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我们描述了用于制备冷冻保存后 hESC 衍生的光感受器祖细胞以及这些细胞在 rd10 小鼠中的视网膜下递送的详细方案。
使用人类多能干细胞再生感光细胞是一种很有前途的疗法，可用于治疗晚期遗传性和衰老性视网膜疾病。我们已经证明，人类重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞（hESC）分化为光感受器祖细胞。此外，这些细胞的视网膜下注射在 rd10 啮齿动物和兔子模型中也显示出部分恢复。众所周知，视网膜下注射是一种既定的方法，由于它靠近目标空间，已被用于将药物化合物输送到眼睛的感光细胞和视网膜色素上皮 （RPE） 层。它还被用于将腺相关病毒载体输送到视网膜下空间以治疗视网膜疾病。由于小鼠眼球大小的限制，小鼠模型中药物化合物和细胞的视网膜下递送具有挑战性。该方案描述了用于注射的hESC衍生的光感受器祖细胞的详细程序以及这些细胞在遗传性视网膜色素变性突变 体rd10 小鼠中的视网膜下递送技术。这种方法允许对目标区域进行细胞治疗，特别是视网膜的外核层，在那里发生导致感光细胞变性的疾病。
遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性会导致感光细胞丢失并最终失明。视网膜感光器是视网膜的外段层，由负责光转导（即将光转换为神经元信号）的特殊细胞组成。视杆细胞和视锥细胞感光细胞与视网膜色素沉着层 （RPE） 相邻1。补偿细胞损失的感光细胞替代疗法一直是一种新兴和发展中的治疗方法。胚胎干细胞 （ESC）2、3、4、诱导多能干细胞 （iPSCs） 衍生的 RPE 细胞和视网膜祖细胞 （RPC）4、5、6、7、8 用于恢复受损的感光细胞。视网膜下间隙是视网膜和 RPE 之间的密闭空间，是沉积这些细胞以替换受损的感光细胞、RPE 和 Mueller 细胞的有吸引力的位置，因为它位于附近 9,10,11。
在临床前研究中，基因和细胞疗法一直在利用视网膜下空间进行再生医学治疗各种视网膜疾病。这包括以反义寡核苷酸疗法12,13或CRISPR/Cas9的形式递送基因或基因编辑工具的功能拷贝，或通过基于腺相关病毒（AAV）的策略进行碱基编辑14,15,16，植入材料（例如，RPE片，视网膜假体17,18,19）和分化干细胞衍生的视网膜类器官20，21,22 用于治疗视网膜和 RPE 相关疾病。在视网膜下空间使用 hESC-RPE31 治疗 RPE65 相关 Leber 先天性黑朦 （LCA）23,24、CNGA3 连锁色盲25、MERTK 相关视网膜色素变性26、脉络膜血症27、28、29、30已被证明是一种有效的方法。将细胞直接注射到受损区域附近可大大提高细胞在适当区域沉降、突触整合和最终视力改善的机会。
尽管在人类和大眼睛模型（即猪32、33、34、35、兔36、37、38、39、40 和非人灵长类动物41、42、43）中已经建立了视网膜下注射，但由于眼球大小的限制和巨大的占据鼠标眼睛的晶状体44,45,46。然而，转基因模型仅在小动物中容易获得，而在大型动物（即兔子和非人类灵长类动物）中不容易获得，因此小鼠视网膜下注射引起了人们关注视网膜遗传疾病的新治疗方法。目前有三种主要方法将细胞或AAV输送到视网膜下空间，即经角膜途径、经巩膜途径和平坦途径（见图2）。经角膜和经巩膜途径与白内障形成、粘连、脉络膜出血和注射部位反流有关 11、44、45、47、48、49。我们采用pars plana方法作为注射过程的直接可视化，可以在显微镜下实时获得注射部位。
我们最近描述了一种方法，该方法可以使用重组人视网膜特异性层粘连蛋白亚型 LN523，在无异种、化学定义的条件下将人胚胎干细胞 （hESC） 分化为光感受器祖细胞。由于发现 LN523 存在于视网膜中，我们假设人类视网膜的细胞外基质生态位可以在 体外 重现，从而支持与 hESC 的光感受器分化 36。单细胞转录组学分析显示，32 d后生成共表达锥杆同源盒和recoverin的感光祖细胞。使用模拟常染色体人视网膜色素变性的视网膜变性 10 （rd10） 突变小鼠模型来评估第 32 天 hESC 衍生的光感受祖细胞 在体内的疗效。将 hESC 衍生的感光祖细胞注射到 P20 处 rd10 小鼠的视网膜下空间，其中光感受器功能障碍和变性正在进行36。在这里，我们描述了用于制备冷冻保存后 hESC 衍生的光感受器祖细胞并递送至 rd10 小鼠视网膜下空间的详细方案。该方法还可用于将 AAV、细胞悬液、肽或化学物质施用到小鼠的视网膜下空间中。
体内实验是根据新加坡保健集团（SingHealth）机构动物护理和使用委员会（IACUC）和视觉和眼科研究协会（ARVO）批准的关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行的。幼崽通过喂食含有环孢菌素（260 g/L）的饮用水，对幼崽进行从P17（移植前）到P30（移植后）的免疫抑制。
