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由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

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DOI：

10.3791/66527

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2024年3月22日

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1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

本文内容

摘要

本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。

摘要

本方案详细描述了人诱导多能干细胞（iPSCs）的扩增与传代，以及其向破骨细胞的分化过程。首先，将iPSCs解离为单细胞悬液，用于后续的拟胚体诱导。经过中胚层诱导后，拟胚体进一步进行造血分化，产生悬浮的造血细胞群体。随后，收集的造血细胞经历巨噬细胞集落刺激因子介导的成熟阶段，最终分化为破骨细胞。破骨细胞分化完成后，通过TRAP染色结合甲基绿核染色对其进行鉴定。破骨细胞表现为多核、TRAP阳性的多核巨细胞。其鉴定结果可通过组织蛋白酶K（Cathepsin K）染色进一步验证。通过骨组织和矿物质吸收实验可实现功能表征，确认其为真正具有功能的破骨细胞。本方案展示了一种高效且灵活的方法，可用于从人iPSCs分化获得破骨细胞，并易于在需要大量功能性人破骨细胞的应用中推广。该方法在骨生物学研究、癌症研究、组织工程及内植入假体研究等领域具有广泛的应用前景。

引言

破骨细胞（OC）是一类来源于造血系统的1,2多功能细胞类型，广泛应用于骨病研究3,4、癌症研究5,6、组织工程7,8以及内假体研究9,10等领域。然而，OC的分化过程具有挑战性，因为单核前体细胞融合形成多核破骨细胞是获得功能性OC的必要步骤11。OC分化需要多种生物学因子参与，例如核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。已有研究报道，M-CSF对细胞增殖、细胞存活以及RANK表达具有促进作用12,13,14。另一方面，RANKL与RANK结合后可激活下游信号级联反应，从而诱导破骨细胞生成。该激活过程通过肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）介导，导致B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制蛋白α（IκB-α）降解，IκB-α是一种可结合NF-κB二聚体的抑制蛋白16,17。因此，IκB-α的降解释放出NF-κB二聚体，后者转入细胞核并诱导转录因子c-Fos和活化T细胞核因子1（NFATc1）的表达。这进一步触发了大量与OC分化相关蛋白的转录15,18。上调的蛋白如DC-Stamp和Atp6v0d2介导OC前体细胞之间的细胞融合，最终形成合胞体结构19,20,21。

在人类原代细胞中，CD34+ 和 CD14+ PBMC 是目前最广泛用于分化为成骨细胞（OCs）的细胞类型22。然而，该方法受限于供者来源细胞中 CD34+ 群体的异质性23以及其扩增能力有限。人诱导多能干细胞（iPSCs）为成骨细胞提供了另一种来源。由于 iPSCs 可无限增殖24，因此能够实现成骨细胞生产的扩增和规模化，从而支持大量成骨细胞的分化，推动成骨细胞相关研究的开展。

已有多种将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为成骨细胞（OCs）的实验方案发表25,26,27。整个分化过程可分为iPSC扩增阶段、中胚层及造血分化阶段，以及成骨细胞分化阶段。在分化前对iPSC进行扩增，有助于在分化开始前实现成骨细胞的大规模生产。目前存在多种中胚层和造血分化的策略。传统上采用拟胚体（embryoid body, EB）形成的方法来诱导造血细胞分化，但基于单层培养的方法是另一种无需诱导EB形成的造血分化策略。然而，基于单层培养的体系可能仍需进一步优化，因为包括我们在内的多项研究发现，基于EB的方法在成骨细胞分化过程中更为稳定可靠。

本文描述了利用基于拟胚体（EB）的方法将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为破骨细胞（OCs）的实验流程。该方案改编自 Rössler 等人26，并进行了优化以提高实验的稳定性，并允许在分化过程中进行冷冻保存。首先，在分化第10天时仅进行一次造血细胞的收集。随后将造血细胞冷冻保存，以增加分化过程中的操作灵活性。此外，我们将用于OC分化的造血细胞接种密度从1 × 105 提高至2 × 105 个细胞/cm2。实验中采用了较新的人iPSC无血清培养基（hiPSC-SFM，参见材料表），并且使用200–300 µg/mL的基底膜提取物（参见材料表）替代0.1%明胶进行培养孔包被。培养基中未添加青霉素/链霉素。

