视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

摘要

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。

摘要

利用人多能干细胞再生光感受器细胞，是治疗遗传性和衰老性晚期视网膜疾病的一种有前景的疗法。我们已证明，人源重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞（hESCs）向光感受器前体细胞的分化。此外，将这些细胞进行视网膜下注射后，在rd10小鼠和兔的动物模型中均观察到部分功能恢复。视网膜下注射是一种成熟的技术，因其接近靶区域，已被广泛用于将药物化合物递送至光感受器细胞及视网膜色素上皮（RPE）层。该方法也已被用于将腺相关病毒载体递送至视网膜下腔，以治疗视网膜疾病。在小鼠模型中，由于眼球尺寸较小，视网膜下给药在操作上具有挑战性。本方案详细描述了用于注射的人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备流程，以及在遗传性视网膜色素变性突变小鼠（rd10小鼠）中进行视网膜下细胞递送的技术。该方法可将细胞治疗精准递送至靶区域，特别是光感受器变性类疾病发生的主要部位——视网膜外核层。

引言

遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性可导致感光细胞丧失，最终引发失明。视网膜感光细胞位于视网膜的外层，由专门负责光转导（即将光信号转化为神经信号）的特化细胞组成。视杆细胞和视锥细胞紧邻视网膜色素上皮层（RPE）¹。为弥补细胞丢失，感光细胞替代疗法已成为一种新兴且不断发展的治疗策略。目前已使用胚胎干细胞（ESCs）^2,3,4、诱导性多能干细胞（iPSCs）来源的RPE细胞以及视网膜前体细胞（RPCs）^4,5,6,7,8来修复受损的感光细胞。视网膜下腔是位于视网膜与RPE之间的一个受限空间，因其位置邻近，成为移植这些细胞以替代受损的感光细胞、RPE细胞及穆勒细胞的理想部位^9,10,11。

在临床前研究中，基因和细胞疗法已利用视网膜下腔作为多种视网膜疾病的再生医学治疗途径。这包括以反义寡核苷酸疗法^12,13或基于腺相关病毒（AAV）策略的CRISPR/Cas9或碱基编辑技术^14,15,16形式递送功能性的基因拷贝或基因编辑工具，以及植入材料（例如RPE细胞片、视网膜假体^17,18,19）和由干细胞分化而来的视网膜类器官^20,21,22，用于治疗视网膜及RPE相关疾病。已有临床试验证明，在视网膜下腔使用hESC-RPE³¹治疗RPE65相关的莱伯先天性黑蒙（LCA）^23,24、CNGA3相关的全色盲²⁵、MERTK相关的视网膜色素变性²⁶以及脉络膜缺失症^27,28,29,30是一种有效的治疗方法。将细胞直接注射至损伤区域附近，可显著提高细胞在目标区域的定植、突触整合以及最终视觉功能改善的可能性。

尽管在人类和大眼模型（如猪）中进行视网膜下注射^32,33,34,35，兔^{36,37,38,39,40}和非人灵长类动物^41,42,43）已被 已建立的方法中，由于小鼠眼球尺寸受限且晶状体巨大，占据了眼球的大部分空间，因此在小鼠模型中进行此类注射仍具有挑战性^44,45,46然而，基因修饰模型仅在小型动物中易于获得，而在大型动物（如兔和非人灵长类）中则不易获得，因此小鼠的视网膜下注射成为研究视网膜遗传性疾病新型治疗方法的重要手段。目前有三种主要方法用于将细胞或腺相关病毒（AAV）递送至视网膜下腔，即经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径（参见 图2经角膜和经巩膜途径与白内障形成、虹膜粘连、脉络膜出血及注射部位反流相关^{11,44,45,47,48,49}我们采用经平坦部入路，可在显微镜下实时直视观察注射过程，并精确定位注射部位。

我们最近描述了一种可在无异源成分、化学成分明确的条件下，利用重组人视网膜特异性层粘连蛋白亚型LN523将人胚胎干细胞（hESCs）分化为光感受器前体细胞的方法。由于发现LN523存在于视网膜中，我们推测人视网膜的细胞外基质微环境可以被模拟重现 体外 从而支持视网膜光感受器细胞由人胚胎干细胞（hESCs）分化而来³⁶单细胞转录组分析显示，在第32天时生成了共表达视锥-视杆同源框基因和视网膜捕获蛋白的光感受器前体细胞。视网膜变性10（rd10) 采用模拟常染色体遗传性人类视网膜色素变性的突变小鼠模型，评估了第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的治疗效果 体内将人胚胎干细胞分化的光感受器前体细胞注射至视网膜下腔 rd10 P20小鼠，此时光感受器功能障碍和变性正在进行中³⁶. 本文详细描述了一种制备冻存后的人胚胎干细胞来源的视光感受器前体细胞并将其递送至视网膜下腔的实验方案 rd10 小鼠。该方法也可用于向小鼠的视网膜下腔注射腺相关病毒（AAVs）、细胞悬液、多肽或化学物质。

