Summary
我们描述了用于制备冷冻保存后 hESC 衍生的光感受器祖细胞以及这些细胞在 rd10 小鼠中的视网膜下递送的详细方案。
Abstract
使用人类多能干细胞再生感光细胞是一种很有前途的疗法，可用于治疗晚期遗传性和衰老性视网膜疾病。我们已经证明，人类重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞（hESC）分化为光感受器祖细胞。此外，这些细胞的视网膜下注射在 rd10 啮齿动物和兔子模型中也显示出部分恢复。众所周知，视网膜下注射是一种既定的方法，由于它靠近目标空间，已被用于将药物化合物输送到眼睛的感光细胞和视网膜色素上皮 （RPE） 层。它还被用于将腺相关病毒载体输送到视网膜下空间以治疗视网膜疾病。由于小鼠眼球大小的限制，小鼠模型中药物化合物和细胞的视网膜下递送具有挑战性。该方案描述了用于注射的hESC衍生的光感受器祖细胞的详细程序以及这些细胞在遗传性视网膜色素变性突变 体rd10 小鼠中的视网膜下递送技术。这种方法允许对目标区域进行细胞治疗，特别是视网膜的外核层，在那里发生导致感光细胞变性的疾病。
Introduction
遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性会导致感光细胞丢失并最终失明。视网膜感光器是视网膜的外段层，由负责光转导（即将光转换为神经元信号）的特殊细胞组成。视杆细胞和视锥细胞感光细胞与视网膜色素沉着层 （RPE） 相邻1。补偿细胞损失的感光细胞替代疗法一直是一种新兴和发展中的治疗方法。胚胎干细胞 （ESC）2、3、4、诱导多能干细胞 （iPSCs） 衍生的 RPE 细胞和视网膜祖细胞 （RPC）4、5、6、7、8 用于恢复受损的感光细胞。视网膜下间隙是视网膜和 RPE 之间的密闭空间，是沉积这些细胞以替换受损的感光细胞、RPE 和 Mueller 细胞的有吸引力的位置，因为它位于附近 9,10,11。
在临床前研究中，基因和细胞疗法一直在利用视网膜下空间进行再生医学治疗各种视网膜疾病。这包括以反义寡核苷酸疗法12,13或CRISPR/Cas9的形式递送基因或基因编辑工具的功能拷贝，或通过基于腺相关病毒（AAV）的策略进行碱基编辑14,15,16，植入材料（例如，RPE片，视网膜假体17,18,19）和分化干细胞衍生的视网膜类器官20，21,22 用于治疗视网膜和 RPE 相关疾病。在视网膜下空间使用 hESC-RPE31 治疗 RPE65 相关 Leber 先天性黑朦 （LCA）23,24、CNGA3 连锁色盲25、MERTK 相关视网膜色素变性26、脉络膜血症27、28、29、30已被证明是一种有效的方法。将细胞直接注射到受损区域附近可大大提高细胞在适当区域沉降、突触整合和最终视力改善的机会。
尽管在人类和大眼睛模型（即猪32、33、34、35、兔36、37、38、39、40 和非人灵长类动物41、42、43）中已经建立了视网膜下注射，但由于眼球大小的限制和巨大的占据鼠标眼睛的晶状体44,45,46。然而，转基因模型仅在小动物中容易获得，而在大型动物（即兔子和非人类灵长类动物）中不容易获得，因此小鼠视网膜下注射引起了人们关注视网膜遗传疾病的新治疗方法。目前有三种主要方法将细胞或AAV输送到视网膜下空间，即经角膜途径、经巩膜途径和平坦途径（见图2）。经角膜和经巩膜途径与白内障形成、粘连、脉络膜出血和注射部位反流有关 11、44、45、47、48、49。我们采用pars plana方法作为注射过程的直接可视化，可以在显微镜下实时获得注射部位。
我们最近描述了一种方法，该方法可以使用重组人视网膜特异性层粘连蛋白亚型 LN523，在无异种、化学定义的条件下将人胚胎干细胞 （hESC） 分化为光感受器祖细胞。由于发现 LN523 存在于视网膜中，我们假设人类视网膜的细胞外基质生态位可以在 体外 重现，从而支持与 hESC 的光感受器分化 36。单细胞转录组学分析显示，32 d后生成共表达锥杆同源盒和recoverin的感光祖细胞。使用模拟常染色体人视网膜色素变性的视网膜变性 10 （rd10） 突变小鼠模型来评估第 32 天 hESC 衍生的光感受祖细胞 在体内的疗效。将 hESC 衍生的感光祖细胞注射到 P20 处 rd10 小鼠的视网膜下空间，其中光感受器功能障碍和变性正在进行36。在这里，我们描述了用于制备冷冻保存后 hESC 衍生的光感受器祖细胞并递送至 rd10 小鼠视网膜下空间的详细方案。该方法还可用于将 AAV、细胞悬液、肽或化学物质施用到小鼠的视网膜下空间中。
