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方法文章

将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

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DOI：

10.3791/66090

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2024年2月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

本文内容

摘要

本方案描述了一种可重构的基于膜的细胞培养平台，该平台将开放式孔板格式与流体流动功能相结合。该平台与标准操作流程兼容，能够在开放式孔板和微流控培养模式之间进行可逆转换，满足工程学与生物科学实验室的不同需求。

摘要

微生理系统是一种微型化的细胞培养平台，用于在实验室环境中模拟人体组织的结构与功能。然而，尽管缺乏流体流动能力，基于开放孔板和膜的实验方法仍是模拟组织屏障的金标准，而微生理系统在生物科学实验室中的广泛应用仍受到限制。这一问题主要归因于现有的微生理系统与为开放孔板系统开发的标准实验方案和工具之间存在不兼容性。

本文介绍了一种可重构的基于膜的开放式微孔平台的构建方案，该平台具有开放微孔结构、增强流体流动能力，并与常规实验方案兼容。该系统采用磁性组装方法，可实现开放微孔模式与微流控模式之间的可逆切换。通过该方法，用户可灵活地在开放微孔模式下使用标准操作流程启动实验，并根据需要随时添加或移除流体流动功能。为展示该系统的实际应用及其与常规技术的兼容性，实验首先在开放微孔模式下建立了内皮细胞单层。随后将系统重构以引入流体流动，再切换回开放微孔模式进行免疫染色和RNA提取。由于该可重构设计既兼容传统的开放微孔实验流程，又具备流体增强功能，预期将在工程学与生物科学实验室中得到广泛应用。

引言

血管屏障作为关键的界面，将血液区室与周围组织分隔开来。它们在维持稳态方面发挥着重要作用，包括招募免疫细胞、调控分子通透性，以及防止病原体侵入组织1,2。体外培养模型已被开发用于模拟体内微环境，从而系统性地研究影响健康与疾病状态下屏障特性的各种因素和条件3,4。

此类培养模型最常用的方法是类似Transwell的方法 "敞口孔" 构型5，其中多孔的核孔膜将充满培养基的隔室分隔开来（图1A）。在此类模型中，细胞可接种于膜的任意一侧，并已开发出多种实验方案。然而，这些系统在提供支持屏障成熟及模拟免疫细胞循环所必需的流体流动方面存在局限性 体内5,6因此，它们无法用于需要引入药物剂量、机械刺激或流体诱导剪切应力等动态流动条件的研究。6,7,8.

为了克服开放式培养皿系统的局限性，已开发出将多孔培养膜与可独立寻址的流体通道相结合的微流控平台9。这些平台能够精确控制流体路径、灌注过程、化学物质的引入、可控的剪切力刺激以及动态添加细胞的能力7,10,11,12,13。尽管微流控平台具备先进的功能，但由于其复杂的微流控操作流程以及与现有实验工作流程不兼容，尚未在生物科学实验室中得到广泛应用4,10,14。

为了弥合这些技术之间的差距，我们提出了一种采用可磁控重构的模块化系统的实验方案。该系统可根据实验的具体需求，在开放式培养皿模式与微流控模式之间轻松切换。该平台包含一种称为 m-µSiM（由硅膜驱动的模块化微生理系统）的开放式培养装置，其具有厚度为 100 nm 的细胞培养膜（纳米膜）。如图 1B所示，该纳米膜具有高孔隙率（15%）和类似玻璃的透明性。它在物理上将上层腔室与底部通道分隔开，允许分子在生理尺度长度范围内进行跨膜传输15。与传统的径迹蚀刻膜不同，后者在明场成像活细胞时存在已知的成像挑战，而该纳米膜优异的光学和物理特性使得能够清晰地观察膜两侧表面的细胞15,16,17。

本方案详细介绍了专用接种和流体模块的制备方法，并阐述了该平台的磁性重构过程。展示了如何利用该平台在静态和动态条件下建立内皮屏障。实验结果表明，在剪切力刺激下，内皮细胞沿流动方向排列，并且剪切力敏感基因的表达水平上调。

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方案

根据实验需求和最终用户的偏好，该设计可采用多种模式使用。每次实验前，请参考图2所示的决策流程图，以确定本方案所需的步骤和模块。例如，若用户希望在整个实验过程中保持敞口培养小室的格式，以便直接与Transwell型系统进行比较，则细胞接种时无需使用图案化掩膜。核心模块为市售产品（见材料表），超薄纳米膜可根据实验需求，从具有不同孔隙率和孔径的材料库中选择。