Rössler 等人26 的实验方案最初是从一种将诱导多能干细胞（iPSC）分化为巨噬细胞的方案28 改进而来的，该方案利用拟胚体（EB）形成来实现造血分化。尽管研究人员长期以来一直采用拟胚体形成方法进行造血分化29,30，但文献中已报道了多种诱导拟胚体形成的方法，包括自发聚集、在圆底孔板中离心、悬滴培养、生物反应器培养、锥形管培养、缓慢旋转侧向容器以及微模具凝胶培养31。本方案采用将解离后的 iPSC 在圆底孔板中离心，使单个 iPSC 相互靠近，从而促进球状体（EB）的形成，具体操作如下所述。

方案

注意：本方案中使用的所有试剂均可在材料表中找到。除非另有说明，所有培养基在使用前均预先平衡至 37 °C。所有离心步骤均在 37 °C 下进行，并采用最慢的加速度/减速度模式。除非另有说明，始终使用一次性巴斯德玻璃吸管移除上清液。

1. 人类iPSC的解冻与传代培养

  1. 在解冻iPSCs的前一天，用1 mL基底膜提取物（浓度为200-300 µg/mL）包被6孔板中的一个孔，并将培养板置于4 °C过夜。
  2. 次日，使用P1000移液器解冻并转移细胞至15 mL离心管中，逐滴加入5-7 mL含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基。
  3. 以300 x g离心5分钟。轻柔地从离心机中取出细胞，注意不要扰动细胞沉淀。
  4. 使用巴斯德玻璃移液器小心吸除上清液，并用P1000加宽口吸头将细胞重悬于1 mL hiPSC无血清培养基（hiPSC-SFM，含10 µM Rho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632）中。
  5. 吸除前一天包被的孔中的基底膜提取物（步骤1.1），向孔中加入1 mL含10 µM Y-27632的hiPSC-SFM培养基，再将重悬的iPSCs加入孔中，使每孔终体积为2 mL。
  6. 轻轻摇动培养板以均匀分布iPSC细胞团，随后将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  7. 每隔一天使用hiPSC-SFM（不添加ROCK抑制剂Y-27632）进行完全换液。iPSCs通常在传代培养3-4天后达到70-80%汇合度。

2. 传代iPSCs

  1. 在传代诱导多能干细胞（iPSCs）前一天，使用浓度为200-300 µg/mL的基底膜提取物包被6孔板的孔。将6孔板置于4 °C过夜。
    注意：确认细胞已达到约70-80%融合度。确保iPSCs不要过度融合（超过80%融合度），因为这会促进自发分化。
  2. 开始传代iPSCs时，在体视显微镜下使用10 µL或20 µL移液枪头或细胞刮刀去除已分化的区域或含有大量死亡iPSC聚集体的区域。分化的区域颜色会显得更致密或更白。
    注意：刮除的细胞聚集体可能仍部分附着在孔底。
  3. 使用宽口P1000移液器多次冲洗孔底，以去除可能仍部分附着在孔底的任何聚集体。
  4. 弃去含有脱落iPSC聚集体的旧培养基。再用磷酸盐缓冲液（PBS）重复洗涤步骤两次。
  5. 接下来，每孔加入1 mL浓度为5 U/mL的分散酶（Dispase）。iPSC克隆边缘将在室温孵育3-5分钟后从孔板上翘起，可在体视显微镜下观察到。
  6. 小心移除分散酶，避免使轻微脱离的聚集体脱落，并每孔加入1 mL含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基。使用一次性细胞刮刀将聚集体切割成较小的片段。使用干细胞传代工具可提高iPSC聚集体大小的一致性。
  7. 用孔中的培养基冲洗切碎的iPSC聚集体，并使用5 mL血清移液管或带宽口枪头的P1000将含聚集体的培养基转移至15 mL锥形管中。
  8. 用DMEM/F-12冲洗孔，并将冲洗液转移至含有iPSC聚集体的15 mL管中。
  9. 将切碎的iPSC聚集体在200 x g下离心3分钟。用巴斯德玻璃移液管吸除上清液，并使用5 mL血清移液管或带宽口枪头的P1000加入2 mL hiPSC-SFM培养基，以解离并重悬iPSCs。
  10. 吸除预包被孔板中残留的基底膜提取物，并向6孔板的每个孔中加入1 mL hiPSC-SFM培养基。
  11. 使用带宽口枪头的P1000将iPSCs转移至6孔板的新孔中，使每孔终体积为2 mL hiPSC-SFM。根据不同的iPSC细胞系，传代比例需优化。此处使用1:6的传代比例。
  12. 在体视显微镜下检查孔中漂浮的聚集体及其大小。理想情况下，聚集体大小应在50-200 µm之间。
  13. 在聚集体转移完成后轻轻摇动孔板，使细胞均匀分布，并在37 °C、5% CO2条件下培养至70-80%融合度。