方案

该 体内 实验均依照新加坡保健集团机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth, IACUC）批准的指南和方案，以及视力与眼科学研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明进行。幼鼠自出生后第17天（移植前）至第30天（移植后）通过饮用含有环孢素（260 g/L）的水进行免疫抑制。

1. 冻存后第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备

1. 将光感受器分化培养基（PRDM）置于37 °C水浴中预热。
2. 从液氮中取出一支含有第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的冻存管，保持在干冰上。
3. 在37 °C水浴中解冻冻存管，持续3-5分钟。将第32天的细胞重悬于1 mL PRDM中，并在130 × g条件下离心4分钟。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PRDM中。
5. 取10 µL混合液用于细胞计数。按照制造商说明书，使用0.2%台盼蓝染色细胞，混匀后将细胞混合液加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和活率。
6. 当细胞活率高于70%时，进行下一步操作。将剩余的细胞悬液在130 × g条件下离心4分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于PRDM中，调整浓度至3 × 10⁵ 个细胞/µL，用于移植。
7. 观察是否存在可见的细胞团块。在微量离心管中使用10 µL移液枪头反复吹打重悬细胞团块，直至无可见团块为止。将细胞悬液吸入33G注射器，观察细胞溶液是否能顺利通过针头挤出。

2. 视网膜下注射hESCs rd10 小鼠

1. 动物准备
   1. 使用氯胺酮（20 mg/kg 体重）和赛拉嗪（2 mg/kg 体重）混合物，通过连接27G针头的1 mL结核菌素注射器经腹腔注射，对小鼠（P20，雄性/雌性，3–6 g）进行麻醉。作为预先镇痛措施，向小鼠皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。
   2. 给予麻醉后，滴加1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素各一滴，以实现瞳孔扩张。在角膜上涂抹眼用凝胶，防止眼睛干燥及麻醉相关性白内障的发生。
   3. 将小鼠置于空笼中，直至完全麻醉。通过轻捏足垫评估麻醉深度，确认动物对强烈夹捏无反应。
   4. 当小鼠完全麻醉后，将其放置在设定为38 °C的加热垫上。
2. 细胞的视网膜下腔递送
   1. 采用本实验所用的经玻璃体单通道平坦部睫状体途径，在无菌环境下进行视网膜下注射。使用直立式手术显微镜并沿直接光路完成注射操作。
   2. 准备10 µL玻璃注射器，先取下针头卡座。将33G钝头针头安装到玻璃注射器上，使用金属卡座盖小心固定针头。
   3. 用蒸馏水冲洗，检查针头是否存在泄漏或阻塞情况。排空注射器后，小心放置于一旁备用。
   4. 将麻醉后的小鼠置于软枕上，使待处理眼正对显微镜物镜向上。滴加0.5%盐酸丙帕他卡因，等待30秒。在眼球表面涂抹150 µL眼用凝胶，并覆盖圆形盖玻片。
   5. 通过观察角膜、虹膜、瞳孔、晶状体和结膜，对眼球进行初步检查。调节焦平面，经瞳孔观察小鼠眼底。调整头部位置，使视盘位于瞳孔中央，并通过适当固定头部减少移动。
   6. 多次轻弹装有hESCs的试管底部，使细胞充分混匀形成均匀悬液。使用带有33G钝头针头的10 µL玻璃微量注射器吸取2 µL细胞/培养基。为避免细胞在注射器内沉降或聚集，应在注射前立即吸取细胞悬液。
   7. 使用30G一次性针头，在角膜缘后方2 mm处制作巩膜切口。保持针头角度约为45°，以避免接触晶状体。当针尖进入眼内可视后，缓慢撤出针头。使用后将针头丢弃至锐器盒中，防止针刺伤。
   8. 取玻璃注射器，将钝头针插入巩膜切口。在不接触晶状体的前提下，推进钝头针直至到达切口对侧的视网膜。确保注射区域避开主要视网膜血管，以防出血。
   9. 轻柔穿透视网膜，直至在巩膜处观察到压力隆起。保持针头钝端与巩膜平行，以防止细胞泄漏至玻璃体腔。
   10. 在持续轻压注射器的同时，缓慢将2 µL细胞悬液或PRDM培养基（对照）注入视网膜下腔。成功注射后，注射部位应形成可见的隆起（即含有细胞悬液/培养基的视网膜隆起）。
       注意：注射过程中仅可施加轻微压力，以避免视网膜撕裂及细胞在针尖处堵塞。
   11. 确认形成隆起后，等待10秒使细胞沉降，然后缓慢将针头从眼球中撤出。
3. 术中光学相干断层扫描（OCT）对隆起区域的扫描（可选）
   1. 缓慢移动小鼠头部，使显微镜下可清晰观察到隆起区域。通过轻扶头部固定位置。无需额外扩大瞳孔。不要移除眼球上的盖玻片和凝胶，它们可提供清晰的光学介质以便观察隆起。
   2. 使用手术显微镜内置的iOCT功能进行术中OCT扫描。
   3. 在OCT屏幕上点击Cube 选项，通过点击Arrow 按钮将扫描区域定位至隆起部位。滑动Centering and Focus调节OCT图像至最佳质量。点击Capture/Scan获取隆起区域的OCT扫描图像。检查图像以评估扫描质量。
4. 术后恢复
   1. 移除盖玻片，并用纱布清洁眼球表面的凝胶。注射后一次性涂抹抗生素软膏，以预防感染。
   2. 将动物置于温暖光源下恢复麻醉，直至其恢复足够意识以维持胸卧位，并可返回饲养笼。注射后至少监测动物3天，观察是否存在炎症、感染或痛苦迹象。
      注意：150 W暖灯应距离动物笼至少30 cm，注意避免造成灼伤。
   3. 术后第一天每8小时皮下注射一次布托啡诺（0.05 mg/kg），或根据兽医建议执行。若观察到眼部出现炎症或感染，应咨询兽医专业人员进行适当治疗。
5. 器械的清洁与灭菌
   1. 用100%乙醇冲洗10 µL玻璃微量注射器及33G钝头针头10次。随后用蒸馏水冲洗注射器，去除残留乙醇。
   2. 拆卸玻璃注射器和针头。干燥注射器后储存备用。