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Protocol
体内实验是根据新加坡保健集团（SingHealth）机构动物护理和使用委员会（IACUC）和视觉和眼科研究协会（ARVO）批准的关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行的。幼崽通过喂食含有环孢菌素（260 g/L）的饮用水，对幼崽进行从P17（移植前）到P30（移植后）的免疫抑制。
1. 冷冻保存后第 32 天 hESC 衍生的光感受器祖细胞的制备
- 在37°C水浴中预热的光感受器分化培养基（PRDM）。
- 从液氮中取出含有第 32 天 hESC 衍生的感光祖细胞的冷冻管。保持干冰。
- 在37°C下在水浴中解冻冷冻管3-5分钟。将第 32 天细胞重悬于 1 mL PRDM 中，并以 130 x g 离心 4 分钟。
- 除去上清液并将细胞重悬于 1 mL PRDM 中。
- 取出 10 μL 混合物进行细胞计数。根据制造商的说明，使用 0.2% 台盼蓝混合细胞。将细胞混合物移液到细胞计数室载玻片中。通过自动细胞计数器确定细胞数量和活力。
- 当细胞活力高于 70% 时继续下一步。将剩余的细胞悬液以130× g 离心4分钟。除去上清液，将细胞沉淀重悬于浓度为3×105 个细胞/μL的PRDM中用于移植。
- 观察可见的细胞团块。使用微量离心管中的 10 μL 移液器吸头反复重悬细胞团块，直到未观察到可见的细胞团块。加载到33G注射器中，观察细胞溶液是否通过针头挤出。
2. rd10 小鼠hESCs的视网膜下递送
- 动物的准备
- 使用氯胺酮（20mg / kg体重）和甲苯噻嗪（2mg / kg体重）的组合麻醉小鼠（P20，雄性/雌性，3-6g）在1mL结核菌素注射器中连接到27G针头上通过腹膜内方法。向小鼠皮下注射丁丙诺啡（0.05mg / kg）作为先发制人的镇痛药。
- 麻醉后，滴入 1% 托吡卡胺和 2.5% 去氧肾上腺素各一滴用于散瞳。在角膜上涂抹眼胶，以防止眼睛干燥和麻醉相关的白内障。
- 将小鼠放在空笼子中，直至完全麻醉。通过捏爪垫来评估适当的麻醉水平，并确认动物是否对用力捏没有反应。
- 当小鼠完全麻醉时，将动物放在设定为38°C的温暖垫上。
- 细胞的视网膜下递送
- 要使用 1 端口反式玻璃体平视方法，如此处所述，请在无菌环境中进行视网膜下注射。使用具有直射光路的正置操作显微镜进行进样。
- 通过取下针头轮毂制备 10 μL 玻璃注射器。将 33G 钝针安装到玻璃注射器上。拿起金属轮毂盖，小心地将针头固定在注射器上。
- 用蒸馏水冲洗，检查针头是否有任何泄漏和通畅的迹象。清空注射器并小心地放在一边。
- 将麻醉的小鼠放在枕头上，治疗眼直视显微镜的物镜。应用0.5%盐酸丙对哌卡因并等待30秒。在眼睛上涂抹 150 μL 眼用凝胶，并在其上放置圆形盖玻片。
- 通过观察角膜、虹膜、瞳孔、晶状体和结膜对眼睛进行粗略检查。通过瞳孔，通过调整焦平面来可视化鼠标眼底。调整头部，直到视头位于瞳孔的中心，并通过正确定位在枕头上来尽量减少头部的运动。
- 用hESC轻轻敲击试管的底部多次，以获得均匀的细胞悬浮液。通过使用 10 μL 玻璃微升注射器和 33G 钝针，取出 2 μL 细胞/培养基。在注射前取出细胞，以避免细胞在注射器中沉降/结块。
- 使用 30G 一次性针头，在角膜缘后 2 毫米处制作阴囊切除术伤口。将针的角度保持在~45°，以避免接触镜头。一旦针尖在眼睛中可见，轻轻拔出针头。使用后将针头丢弃到锋利的垃圾箱中，以免针头刺伤。
- 拿起玻璃注射器，将钝针插入巩膜切除术伤口。在不接触晶状体的情况下，将钝针推进，直到它到达入口伤口的对面视网膜。确保注射区域没有主要视网膜血管，以免出血。
- 轻轻穿透视网膜，直到看到巩膜上的压力分支。保持针头的钝端与巩膜平行，以避免细胞泄漏到玻璃体空间。
- 缓慢地将 2 μL 细胞悬液或 PRDM 培养基（对照）注入视网膜下空间，同时在注射器上保持温和的压力。成功注射后，应在注射部位形成可见的水泡（即带有细胞悬浮液/培养基的凸起视网膜）。