3. 冻存iPSC细胞

  1. 为将iPSC细胞冻存，按上述方法传代细胞（参见操作步骤"2. iPSCs的传代"）。在将细胞切割成克隆并从孔底冲洗下来后（步骤2.10），于200 × g 离心3分钟，沉淀切割后的细胞团块。吸除上清液。
  2. 按每6孔板孔加入1 mL无血清冻存培养基的比例，将其加入15 mL离心管中，并使用带宽口吸头的P1000移液器重悬细胞团块。
  3. 将细胞转移至预先标记的冻存管中。盖紧管盖，并将冻存管立即放入预冷至4 °C的冻存盒中。于-80 °C保存24–48小时。
  4. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
    注：OC分化过程的示意图见图1。

4. 胚状体诱导

  1. 按照上述方法培养并扩增足够的iPSCs用于拟胚体（EB）诱导。
    注意：通过增加拟胚体数量可扩大破骨细胞（OC）的生产规模，从而整体提高造血细胞的产量。一个6孔板中70–80%汇合度的iPSC孔可获得约8.4 × 105个细胞。形成一个拟胚体需要12,500个单细胞iPSCs。
  2. 吸除iPSC培养物中的废弃培养基，并用D-PBS冲洗iPSC集落。
  3. 向6孔板的每孔中加入0.5 mL预热至室温的单细胞解离试剂，轻轻旋转培养容器使试剂均匀覆盖整个孔底表面。将培养容器置于37 °C孵育5–8分钟。
  4. 从孵育箱中取出培养容器，吸除单细胞解离试剂，然后向每孔中加入1 mL第1阶段分化培养基，该培养基由hiPSC无血清培养基组成，其中包含50 ng/mL人骨形态发生蛋白4（hBMP4）、50 ng/mL人血管内皮生长因子-165（hVEGF）、20 ng/mL人干细胞因子（hSCF）和10 µM Y-27632。
  5. 用第1阶段分化培养基轻轻冲洗孔壁以解离细胞，将解离后的iPSCs收集至15 mL锥形管中。
  6. 向孔中再加入1 mL第1阶段分化培养基，冲洗残留细胞；对于难以冲洗下来的集落，可使用细胞刮铲刮下。
  7. 将所有细胞转移至离心管后，在室温下以200 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。吸除上清液，使用5 mL血清移液管或带宽口吸头的P1000移液器，将细胞重悬于总共2 mL预平衡的第1阶段分化培养基中。
  8. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。向含有单细胞悬液的15 mL离心管中添加培养基，使最终浓度为每100 µL第1阶段分化培养基中接种12,500个细胞，接种于圆底超低吸附96孔板的每孔中。
    注意：在显微镜下观察，细胞应呈单细胞悬液状态，均匀分散于孔内。
  9. 将96孔板以100 x g离心3分钟。离心后，在显微镜下应可见细胞开始形成类球状结构。将板置于37 °C孵育箱中孵育24小时。
  10. 在第1天和第2天更换一半培养基，使用第1阶段分化培养基。为提高操作效率，可使用多通道移液器将每孔50 µL废弃的第1阶段分化培养基移至培养皿中弃去。
  11. 从96孔板中移除培养基后，使用体视显微镜检查是否有拟胚体被意外移出。若发现被意外移出的拟胚体，使用带宽口吸头的P1000移液器将其转移回96孔板中。
  12. 使用多通道移液器向圆底超低吸附96孔板的每孔中加入50 µL新鲜的第1阶段分化培养基。