结果

根据制造商的说明组装了10 µL玻璃注射器（图1），用于输送细胞悬液/培养基的钝针如图1B所示。不同类型的视网膜下注射方法在图2中进行了图示。本方案中描述的是经平坦部途径（图2C）。将安装在玻璃注射器上的钝针通过巩膜切口进入，并穿过眼球到达视网膜下腔。如图3A所示，在显微镜下可直接观察注射过程中针头的行进轨迹、穿透视网膜以及细胞输送的情况。通过观察注射部位是否形成隆起（bleb）来确认细胞/培养基是否成功输送（图3B）。成功的隆起表现为浅白色、类似水球样的外观。若注射失败，则表现为细胞/培养基泄漏至玻璃体腔内，且未能形成隆起。对注射区域进行了OCT扫描，结果显示，在接受细胞治疗的眼中，视网膜下腔内可见悬浮的单个hESCs（图4A

讨论

视网膜下注射已用于细胞悬液移植，以治疗视网膜色素上皮（RPE）和视网膜疾病^{23,25,26,27,28,31,40}。该方法在啮齿类动物研究中极为重要，不仅适用于细胞移植和基因治疗，还可用于评估视网膜疾病的新治疗化合物。目前，将细胞或腺相关病毒（AAVs）递送至视网膜下腔主要有三种途径：经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径。

在经角膜途径中，注射针穿过角膜、瞳孔，最后到达视网膜，将细胞递送至视网膜下腔并成功形成隆起泡（bleb）。经角膜途径的优点是能够在受体动物中实现完全的视网膜脱离^4...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3% 妥布霉素	诺华	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松	诺华	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% 盐酸丙帕他卡因	爱尔康	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL 结核菌素注射器	Turemo	SS01T2713
1% 托吡卡胺	爱尔康	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% 盐酸去氧肾上腺素	爱尔康	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24 孔组织培养板	Costar	3526
30 G 一次性针头	贝克顿·迪金森 (BD)	305128
33 G，20 mm 长钝针	Hamilton	7803-05
自动细胞计数仪	NanoEnTek	型号：Eve
不含维生素 A 的 B27	Life Technologies	12587001	2%36
丁丙诺啡	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
环孢素	诺华		260 g/L 饮用水
第 32 天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞	杜克-国大医学院		人胚胎干细胞分化 32 天。参见参考文献 36 中的方案。
纱布	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
格拉斯哥最低必需培养基	Gibco	11710–035
人胚胎干细胞系 H1	WiCell 研究所	WA01
人脑源性神经营养因子 (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
人睫状神经营养因子 (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
盐酸氯胺酮 (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
微量玻璃注射器 (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯 (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 补充剂	Life Technologies	A13707-01	1%36
非必需氨基酸 (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF 培养基	Satorius	05-100-1A
手术显微镜	蔡司	OPMI LUMERA 700	带内置 iOCT 功能
PRDM（光感受器分化培养基，50 mL）	杜克-国大医学院		参见培养基成分36。基础培养基：10 µM DAPT、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL CNTF、0.5 µM 视黄酸、2% B27 和 1% N2。基础培养基组成：1x GMEM、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM β-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸 (NEAA)。
丙酮酸	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 小鼠	杰克逊实验室	B6.CXB1-Pde6brd10/J 小鼠	性别：雄性/雌性，年龄：P20（注射时），体重：3–6 g
视黄酸	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
圆形盖玻片 (12 mm)	赛默飞世尔科技	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic 凝胶 (10 g)	Dr. Gerhard Mann
盐酸赛拉嗪 (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-巯基乙醇	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36