1. 制备图案化掩模

注意：图案化掩膜用于将细胞精确定位于膜芯片的多孔区域，防止细胞沉降到周围的硅层上，以免在添加流体模块后细胞可能受到损伤16（参见图3）。单层细胞的损伤可能对屏障完整性产生不利影响，并损害实验结果。在开放式的静态培养中无需使用该掩膜，因为不存在细胞损伤的风险。

  1. 使用补充代码文件1中提供的设计购买、机械加工或3D打印模具（图4A）。
    注意：与高纵横比的直壁结构相比，模板壁采用锥形设计，可增加培养基容量并最大限度减少气泡滞留。
  2. 使用冷压滚轮将130 µm厚的压敏胶（PSA）膜粘附到3.2 mm厚的亚克力板上（参见材料表）。
  3. 根据补充代码文件2中提供的设计，使用激光切割亚克力板，形成一系列腔体（图4B）。
  4. 剥离PSA膜上的保护层，并将亚克力板粘附至模具上。
    注意：确保激光切割的亚克力板与模具对齐，使模具特征位于腔体中心（图4C）。此步骤的准确性直接影响膜上细胞定位的精度。
  5. 充分混合PDMS预聚物（基础剂与催化剂比例为10:1）（参见材料表），并在真空腔中脱气，直至无可见气泡（5–15分钟）。
  6. 将PDMS缓慢倒入模具腔体中，并用平整边缘刮平。
    注意：为防止气泡滞留，应缓慢向每个腔体中倾倒PDMS。若倾倒后仍有气泡，可将模具放入真空腔中再次脱气。
  7. 将PDMS在70 °C的加热板上固化1小时，随后冷却至室温。
  8. 使用平头镊子从模具腔体中取出模板。

2. 流动模块的制备

注意：流体模块与核心模块的三叶草形孔具有相似的轮廓，并包含一个模制的微通道（宽度 = 1.5 mm，高度 = 0.2 mm，长度 = 5 mm）。三叶草形状有助于将通道对准多孔培养区域（图5）。

  1. 采用标准的软光刻技术18，利用补充编码文件3中提供的设计制备具有特定结构的硅模具（图4D）。
  2. 将一片130 µm厚的压敏胶膜（PSA膜）粘附至一块3.2 mm厚的丙烯酸板上。
  3. 根据补充编码文件4中的设计对丙烯酸板进行激光切割，形成一系列三叶草形腔体（图4E）。
    注意：腔体的高度决定了流体模块的高度，必须略高于核心模块孔的高度（高出0–0.1 mm），以确保密封性良好。
  4. 去除压敏胶膜上的保护层，然后将激光切割后的丙烯酸板与硅模具对齐贴合，使硅模具上的三角形对准标记与丙烯酸板上的对应标记对齐。
    注意：与步骤1.4类似，需确保激光切割的丙烯酸板与硅模具对齐，使模具结构位于每个腔体的中心位置（图4F）。此步骤决定了微通道相对于基底位置的准确性。
  5. 将脱气后的PDMS缓慢倒入模具腔体中，并用平整边缘刮平表面。
    注意：若浇注后存在气泡，需再次对模具进行脱气处理，直至气泡完全消除。
  6. 将模具置于加热板上，在70 °C条件下烘烤PDMS 1小时，随后让模具自然冷却至室温。
  7. 使用平头镊子小心地将流体模块从模具腔体中取出。
  8. 将流体模块的微通道结构面朝上放置，并使用活检打孔器（见材料表）在通道末端位置打孔，形成核心模块的进样口和出样口。

3. 下层和上层丙烯酸外壳的制备

注意：核心模块可嵌入下部外壳中。外壳内嵌磁铁之间的相互吸引作用使流路模块与核心模块压紧并密封（图6）。

  1. 使用补充代码文件5中提供的设计，激光切割一张2 mm厚的亚克力板，以制成带有磁铁插入孔的上部外壳。
  2. 将一层130 µm厚的压敏胶膜（PSA）粘附到一块3.5 mm厚的亚克力板上。
  3. 根据补充代码文件6中提供的设计，激光切割该亚克力板，以制成带有磁铁插入孔的下部外壳。
    注意：下部外壳的厚度是一个关键参数，必须与核心模块的总厚度相匹配，以防止流体泄漏。
  4. 移除PSA保护层，并将下部外壳粘接到玻璃盖玻片上。
  5. 将4.75 mm镀镍钕铁硼磁铁（见材料表）压入外壳的激光切割孔中。
    注意：确保下部和上部外壳中的磁铁以相反极性放置，以实现磁性吸引（图6）。