5. 造血分化

  1. 开始造血分化前一天，用1 mL基底膜提取物（浓度为200–300 µg/mL）包被6孔板中的一个孔，并将6孔板置于4 °C过夜。
    注意：每个孔后续将加入8个EB。根据所准备的EB数量，相应地包被相应数量的孔。
  2. 吸除多余的基底膜提取物，并向6孔板的每个孔中预先加入3 mL第2阶段分化培养基，该培养基由造血基础培养基添加2 mM Ultraglutamine、55 µM 2-巯基乙醇、25 ng/mL人白细胞介素3（hIL-3）和100 ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF）组成。
  3. 使用带宽口吸头的P1000移液器，将8个EB转移至6孔板的每个孔中。转移后，通过肉眼或体视显微镜确认每个孔中均有8个EB。
    注意：1天后，悬浮的EB将贴附于孔底。在接下来的5–7天内，应可见到由造血细胞组成的悬浮细胞群。造血分化时间可调整，起始可为7天。分化10天后可观察到包含大量CD45+、CD14+和CD11b+亚群的造血细胞群体。
  4. 使用第2阶段分化培养基处理5天后，通过移除旧培养基并将其转移至50 mL锥形管中进行换液。移液时应缓慢操作，尽量减少悬浮细胞的损失，并尽可能降低剪切力。在体视显微镜下进行移液有助于避免意外移除细胞。
  5. 立即向每个孔中加入1 mL新鲜的第2阶段分化培养基。为了回收在此分化阶段可能已出现的悬浮造血细胞，请勿丢弃已移出的培养基。相反，将含有旧培养基的管子在300 x g下离心5分钟，然后吸除上清液。
  6. 向该管中加入新鲜的第2阶段分化培养基，并重悬细胞，以使可能随旧培养基转移的细胞脱离。
  7. 将含有回收细胞的2 mL新鲜第2阶段分化培养基加入每个孔中，这些孔此前已含有1 mL第2阶段分化培养基。
  8. 在造血分化的第10天，检查是否存在大量悬浮的造血细胞。通过收集这些细胞至50 mL离心管中进行收获。这些细胞可立即用于向破骨细胞（OCs）分化，或使用含10% DMSO、50% FBS和40%培养基的冻存液冷冻保存。

6. M-CSF 成熟与破骨细胞分化

  1. 以 200,000 个细胞/cm2 的浓度将细胞接种于经组织培养处理的孔板中，并使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 50 ng/mL 人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF）的 α-MEM 培养基进行培养。
  2. 为进行功能检测或成像，于接种后第 3 天用预热至 37 °C 的 PBS 通过 P1000 加样器配合宽口吸头轻轻洗涤，使经 M-CSF 成熟的细胞脱落。可能需要重复洗涤步骤以完全脱离细胞。
  3. 使用 P1000 加样器配合宽口吸头将脱落的细胞转移至 15 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
  4. 用破骨细胞（OC）分化培养基重悬并溶解细胞沉淀，该分化培养基为添加了 10% FBS、50 ng/mL hM-CSF 和 80 ng/mL 人核因子κB受体活化因子配体（hRANKL）的 α-MEM。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并以 200,000–250,000 个细胞/cm2 的密度将经 M-CSF 成熟的细胞重新接种至适合功能检测或成像的培养器皿中（例如骨吸收实验用板、成像用盖玻片等）。
  5. 使用 OC 分化培养基继续培养 7–9 天，每 2–3 天更换一次新鲜的 OC 分化培养基。
    注意：多核破骨细胞通常在培养 5–7 天后出现。