注意： 注射过程中只能使用温和的压力，以避免视网膜撕裂和针尖处细胞阻塞。 - 确认气泡后，等待 10 秒让细胞沉淀下来。轻轻地将针头从眼睛上缩回。
- 术中光学相干断层扫描 （OCT） 扫描水泡（可选）
- 通过缓慢移动头部，定位鼠标眼睛以在显微镜下观察水泡。轻轻握住头部固定位置。无需额外散瞳。不要取下眼罩和凝胶。它提供了一个清晰的光学介质来可视化气泡。
- 使用手术显微镜的内置iOCT功能进行术中OCT。
- 按 OCT 屏幕上的 Cube 选项，然后按 箭头 按钮将扫描区域定位在气泡上。通过滑动 “居中”和“对焦 ”来调整 OCT，以获得最佳 OCT 质量。按 捕获/扫描 获取气泡区域的 OCT 扫描。查看图像以检查扫描质量。
- 恢复
- 取下盖玻片，用纱布清洁眼睛上的凝胶。注射后涂抹抗生素软膏一次，以防止感染。
- 让动物在温暖的光线下从麻醉中恢复过来，直到它们恢复足够的意识以保持胸骨卧位并返回家庭笼子。注射后至少 3 天监测动物是否有炎症、感染和痛苦的迹象。
注意： 150 W 暖光应与动物笼子保持至少 30 厘米的距离，应小心避免烧伤。 - 皮下注射丁丙诺啡 （0.05 mg/kg），每小时 8 次，持续 1 天或根据兽医的建议。如果观察到眼睛发炎或感染，请咨询兽医专业人员进行适当的治疗。
- 器械的清洁和灭菌
- 用 10% 乙醇冲洗 10 μL 玻璃微升注射器和 33G 钝针 10x。用蒸馏水闪过注射器，洗去乙醇。
- 拆卸玻璃注射器和针头。擦干注射器进行储存。
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Representative Results
根据制造商的说明组装 10 μL 玻璃注射器（图 1），用于递送细胞悬液/培养基的钝针如 图 1B 所示。视网膜下注射的不同方法如 图 2 所示。我们描述了该协议中的pars plana方法（图2C）。安装在玻璃注射器上的钝针通过硬化切开术伤口插入，并进入全球的视网膜下空间。如 图3A所示，在进行注射时，直接在显微镜下监测针头的轨迹，穿过视网膜的穿透和细胞的输送。通过观察注射部位的气泡来确认细胞/培养基的成功递送（图3B）。成功的水泡可以被识别为类似于水气球的浅白色。通过细胞/培养基泄漏到注射部位的玻璃体空间并且未能形成气泡来观察输送失败。在注射区域进行OCT扫描，扫描显示细胞处理的眼睛中漂浮的个体化hESC（图4A），而中等处理的眼睛显示视网膜下空间中没有细胞的透明液体（图4B）。个体化的hESC被确定为分布在视网膜下空间中的高反射材料（图4A）。通过记录成功形成气泡的眼睛数量来计算注射的成功率。我们纳入了实验室中采用这种方法的应用和注射成功率（表1）。
图 1：注射过程中使用的器械。 （A） 10 μL 玻璃注射器安装有 33G 钝针。（B） 33G钝针的放大图片。（C） 供动物头部休息的枕头。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：视网膜下注射的不同途径。 （A）经角膜途径：注射针穿过角膜和瞳孔进入视网膜下空间。（B）经巩膜途径：视网膜下间隙通过巩膜直接进入。（C） Pars plana 途径：注射针通过角膜缘的切口插入玻璃体腔。针头通过穿透视网膜到达视网膜下空间。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：视网膜下注射期间眼睛的眼底图像。 （A）在进行视网膜下注射之前，可以看到针尖在接触视网膜的玻璃体空间中，避开了主要的视网膜血管。（B）视网膜下注射后，在注射部位形成可见的水泡（黄色虚线）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：注射眼的术中 OCT 扫描。 扫描在注射后立即进行。（A）hESCs治疗的眼睛：顶部面板显示OCT扫描在眼睛上的位置（青色和粉红色横截面线）;在治疗的眼睛视网膜下空间（黄色虚线，中间和底部面板）中观察到 hESC。（B） 中等处理的眼睛：顶部面板显示了眼睛上 OCT 扫描的位置（青色和粉红色横截面线）;在媒体注射的眼睛的视网膜下空间中观察到无细胞的透明液体（黄色虚线，中间和底部面板）。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 应用 | 受体菌株 | 成功率 |
| AAV型 | RPE65RD12/J | 80% |