4. 流路系统的制备

注意：闭环流动回路包含两个作为储液池的样品收集管（图7）。入口储液池中装有聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜，以允许培养基与培养箱中的 CO2 浓度达到平衡。

  1. 使用1 mm活检打孔器在样本收集管的管盖上打出两个孔。
  2. 使用活检打孔器在另一个样本收集管的管盖上打出两个孔（分别为1 mm和4 mm），并在该管体下部打一个1 mm的孔。
  3. 将20 G分配尖端插入每个1 mm孔中，并用热熔胶密封。
  4. 将0.22 µm PVDF滤膜（见材料表）放入4 mm孔中，并用热熔胶密封。
  5. 使用补充代码文件7中提供的设计对1.5 mm丙烯酸板进行激光切割，以制作样本固定平台。
  6. 将储液装置放置在丙烯酸平台上。
  7. 使用微流管连接分配尖端（见材料表）。
  8. 使用21 G分配尖端将微流管连接至流体模块的入口和出口。
  9. 使用蠕动泵（见材料表）进行流体循环。
    ​注意：也可根据需要选用注射泵或气动泵来驱动流体。流速应根据实验需求确定。本研究提供了一个基于经实验验证的COMSOL模型的综合表格（见补充表1），以帮助用户选择合适的流速，从而在细胞单层上实现目标剪切应力16。

5. 细胞接种

注意：与传统的膜插件类似，不同类型的细胞均可在纳米膜上进行培养。此外，可在底部通道的膜另一侧共培养第二种细胞类型15。

  1. 在室温下用 5 µg/cm2 的纤连蛋白（见材料表）包被膜 1 小时，以改善细胞贴附。
    注意：所选的细胞类型可能影响所需的包被条件和细胞密度。此处描述的步骤适用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs，见材料表）。
  2. 使用 P200 移液器吸除包被液，并将图案化模板放入核心模块的孔中。
  3. 向装置的孔和底部通道中加入细胞培养基。
  4. 以 40,000 个细胞/cm2 的密度将 HUVECs 接种至孔中。
    注意：在此密度下，HUVECs 通常在培养 24 小时后形成融合的单层细胞16,19。
  5. 将装置放入培养皿中，并在培养皿内放置一个装有去离子水的 15 mL 离心管盖，以维持局部湿度。
  6. 将培养皿转移至培养箱中。
    ​注意：应每隔 24 小时更换一次装置顶部孔和底部通道中的细胞培养基。更换底部通道的培养基时，可将新鲜培养基轻轻注入其中一个端口，使旧培养基从另一端口排出。

6. 重新配置为微流控模式

  1. 在组装前，将上壳体、下壳体、流体模块、储液池、管路和分配尖端放入紫外灭菌箱中灭菌30分钟。在流路中依次循环70%乙醇和无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
  2. 用内皮细胞生长培养基填充储液池和管路（参见材料表）。
  3. 将下壳体放置在样品台上。将开放式核心模块插入下壳体中。
  4. 吸出模块孔中的细胞培养基。将流体模块放入孔中。
  5. 放置上壳体，以密封核心模块孔中的流体模块。将进样和出样分配尖端连接至流体模块的端口。
  6. 启动蠕动泵，向系统引入流体流动。

7. 引入流体后在敞口孔板中进行下游分析

注意：此处的培养时间取决于实验目的。用户可根据自身需求，选择在敞口培养板或微流控装置中进行后续分析（例如免疫细胞化学、RNA提取）。例如，若倾向于使用敞口培养板格式，应重新配置系统，并依据标准方案进行检测16,19。

  1. 当达到所需的剪切流暴露时间后，停止泵的运行。取下进样口和出样口的分配尖端。
  2. 取下上部壳体。使用镊子小心地从孔中取出流体模块。
  3. 向孔中加入 100 µL 细胞培养基。根据标准操作流程进行所需的检测。

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结果

开放井核心模块最初被放置在一个由下部外壳和盖玻片形成的特定腔室内，如图6A所示。随后，包含微通道和接入端口的流体模块被插入核心模块的井中。由于嵌入在下部和上部外壳中的磁体之间的磁吸引力，流体模块被牢固地密封在膜的硅支撑层上，如图6B所示。为了评估该磁性锁紧机制的有效性，进行了爆破压力测试，结果表明系统可承受高达38.8 ± 2.4 kPa的封闭压力。该耐压能力显著超过了细胞培养应用中通常遇到的操作压力。此外，当流速高达4000 µL/min时，系统仍无泄漏，这相当于培养区域产生74 dynes/cm2的剪切应力16。