结果

在整个分化过程中监测细胞形态
以下描述的所有结果均使用 MCND-TENS2 iPSC 细胞系进行视杯（OC）分化而获得。该 iPSC 细胞系此前已在多项研究中应用32,33。尽管如此，其他 iPSC 细胞系也已成功应用于本分化方案。

通过常规的形态学观察，可发现iPSCs在向OCs分化的过程中呈现出不同且明显的形态学特征（图2）。iPSC细胞集落（图2A）被解离为单细胞悬液，在离心前可见细胞均匀分散于圆底培养板的孔中（图2B）。在离心（方案中步骤4.9）后，细胞将聚集于圆底超低吸附培养板孔的中央，并进一步形成球状结构（即类胚体，EBs，图2C）。在中胚层分化过程中，EBs的体积将增大至原来的2至3倍（图2D），并在为期4天的分化结束时肉眼清晰可见（图2E）。将EBs转移至6孔板中进行造血分化后（方案中步骤5.3），可见其附着于孔底并发生融合（图2F）。培养7-8天后，大量悬浮的造血细胞在培养基中可见（图2G）。在收获并重新接种造血细胞后，进入M-CSF诱导的成熟阶段，启动OC分化（方案中步骤6.4）。在随后的5-6天内，首次可见具有大而透明胞体的多核细胞（图2H），但此阶段仍可见大量单核细胞。再经过2-3天的OC分化，OCs将进一步与邻近细胞融合，形成含有更多细胞核的大型多核巨细胞（图2I）。

评估EB来源的造血细胞群体
造血分化可进行不同时间长度的培养。文献中描述的时间范围从7天至9周不等。在本方案中，造血分化过程持续10天。我们发现，经过10天的造血分化后，早期CD34+细胞比例较低（0.53%，图3A），而中期阶段的CD43+造血祖细胞比例较高（48.5%，图3B）。更重要的是，在10天的培养后，能够产生足够数量的CD45+（96.2%，图3C）、CD14+（33%，图3D）和CD11b+（35.9%，图3E）造血祖细胞（HPCs），从而可进一步成功分化为破骨细胞（OCs）。然而，根据不同的iPSC细胞系，可能需要调整和优化造血分化过程中的细胞因子处理时间（方案中第5.4步），以获得足量的CD45+、CD14+和CD11b+细胞。

经过10天的分化后，每个含有8个拟胚体的孔平均收获600万个造血细胞。

评估破骨细胞的形态与活性
破骨细胞（OC）分化完成后，可对其形态和功能进行评估。在M-CSF成熟步骤后，将OC前体细胞重新接种至培养皿载玻片或盖玻片上，以便在进行TRAP或组织蛋白酶K染色时获得更佳的成像质量。OC分化后的酶联TRAP染色显示，存在体积较大、多核且TRAP阳性的破骨细胞（图4A）。此外，在多核破骨细胞之间还可观察到少量TRAP弱阳性的单核细胞。未添加RANKL的阴性对照组未出现融合形成的多核破骨细胞，但仍可观察到少量TRAP弱阳性的单核细胞（图4B）。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示了经组织蛋白酶K（青绿色）、F-肌动蛋白（红色）染色，并结合DAPI核染色（蓝色）的破骨细胞（图4C、4D）。根据实验方案加入RANKL处理后，可见大型多核破骨细胞，其具有广泛的F-肌动蛋白细胞骨架结构，并且组织蛋白酶K染色呈阳性（图4C）。而未添加RANKL的阴性对照组则未见融合的多核细胞。