| AAV型 | C57BL/6型 | 95% |
| hESC衍生的祖细胞 | RD10-/- | 95% |
表1：视网膜下注射在不同应用中的成功率。
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Discussion
视网膜下注射已用于细胞悬浮移植，以治疗RPE和视网膜疾病23,25,26,27,28,31,40。这种方法在啮齿动物研究中非常重要，不仅对于细胞移植和基因治疗方法，而且对于评估视网膜疾病的新型治疗化合物也是如此。目前，有三种主要途径用于将细胞或 AAV 输送到视网膜下空间，即经角膜途径、经巩膜途径和扁平部分途径。
在经角膜入路中，注射针穿过角膜、瞳孔，最后穿过视网膜，将细胞输送到视网膜下空间并成功形成水泡。经角膜入路的优点是能够在受体47中产生完整的视网膜脱离。它可以输送更多的细胞;然而，在这种方法中，研究结构构象和细胞整合的纵向观察具有挑战性。此外，并发症包括白内障形成、粘连和角膜混浊，使纵向观察具有挑战性 11,45,47,48。或者，经巩膜入路也用于将 AAV 输送到视网膜下空间44,49。这种方法对新生小鼠很有用，并且被认为更安全，因为针头不需要穿过眼部介质。然而，脉络膜出血、注射部位溶液反流、视网膜穿孔和渗漏到玻璃体腔不应被忽视。
我们采用 pars plana 方法，使用 33G 钝针将 hESC 衍生的感光祖细胞引入视网膜下空间。在这种方法中，注射针通过角膜缘区域的切口插入。然后针头穿过玻璃体腔，最后通过视网膜进入视网膜下空间。经常观察到细胞团块，当使用不合适的针头尺寸时，可能会阻塞细胞的递送。在加载到注射器之前，应使用 10 μL 移液器吸头努力重悬微量离心管中的细胞。我们最初尝试使用34G针头，其中经常观察到细胞对针头的阻塞。应针对特定细胞类型测试适当尺寸的针头，特别是窄孔针头在注射50 时往往会产生较少的活细胞。这种方法的优点之一是在注射过程中直接可视化，允许外科医生监测并仔细选择细胞输送的特定位置。在手术过程中，注射区域和针头应清晰可见。麻醉引起的白内障和角膜混浊会极大地影响细胞向特定位置的正确输送。
在进行注射时，针头应垂直穿透视网膜，针头的钝端应与巩膜平行，以尽量减少注射细胞渗漏到玻璃体空间（图3）。进行注射时，只能对注射器施加轻柔的压力。强大的压力会导致视网膜撕裂、出血、细胞渗漏到脉络膜腔、细胞无法通过针头和眼球刺穿。当针尖刚穿过视网膜时，可以确保最佳压力，并且在针尖处看到一个小的白色压力点。注射后，针头应从注射点缓慢而轻柔地缩回，以防止注射的细胞泄漏到玻璃体空间中。
这种方法的局限性在于具有挑战性的学习曲线。一项研究表明，训练有素的眼科医生需要对小鼠进行 364 次注射才能达到 95% 的成功率，而经验不足且具有手术经验的受训者预计需要更多次的培训46.这种方法的并发症包括视网膜中的针迹、细胞反流到玻璃体腔、脉络膜/视网膜出血和医源性白内障。然而，通过足够的训练，这些并发症的观察到明显较少46.
总之，我们的方法可以将 hESC 衍生的感光祖细胞递送至 rd10 小鼠的视网膜下空间，如 OCT 扫描所示。该方法可用于探索新型治疗化合物、不同细胞类型移植和基因疗法，用于治疗视网膜外层和 RPE 相关疾病。
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Disclosures
Hwee Goon Tay 是 Alder Therapeutics AB 的联合创始人。其他作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢 Wei Sheng Tan、Luanne Chiang Xue Yen、Xinyi Lee 和 Yingying Chung 为冷冻保存后第 32 天 hESC 衍生的光感受器祖细胞的制备提供技术援助。这项工作得到了美国国家医学研究委员会青年研究员研究资助奖（NMRC / OFYIRG / 0042 / 2017）和国家研究基金会第24届 竞争性研究计划资助（CRP24-2020-0083）对HGT的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
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