1. 冷冻保存后第 32 天 hESC 衍生的光感受器祖细胞的制备
2. rd10 小鼠hESCs的视网膜下递送
根据制造商的说明组装 10 μL 玻璃注射器（图 1），用于递送细胞悬液/培养基的钝针如 图 1B 所示。视网膜下注射的不同方法如 图 2 所示。我们描述了该协议中的pars plana方法（图2C）。安装在玻璃注射器上的钝针通过硬化切开术伤口插入，并进入全球的视网膜下空间。如 图3A所示，在进行注射时，直接在显微镜下监测针头的轨迹，穿过视网膜的穿透和细胞的输送。通过观察注射部位的气泡来确认细胞/培养基的成功递送（图3B）。成功的水泡可以被识别为类似于水气球的浅白色。通过细胞/培养基泄漏到注射部位的玻璃体空间并且未能形成气泡来观察输送失败。在注射区域进行OCT扫描，扫描显示细胞处理的眼睛中漂浮的个体化hESC（图4A），而中等处理的眼睛显示视网膜下空间中没有细胞的透明液体（图4B）。个体化的hESC被确定为分布在视网膜下空间中的高反射材料（图4A）。通过记录成功形成气泡的眼睛数量来计算注射的成功率。我们纳入了实验室中采用这种方法的应用和注射成功率（表1）。
图 1:注射过程中使用的器械。 （A） 10 μL 玻璃注射器安装有 33G 钝针。（B） 33G钝针的放大图片。（C） 供动物头部休息的枕头。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2:视网膜下注射的不同途径。 （A）经角膜途径:注射针穿过角膜和瞳孔进入视网膜下空间。（B）经巩膜途径:视网膜下间隙通过巩膜直接进入。（C） Pars plana 途径:注射针通过角膜缘的切口插入玻璃体腔。针头通过穿透视网膜到达视网膜下空间。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:视网膜下注射期间眼睛的眼底图像。 （A）在进行视网膜下注射之前，可以看到针尖在接触视网膜的玻璃体空间中，避开了主要的视网膜血管。（B）视网膜下注射后，在注射部位形成可见的水泡（黄色虚线）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:注射眼的术中 OCT 扫描。 扫描在注射后立即进行。（A）hESCs治疗的眼睛:顶部面板显示OCT扫描在眼睛上的位置（青色和粉红色横截面线）;在治疗的眼睛视网膜下空间（黄色虚线，中间和底部面板）中观察到 hESC。（B） 中等处理的眼睛:顶部面板显示了眼睛上 OCT 扫描的位置（青色和粉红色横截面线）;在媒体注射的眼睛的视网膜下空间中观察到无细胞的透明液体（黄色虚线，中间和底部面板）。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 应用 | 受体菌株 | 成功率 |
| AAV型 | RPE65RD12/J | 80% |
| AAV型 | C57BL/6型 | 95% |
| hESC衍生的祖细胞 | RD10-/- | 95% |
表1:视网膜下注射在不同应用中的成功率。
Hwee Goon Tay 是 Alder Therapeutics AB 的联合创始人。其他作者声明没有竞争利益。
我们描述了用于制备冷冻保存后 hESC 衍生的光感受器祖细胞以及这些细胞在 rd10 小鼠中的视网膜下递送的详细方案。
我们感谢 Wei Sheng Tan、Luanne Chiang Xue Yen、Xinyi Lee 和 Yingying Chung 为冷冻保存后第 32 天 hESC 衍生的光感受器祖细胞的制备提供技术援助。这项工作得到了美国国家医学研究委员会青年研究员研究资助奖（NMRC / OFYIRG / 0042 / 2017）和国家研究基金会第24届 竞争性研究计划资助（CRP24-2020-0083）对HGT的部分支持。
| 0.3% 妥布霉素 | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex （3.5 g） |
| 0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松 | 诺华 | NDC 0078-0876-01 | Tobradex （3.5 g） |
| 0.5% 盐酸丙帕卡因 | Alcon NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine （15 mL） | |
| 1 mL 结核菌素注射器 | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% 托吡卡胺 | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl （15 mL） |