可通过检测破骨细胞的吸收活性进一步进行功能评估。可采用骨或矿物质吸收实验来测定其吸收活性。在此，将破骨细胞前体细胞接种于涂有磷酸钙的孔板上并诱导其终末分化。在蓝灰色区域可见明显的矿物质涂层被吸收区域（图4E）。可识别出不同大小的吸收陷窝。未被吸收的残留磷酸钙涂层呈棕色。吸收陷窝的存在证实了所获得的多核细胞即为破骨细胞。此外，还可对吸收陷窝进行定量分析，以评估和比较其吸收活性。可通过计算被吸收的矿物质总面积占孔板总表面积的百分比来进行量化。此外，还可进一步量化吸收陷窝的大小和数量。未经处理的阴性对照组未出现吸收陷窝（图4F）。

iPSC 分化过程示意图；中胚层至造血细胞阶段的培养设置。
图1：人iPSCs分化为破骨细胞过程的示意图。 插图由Hannah Blümke使用Affinity Designer 2.1.1绘制，采用了先前使用的绘图元素33。 请点击此处查看此图的放大版本。

细胞培养过程；显微镜图像显示生长阶段；实验性细胞发育。
图2：人类iPSC向破骨细胞分化过程中各阶段的显微镜图像。（A）传代过程中未分化的iPSC集落。（B）解离为单细胞悬液后、离心前，单细胞悬液中的iPSC在圆底孔板中的状态。（C）离心后，单细胞iPSC在孔中央聚集。（D）在为期4天的中胚层分化期间，类胚体（EBs）体积逐渐增大。（E）中胚层分化完成后可见的类胚体。（F）将类胚体转移至包被有基底膜提取物的6孔板后，可见类胚体附着于孔底并发生融合。（G）造血分化5–7天后，培养基中可见大量悬浮的造血细胞。（H）在M-CSF诱导成熟后，加入RANKL进行5–7天分化，首次出现含有3–4个细胞核的破骨细胞。（I）破骨细胞分化结束时，可观察到大型的多核细胞。比例尺：A、D、F、G = 200 µm，B、C、H、I = 50 µm，E = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示CD34+、CD43+、CD45+、CD14+、CD11b+标记物分析的流式细胞术图谱系列。
图3：利用流式细胞术分析类胚体来源的造血细胞表面标记物。 在对单细胞和活细胞设门后，通过标记物表达可对造血细胞进行分析，并鉴定亚群。(A) 根据本实验方案，发育早期的CD34+造血祖细胞群体极小甚至缺失。(B) CD43+细胞约占总细胞群体的50%。(C) 发育较晚阶段的CD45+造血祖细胞构成了造血细胞群体的主要部分，占96.2%。(D, E) 更为成熟的CD14+和CD11b+破骨细胞前体细胞分别占33%和36%。红色曲线：未染色阴性对照，蓝色曲线：同型对照，黄色曲线：用相应标记物抗体染色的细胞。图中数据引用自已发表文献33。 请点击此处查看该图的放大版本。

RANKL M-CSF 显微镜比较；处理组与对照组；细胞分化、染色结果。
图4：iPSC分化的人源破骨细胞的形态学与功能评估。（A）破骨细胞分化后的TRAP染色显示形成体积较大、多核、TRAP阳性的破骨细胞。在多核破骨细胞之间可观察到少量TRAP弱阳性的单核细胞。（B）未添加RANKL的阴性对照组进行TRAP染色后，未见融合形成的多核破骨细胞。然而，仍可观察到少量TRAP弱阳性的单核细胞。（C）在盖玻片上分化的破骨细胞经共聚焦激光扫描显微镜观察，F-actin染色为红色，组织蛋白酶K（Cathepsin K）染色为青绿色，DAPI核染色为蓝色。图像显示形成体积较大的多核、Cathepsin K阳性的破骨细胞。（D）未添加RANKL的阴性对照组与（B）类似，细胞密度较低，仅见单核细胞。（E）可通过评估破骨细胞的骨吸收活性进行功能分析。为此，将破骨细胞分化培养于骨或矿物吸收检测试剂板上。使用倒置宽场显微镜在相差模式下获取拼接图像，可见磷酸钙矿物层上出现较大的吸收区域。通过测量吸收面积占总面积的比例，可进一步量化吸收活性。（F）未添加RANKL的阴性对照组未出现吸收区域。比例尺：A、B = 100 µm，C、D = 50 µm，E、F = 1 mm。图像经自先前发表的数据修改而来33。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案提供了一种可靠且稳健的方法，用于将iPSCs分化为OCs。然而，在整个分化过程中可能会遇到若干潜在问题。来源于不同组织来源细胞的人iPSC细胞系已成功通过本方案实现分化33。在冻存iPSCs时（见方案步骤"3. 冻存iPSCs"），传代时的一个孔细胞被冻存至一个冻存管中。在解冻时（见方案步骤"1. 人iPSCs的解冻与扩增"），一个冻存管的细胞被接种至6孔板中的单个孔内。不同的iPSC细胞系行为可能略有差异，其增殖速率也会有所不同，因此需要相应调整传代比例。

