RPE细胞及穆勒细胞的理想部位9,10,11。
在临床前研究中,基因和细胞疗法已利用视网膜下腔作为多种视网膜疾病的再生医学治疗途径。这包括以反义寡核苷酸疗法12,13或基于腺相关病毒(AAV)策略的CRISPR/Cas9或碱基编辑技术14,15,16形式递送功能性的基因拷贝或基因编辑工具,以及植入材料(例如RPE细胞片、视网膜假体17,18,19)和由干细胞分化而来的视网膜类器官20,21,22,用于治疗视网膜及RPE相关疾病。已有临床试验证明,在视网膜下腔使用hESC-RPE31治疗RPE65相关的莱伯先天性黑蒙(LCA)23,24、CNGA3相关的全色盲25、MERTK相关的视网膜色素变性26以及脉络膜缺失症27,28,29,30是一种有效的治疗方法。将细胞直接注射至损伤区域附近,可显著提高细胞在目标区域的定植、突触整合以及最终视觉功能改善的可能性。
尽管在人类和大眼模型(如猪)中进行视网膜下注射32,33,34,35,兔36,37,38,39,40和非人灵长类动物41,42,43)已被 已建立的方法中,由于小鼠眼球尺寸受限且晶状体巨大,占据了眼球的大部分空间,因此在小鼠模型中进行此类注射仍具有挑战性44,45,46然而,基因修饰模型仅在小型动物中易于获得,而在大型动物(如兔和非人灵长类)中则不易获得,因此小鼠的视网膜下注射成为研究视网膜遗传性疾病新型治疗方法的重要手段。目前有三种主要方法用于将细胞或腺相关病毒(AAV)递送至视网膜下腔,即经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径(参见 图2经角膜和经巩膜途径与白内障形成、虹膜粘连、脉络膜出血及注射部位反流相关11,44,45,47,48,49我们采用经平坦部入路,可在显微镜下实时直视观察注射过程,并精确定位注射部位。
我们最近描述了一种可在无异源成分、化学成分明确的条件下,利用重组人视网膜特异性层粘连蛋白亚型LN523将人胚胎干细胞(hESCs)分化为光感受器前体细胞的方法。由于发现LN523存在于视网膜中,我们推测人视网膜的细胞外基质微环境可以被模拟重现 体外 从而支持视网膜光感受器细胞由人胚胎干细胞(hESCs)分化而来36单细胞转录组分析显示,在第32天时生成了共表达视锥-视杆同源框基因和视网膜捕获蛋白的光感受器前体细胞。视网膜变性10(rd10) 采用模拟常染色体遗传性人类视网膜色素变性的突变小鼠模型,评估了第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的治疗效果 体内将人胚胎干细胞分化的光感受器前体细胞注射至视网膜下腔 rd10 P20小鼠,此时光感受器功能障碍和变性正在进行中36. 本文详细描述了一种制备冻存后的人胚胎干细胞来源的视光感受器前体细胞并将其递送至视网膜下腔的实验方案 rd10 小鼠。该方法也可用于向小鼠的视网膜下腔注射腺相关病毒(AAVs)、细胞悬液、多肽或化学物质。
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该 体内 实验均依照新加坡保健集团机构动物护理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth, IACUC)批准的指南和方案,以及视力与眼科学研究协会(Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO)关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明进行。幼鼠自出生后第17天(移植前)至第30天(移植后)通过饮用含有环孢素(260 g/L)的水进行免疫抑制。
1. 冻存后第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备
2. 视网膜下注射hESCs rd10 小鼠
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根据制造商的说明组装了10 µL玻璃注射器(图1),用于输送细胞悬液/培养基的钝针如图1B所示。不同类型的视网膜下注射方法在图2中进行了图示。本方案中描述的是经平坦部途径(图2C)。将安装在玻璃注射器上的钝针通过巩膜切口进入,并穿过眼球到达视网膜下腔。如图3A所示,在显微镜下可直接观察注射过程中针头的行进轨迹、穿透视网膜以及细胞输送的情况。通过观察注射部位是否形成隆起(bleb)来确认细胞/培养基是否成功输送(图3B)。成功的隆起表现为浅白色、类似水球样的外观。若注射失败,则表现为细胞/培养基泄漏至玻璃体腔内,且未能形成隆起。对注射区域进行了OCT扫描,结果显示,在接受细胞治疗的眼中,视网膜下腔内可见悬浮的单个hESCs(图4A
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视网膜下注射已用于细胞悬液移植,以治疗视网膜色素上皮(RPE)和视网膜疾病23,25,26,27,28,31,40。该方法在啮齿类动物研究中极为重要,不仅适用于细胞移植和基因治疗,还可用于评估视网膜疾病的新治疗化合物。目前,将细胞或腺相关病毒(AAVs)递送至视网膜下腔主要有三种途径:经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径。
在经角膜途径中,注射针穿过角膜、瞳孔,最后到达视网膜,将细胞递送至视网膜下腔并成功形成隆起泡(bleb)。经角膜途径的优点是能够在受体动物中实现完全的视网膜脱离4...
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Hwee Goon Tay 是 Alder Therapeutics AB 的联合创始人。其他作者声明无竞争利益。