| 2.5% 盐酸去氧肾上腺素 | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin （5 mL） |
| 24 孔组织培养板 | Costar | 3526 | |
| 30 G 一次性针 | 头Becton Dickinson （BD） | 305128 | |
| 33 G，20 mm 长度钝针 | Hamilton | 7803-05 | |
| 自动细胞计数仪 | NanoEnTek | 型号：Eve | |
| 不含维生素 A 的 B27 | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| >丁丙诺啡 | Ceva | 兽医 （0.3 mg/mL） | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| 孢菌素 | 诺华 | 260 g/L 在饮用水中 | |
| 第 32 天 hESC 衍生的光感受器祖细胞 | DUKE-NUS 医学院 | 人胚胎干细胞分化 32 天。参见参考文献 36 中的协议。 | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. （纱布赢者实业有限公司） | 1SNW475-4 | |
| Glasgow 最低必需培养基 | Gibco | 11710–035 | |
| hESC 细胞系 H1 | WiCell 研究所 | WA01 | |
| 人脑源性神经营养因子 （BDNF） | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| >人纤毛神经营养因子 （CNTF） | Prospec-Tany 技术基因 | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| 盐酸氯胺酮 （100 mg/mL） | Ceva Santé动物 | KETALAB03 | |
| LN-521 | 生物层 | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| 微升玻璃注射器 （10 mL） | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-（3,5-二氟苯乙基-L-丙氨酰）]-S-苯甘氨酸叔丁酯 （DAPT） | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 补充剂 | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| 非必需氨基酸 （NEAA） | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| >NutriStem XF 培养基 | Satorius | 05-100-1A | |
| 手术显微镜 | 蔡司 | OPMI LUMERA 700 | 内置 iOCT 功能 |
| PRDM（感光细胞分化培养基，50ml） | 杜克-新加坡国立大学医学院 | 见媒体组成36。基础培养基，10 &微量;M DAPT，10 ng/mL BDNF，10 ng/mL CNTF，0.5 &微量;M 视黄酸、2% B27 和 1% N2。基础培养基：1x GMEM、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM B-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸 （NEAA）。 | |
| 丙酮酸 | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 小鼠 | Jackson Laboratory | B6。CXB1-Pde6brd10/J 小鼠 | 性别： 雄/雌， 年龄： P20 （注射）， 体重： 3-6 g |
| 视黄酸 | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| 圆形盖玻片 （12 mm） | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel （10 g） | Dr. Gerhard Mann | ||
| 盐酸甲苯噻嗪 （20 mg/mL） | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-巯基乙醇 | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 毫米36s |