在传代诱导多能干细胞（iPSCs）或将iPSCs解离为单细胞悬液以进行拟胚体（EB）诱导时，去除自发分化的克隆或死亡细胞的聚集体至关重要，这有助于提高中胚层和造血分化的效率与效果。该操作可在体视显微镜下进行，使用细胞刮刀、P10或P20移液器枪头，或由巴斯德吸管自制的刮取工具完成35。

如上所述，本方案涉及将iPSC集落解离为单细胞悬液以诱导形成胚状体（EB），而其他方案则是将iPSC以细胞团聚体形式保留，并通过离心诱导EB形成36。已有报道指出，EB的大小、细胞数量、形状和形态均会影响其分化能力37,38,39。因此，我们推测将细胞解离为单细胞悬液有助于在离心后获得大小和形状更为均一的EB，从而实现更稳定的造血细胞生成结果31。

已有文献报道了其他用于拟胚体诱导的方法。据报道，将单细胞悬液与ROCK抑制剂联用以提高细胞存活率的方法在控制拟胚体大小和分化结果方面具有优势31。

本方案中所述的圆底96孔板EB诱导法适用于大规模生产胚状体（EB），并可实现成骨细胞（OC）生产的扩增。最近已有研究报道了一些无需胚状体诱导步骤的新型造血分化方法，这些方法有可能促进分化过程32。然而，这些方案尚未建立用于成骨细胞分化33。

在上述方案中，我们描述了造血分化第5天的换液操作。在分化第4至5天左右，可能已有少量悬浮细胞出现。为避免丢弃任何悬浮细胞，应先将培养基收集至离心管中，离心后再行弃去。随后必须用新鲜培养基重悬管底的细胞沉淀，并将其转移回6孔板的孔中。然而，早期悬浮细胞群体在OC分化中的意义仍有待明确。

可使用流式细胞术评估造血细胞的生成。对于破骨细胞分化而言，获得高产量的 CD45+、CD14+ 和 CD11b+ 细胞是理想的33。已有报道称，收获的悬浮造血细胞在冻存过程中具有挑战性，通常回收率有限且细胞活力较低40,41。通过将造血细胞冻存在由50%无血清造血细胞扩增培养基（见材料表）、40% FBS 和 10% DMSO 组成的冻存液中，我们在解冻后能够回收到细胞活力约为 90.3% ± 2.62 SD（n = 7）的细胞。

破骨细胞生成需要多个单核破骨细胞前体融合，形成具有矿质和骨吸收能力的多核破骨细胞。虽然小鼠破骨细胞前体细胞系仅需添加RANKL即可诱导破骨细胞形成42，人类前体细胞需要额外的M-CSF以维持细胞存活和增殖43OSCAR 最近被发现是参与破骨细胞分化的另一种受体，尽管迄今为止仅发现 I 型胶原是其配体。尽管利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的破骨细胞对 OSCAR 的研究仍然有限，但超生理条件下的研究 体外 小鼠细胞系中RANKL和M-CSF的浓度似乎可绕过对OSCAR激活的需求44，OSCAR的激活 体内 似乎是破骨细胞生成所必需的共刺激信号45还需要考虑的一个因素是培养板表面。化学46 和物理的47 表面特性已知会影响破骨细胞的分化，可能促进或抑制其成功分化。前体细胞群体内的一定异质性似乎对破骨细胞的成功融合也至关重要，因为与融合相关的不同因子（如CD47和DC-STAMP）在破骨细胞融合的不同阶段发挥作用。48.

