视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

摘要

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。

摘要

利用人多能干细胞再生光感受器细胞，是治疗遗传性和衰老性晚期视网膜疾病的一种有前景的疗法。我们已证明，人源重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞（hESCs）向光感受器前体细胞的分化。此外，将这些细胞进行视网膜下注射后，在rd10小鼠和兔的动物模型中均观察到部分功能恢复。视网膜下注射是一种成熟的技术，因其接近靶区域，已被广泛用于将药物化合物递送至光感受器细胞及视网膜色素上皮（RPE）层。该方法也已被用于将腺相关病毒载体递送至视网膜下腔，以治疗视网膜疾病。在小鼠模型中，由于眼球尺寸较小，视网膜下给药在操作上具有挑战性。本方案详细描述了用于注射的人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备流程，以及在遗传性视网膜色素变性突变小鼠（rd10小鼠）中进行视网膜下细胞递送的技术。该方法可将细胞治疗精准递送至靶区域，特别是光感受器变性类疾病发生的主要部位——视网膜外核层。

引言

遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性可导致感光细胞丧失，最终引发失明。视网膜感光细胞位于视网膜的外层，由专门负责光转导（即将光信号转化为神经信号）的特化细胞组成。视杆细胞和视锥细胞紧邻视网膜色素上皮层（RPE）¹。为弥补细胞丢失，感光细胞替代疗法已成为一种新兴且不断发展的治疗策略。目前已使用胚胎干细胞（ESCs）^2,3,4、诱导性多能干细胞（iPSCs）来源的RPE细胞以及视网膜前体细胞（RPCs）^4,5,6,7,8来修复受损的感光细胞。视网膜下腔是位于视网膜与RPE之间的一个受限空间，因其位置邻近，成为移植这些细胞以替代受损的感光细胞、RPE细胞及穆勒细胞的理想部位^9,10,11。

....

方案

该 体内 实验均依照新加坡保健集团机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth, IACUC）批准的指南和方案，以及视力与眼科学研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明进行。幼鼠自出生后第17天（移植前）至第30天（移植后）通过饮用含有环孢素（260 g/L）的水进行免疫抑制。

1. 冻存后第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备

1. 将光感受器分化培养基（PRDM）置于37 °C水浴中预热。
2. 从液氮中取出一支含有第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的冻存管，保持在干冰上。
3. 在37 °C水浴中解冻冻存管，持续3-5分钟。将第32天的细胞重悬于1 mL PRDM中，并在130 × g条件下离心4分钟。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PRDM中。
5. 取10 µL混合液用于细胞计数。按照制造商说明书，使用0.2%台盼蓝染色细胞，混匀后将细胞混合液加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和活率。
6. 当细胞活率高于70%时，进行下一步操作。将剩余的细胞悬液在130....

结果

根据制造商的说明组装了10 µL玻璃注射器（图1），用于输送细胞悬液/培养基的钝针如图1B所示。不同类型的视网膜下注射方法在图2中进行了图示。本方案中描述的是经平坦部途径（图2C）。将安装在玻璃注射器上的钝针通过巩膜切口进入，并穿过眼球到达视网膜下腔。如图3A所示，在显微镜下可直接观察注射过程中针头的行进轨迹、穿透视网膜以及细胞输送的情况。通过观察注射部位是否形成隆起（bleb）来确认细胞/培养基是否成功输送（图3B）。成功的隆起表现为浅白色、类似水球样的外观。若注射失败，则表现为细胞/培养基泄漏至玻璃体腔内，且未能形成隆起。对注射区域进行了OCT扫描，结果显示，在接受细胞治疗的眼中，视网膜下腔内可见悬浮的单个hESCs（图4A

讨论

视网膜下注射已用于细胞悬液移植，以治疗视网膜色素上皮（RPE）和视网膜疾病^{23,25,26,27,28,31,40}。该方法在啮齿类动物研究中极为重要，不仅适用于细胞移植和基因治疗，还可用于评估视网膜疾病的新治疗化合物。目前，将细胞或腺相关病毒（AAVs）递送至视网膜下腔主要有三种途径：经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径。

在经角膜途径中，注射针穿过角膜、瞳孔，最后到达视网膜，将细胞递送至视网膜下腔并成功形成隆起泡（bleb）。经角膜途径的优点是能够在受体动物中实现完全的视网膜脱离^4.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3% 妥布霉素	诺华	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松	诺华	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% 盐酸丙帕他卡因	爱尔康	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL 结核菌素注射器	Turemo	SS01T2713
1% 托吡卡胺	爱尔康	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% 盐酸去氧肾上腺素	爱尔康	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24 孔组织培养板	Costar	3526
30 G 一次性针头	贝克顿·迪金森 (BD)	305128
33 G，20 mm 长钝针	Hamilton	7803-05
自动细胞计数仪	NanoEnTek	型号：Eve
不含维生素 A 的 B27	Life Technologies	12587001	2%36
丁丙诺啡	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
环孢素	诺华		260 g/L 饮用水
第 32 天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞	杜克-国大医学院		人胚胎干细胞分化 32 天。参见参考文献 36 中的方案。
纱布	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
格拉斯哥最低必需培养基	Gibco	11710–035
人胚胎干细胞系 H1	WiCell 研究所	WA01
人脑源性神经营养因子 (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
人睫状神经营养因子 (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
盐酸氯胺酮 (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
微量玻璃注射器 (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯 (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 补充剂	Life Technologies	A13707-01	1%36
非必需氨基酸 (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF 培养基	Satorius	05-100-1A
手术显微镜	蔡司	OPMI LUMERA 700	带内置 iOCT 功能
PRDM（光感受器分化培养基，50 mL）	杜克-国大医学院		参见培养基成分36。基础培养基：10 µM DAPT、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL CNTF、0.5 µM 视黄酸、2% B27 和 1% N2。基础培养基组成：1x GMEM、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM β-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸 (NEAA)。
丙酮酸	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 小鼠	杰克逊实验室	B6.CXB1-Pde6brd10/J 小鼠	性别：雄性/雌性，年龄：P20（注射时），体重：3–6 g
视黄酸	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
圆形盖玻片 (12 mm)	赛默飞世尔科技	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic 凝胶 (10 g)	Dr. Gerhard Mann
盐酸赛拉嗪 (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-巯基乙醇	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36