我们感谢谭伟成、江雪燕、李欣怡和钟 Yingying 在冻存后第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞制备过程中提供的技术协助。本研究部分得到了新加坡国家医学研究理事会青年研究者研究基金奖(NMRC/OFYIRG/0042/2017)和新加坡国家研究基金会24的资助。th 竞争性研究计划资助(CRP24-2020-0083)授予 H.G.T.
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.3% 妥布霉素 | 诺华 | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松 | 诺华 | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% 盐酸丙帕他卡因 | 爱尔康 | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL 结核菌素注射器 | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% 托吡卡胺 | 爱尔康 | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% 盐酸去氧肾上腺素 | 爱尔康 | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24 孔组织培养板 | Costar | 3526 | |
| 30 G 一次性针头 | 贝克顿·迪金森 (BD) | 305128 | |
| 33 G,20 mm 长钝针 | Hamilton | 7803-05 | |
| 自动细胞计数仪 | NanoEnTek | 型号:Eve | |
| 不含维生素 A 的 B27 | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| 丁丙诺啡 | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| 环孢素 | 诺华 | 260 g/L 饮用水 | |
| 第 32 天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞 | 杜克-国大医学院 | 人胚胎干细胞分化 32 天。参见参考文献 36 中的方案。 | |
| 纱布 | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| 格拉斯哥最低必需培养基 | Gibco | 11710–035 | |
| 人胚胎干细胞系 H1 | WiCell 研究所 | WA01 | |
| 人脑源性神经营养因子 (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| 人睫状神经营养因子 (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| 盐酸氯胺酮 (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| 微量玻璃注射器 (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯 (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 补充剂 | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF 培养基 | Satorius | 05-100-1A | |
| 手术显微镜 | 蔡司 | OPMI LUMERA 700 | 带内置 iOCT 功能 |
| PRDM(光感受器分化培养基,50 mL) | 杜克-国大医学院 | 参见培养基成分36。基础培养基:10 µM DAPT、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL CNTF、0.5 µM 视黄酸、2% B27 和 1% N2。基础培养基组成:1x GMEM、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM β-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸 (NEAA)。 | |
| 丙酮酸 | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 小鼠 | 杰克逊实验室 | B6.CXB1-Pde6brd10/J 小鼠 | 性别:雄性/雌性,年龄:P20(注射时),体重:3–6 g |
| 视黄酸 | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| 圆形盖玻片 (12 mm) | 赛默飞世尔科技 | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic 凝胶 (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| 盐酸赛拉嗪 (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-巯基乙醇 | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
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