综上所述，该方案能够实现人iPSCs向OC的分化，从而促进并加速OC相关研究。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢Giachelli实验室成员提供的技术支持与帮助。感谢W. M. Keck显微镜中心及该中心负责人Nathanial Peters博士在获取共聚焦显微镜和宽场显微镜图像方面提供的协助。同时感谢华盛顿大学流式细胞分析核心设施（UW Flow Core Facility）及该设施负责人Aurelio Silvestroni在技术方面提供的支持与帮助。最后，感谢Hannah Blümke在插图绘制与平面设计方面的支持。

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R35 HL139602-01。我们同时感谢 NIH S10 资助项目 S10 OD016240 对 W. M. Keck 中心仪器设备的资助，以及 NIH 资助项目 1S10OD024979-01A1 对华盛顿大学流式细胞分选核心设施（UW Flow Core Facility）仪器设备的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Sigma AldrichM6250-10ML
抗体 - 抗组织蛋白酶K Abcamab19027
抗体 - APC标记的抗人CD45BD555485
抗体 - APC标记的小鼠IgG1，κ 同型对照BD555751
抗体 - BV711标记的抗人CD14BD563372
抗体 - BV711标记的小鼠IgG2b，κ 同型对照BD563125
抗体 - 羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
抗体 - PE标记的抗人CD14R&D SystemsFAB3832P-025
抗体 - PE标记的抗人整合素α M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
抗体 - PE-Cy7标记的抗人CD34BD560710
抗体 - PE-Cy7标记的小鼠IgG1 κ 同型对照BD557872
抗体 - PE/氰基5标记的抗人CD11bBiolegend301308
抗体 - PE/氰基5标记的小鼠IgG1，κ 同型对照Biolegend400118
抗体 - PerCP-Cy5.5标记的小鼠IgG1 κ 同型对照BD550795
抗体 - PerCP-Cy5.5标记的抗人CD43BD563521
骨吸收检测试剂盒CosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 自动细胞计数仪ThermoFisher16812556
Cultrex 干细胞认证低生长因子基底膜提取物R&D Systems3434-010-02基底膜提取物
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase（5 U/mL）STEMCELL Technologies7913
含15 mM HEPES的DMEM/F-12Stem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
人骨形态发生蛋白4（hBMP4）STEMCELL Technologies78211
人IL-3STEMCELL Technologies78146.1
人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF）STEMCELL Technologies78150.1
人可溶性核因子-κB受体激活剂配体（hsRANKL）STEMCELL Technologies78214.1
人干细胞因子（hSCF）STEMCELL Technologies78155.1
人TruStain FcX（Fc受体阻断溶液）Biolegend422301
人血管内皮生长因子-165（hVEGF165）STEMCELL Technologies78073
Invitrogen 罗丹明鬼笔环肽InvitrogenR415
MEM α，含核苷，无酚红ThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855无血清冷冻保存培养基
mTeSR Plus 培养基STEMCELL Technologies100-0276人诱导多能干细胞无血清培养基（hiPSC-SFM）
Nunclon Sphera 96孔，Nunclon Sphera处理，U型底微孔板Thermo Scientific174925圆底超低吸附96孔板
P1000 宽口吸头ThermoFisher2079GPK
ROCK抑制剂 Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650造血细胞培养基
TrypLE Select 酶（1X），无酚红Thermo Fisher12563011单细胞解离试剂
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基Bioscience Lonza04-418Q造血基础培养基
µ-Slide 8孔高壁板Ibidi80806

参考文献

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M CSF TRAP K

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