在开发一种可在开放孔板模式与微流控模式之间切换的平台时，必须仔细考虑细胞接种方法，而这一点在传统的静态开放孔板平台中通常无需关注16。通道边界周围单层细胞的损伤可能会影响实验结果的准确性20

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讨论

本实验方案旨在建立一种实用方法，将流体功能整合到带有超薄纳米膜的开放式培养小室平台中。该设计采用磁性锁合方式，可在实验过程中在开放式小室模式与流体模式之间切换，从而结合两种模式的优势。与传统的永久键合平台不同，磁性锁合允许在实验流程中的适当时机拆卸平台16,25,26,27。在此平台上，细胞首先在熟悉的开放式小室格式中接种并形成屏障，随后通过添加流动模块并利用磁力密封，即可将系统重新配置为流体模式。这种重构带来两个关键优势：第一，可通过流体诱导的剪切应力模拟生理条件；第二，可在流动条件下引入免疫细胞等次级组分16。磁性锁合特性提供了无需工具的组装方式，实现开放式小室与微流控格式之间的按需切换。因此，后续分析（如免疫细胞化学染色和RNA提取）可根据需要，采用标准技术在熟悉的开放式小室格式中进行，或使用微流控技术完成

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披露

J.L.M. 是 SiMPore 公司的联合创始人，并持有该公司股权。SiMPore 正在将基于超薄硅的技术商业化，包括本研究中使用的膜。

致谢

本研究部分由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R43GM137651、R61HL154249、R16GM146687，以及美国国家科学基金会资助 CBET 2150798。作者感谢罗切斯特理工学院机械车间在铝制模具制造方面的支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 x 0.86 微流管Langer InstrumentsWX10-14 & DG 系列
1 mm 一次性活检打孔器，Integra MiltexVWR95039-090
1x PBS，pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
20 号规格 IT 系列分配尖端Jensen GlobalJG20-1.5X
21 号规格 NT 高级系列斜角分配尖端Jensen GlobalJG21-1.0HPX-90
3M 467 MP 压敏胶（PSA）DigiKey3M9726-ND
3M 468 MP 压敏胶（PSA）DigiKey3M9720-ND
AlexaFluor 488 标记鬼笔环肽ThermoFisher ScientificA12379 
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444556
牛血清白蛋白（BSA），第五组分，98%，试剂级，Alfa Aesar，规格 = 10 gVWRAAJ64100-09
透明抗刮擦和抗紫外线浇铸丙烯酸板McMaster-Carr8560K17112" x 12" x 1/16"
透明抗刮擦和抗紫外线浇铸丙烯酸板McMaster-Carr8589K3112" x 12" x 3/32"
透明抗刮擦和抗紫外线浇铸丙烯酸板McMaster-Carr8560K19112" x 12" x 7.64"
Corning 人纤维连接蛋白，1 mgCorning47743-728
盖玻片，Globe Scientific，长 x 宽 = 24 x 60 mmVWR10118-677
DOW SYLGARD 184 硅胶封装剂，透明，0.5 kg 套件Ellsworth Adhesives4019862
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKitLonzaCC-3162
夹具 A1&A2SiMPore Inc.NA
夹具 B1&B2SiMPore Inc.NA
含 RNase 抑制剂的高容量 cDNA 反转录试剂盒Thermo Fisher Scientific4374966
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）ThermoFisher ScientificC0035C
LIVE/DEAD 细胞成像试剂盒（488/570）Thermo Fisher ScientificR37601
Molecular Probes Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物Thermo Fisher ScientificH3570
镀镍磁铁（直径 4.75 mm，拉力 0.34 kg）K&J MagneticsD313/16" 直径 x 1/16" 厚度
多聚甲醛，4% w/v 水溶液，无甲醇，Alfa AesarFisher Scientificaa47392-9M
蠕动泵Langer InstrumentsBQ50-1J-A
光刻胶 SU-8 显影液Fisher ScientificNC9901158
PVDF 注射器滤器PerkinElmer2542913
硅晶圆University wafer, USA1196
SU-8 3050Fisher ScientificNC0702369
目的基因：eNOS（Hs01574659_m1）ThermoFisher Scientific4331182
目的基因：GAPDH（Hs02786624_g1）ThermoFisher Scientific4331182
目的基因：KLF2（Hs00360439_g1）ThermoFisher Scientific4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352
运输管样品白色盖，5 mL，无菌VWR100500-422
TRI 试剂ThermoFisher ScientificAM9738
超薄纳米多孔膜芯片SiMPore Inc.NPSN100-1L设计与所有 SiMPore 膜兼容 
uSiM 组分 1SiMPore Inc.NA
uSiM 组分 2SiMPore Inc.NA

参考文献

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