本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。
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本文内容
摘要
摘要
本方案详细描述了人诱导多能干细胞（iPSCs）的扩增与传代，以及其向破骨细胞的分化过程。首先，将iPSCs解离为单细胞悬液，用于后续的拟胚体诱导。经过中胚层诱导后，拟胚体进一步进行造血分化，产生悬浮的造血细胞群体。随后，收集的造血细胞经历巨噬细胞集落刺激因子介导的成熟阶段，最终分化为破骨细胞。破骨细胞分化完成后，通过TRAP染色结合甲基绿核染色对其进行鉴定。破骨细胞表现为多核、TRAP阳性的多核巨细胞。其鉴定结果可通过组织蛋白酶K（Cathepsin K）染色进一步验证。通过骨组织和矿物质吸收实验可实现功能表征，确认其为真正具有功能的破骨细胞。本方案展示了一种高效且灵活的方法，可用于从人iPSCs分化获得破骨细胞，并易于在需要大量功能性人破骨细胞的应用中推广。该方法在骨生物学研究、癌症研究、组织工程及内植入假体研究等领域具有广泛的应用前景。
引言
破骨细胞（OC）是一类来源于造血系统的1,2多功能细胞类型，广泛应用于骨病研究3,4、癌症研究5,6、组织工程7,8以及内假体研究9,10等领域。然而，OC的分化过程具有挑战性，因为单核前体细胞融合形成多核破骨细胞是获得功能性OC的必要步骤11。OC分化需要多种生物学因子参与，例如核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。已有研究报道，M-CSF对细胞增殖、细胞存活以及RANK表达具有促进作用12,13,14。另一方面，RANKL与RANK结合后可激活下游信号级联反应，从而诱导破骨细胞....
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方案
注意：本方案中使用的所有试剂均可在材料表中找到。除非另有说明，所有培养基在使用前均预先平衡至 37 °C。所有离心步骤均在 37 °C 下进行，并采用最慢的加速度/减速度模式。除非另有说明，始终使用一次性巴斯德玻璃吸管移除上清液。
1. 人类iPSC的解冻与传代培养
- 在解冻iPSCs的前一天，用1 mL基底膜提取物（浓度为200-300 µg/mL）包被6孔板中的一个孔，并将培养板置于4 °C过夜。
- 次日，使用P1000移液器解冻并转移细胞至15 mL离心管中，逐滴加入5-7 mL含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基。
- 以300 x g离心5分钟。轻柔地从离心机中取出细胞，注意不要扰动细胞沉淀。
- 使用巴斯德玻璃移液器小心吸除上清液，并用P1000加宽口吸头将细胞重悬于1 mL hiPSC无血清培养基（hiPSC-SFM，含10 µM Rho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632）中。
- 吸除前一天包被的孔中的基底膜提取物（步骤1.1），向孔中加入1 mL含10 µM Y-27632的hiPSC-SFM培养基，再将重悬的iPSCs加入孔中，使每孔终体积为2 mL。
- 轻轻摇动培养板以均匀分布iPSC细胞团，随后将培养板置于37 °C、5% CO2
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结果
在整个分化过程中监测细胞形态
以下所述的所有结果均使用 MCND-TENS2 iPSC 细胞系进行视杯（OC）分化实验获得。该iPSC细胞系此前已在多项研究中使用32,33。尽管如此，其他iPSC细胞系也已成功应用于本分化方案。
常规的形态学观察显示，iPSCs在向OCs分化的过程中呈现出不同且明显的形态学特征（图2）。iPSC细胞集落（图2A）被解离为单细胞悬液，在离心前可见细胞均匀分散于圆底孔板中（图2B）。离心后（方案第4.9步），细胞将聚集于圆底超低吸附孔板的中央，并逐渐形成球状结构（类胚体，EBs，图2C）。在中胚层分化过程中，EBs的体积可增大至原来的2至3倍（
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讨论
本方案提供了一种可靠且稳健的方法，用于将iPSCs分化为OCs。然而，在整个分化过程中可能会遇到若干潜在问题。来源于不同组织来源细胞的人iPSC细胞系已成功通过本方案实现分化33。在冻存iPSCs时（见方案步骤"3. 冻存iPSCs"），传代时的一个孔细胞被冻存至一个冻存管中。在解冻时（见方案步骤"1. 人iPSCs的解冻与扩增"），一个冻存管的细胞被接种至6孔板中的单个孔内。不同的iPSC细胞系行为可能略有差异，其增殖速率也会有所不同，因此需要相应调整传代比例。
在传代诱导多能干细胞（iPSCs）或将iPSCs解离为单细胞悬液以进行拟胚体（EB）诱导时，去除自发分化的克隆或死亡细胞的聚集体至关重要，这有助于提高中胚层和造血分化的效率与效果。该操作可在体视显微镜下进行，使用细胞刮刀、P10或P20移液器枪头，或由巴斯德吸管自制的刮取工具完成35。
如上所述，本方案涉及将iPSC集落解离为单细胞悬液以诱.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者感谢Giachelli实验室成员提供的技术支持与帮助。感谢W. M. Keck显微镜中心及该中心负责人Nathanial Peters博士在获取共聚焦显微镜和宽场显微镜图像方面提供的协助。同时感谢华盛顿大学流式细胞分析核心设施（UW Flow Core Facility）及该设施负责人Aurelio Silvestroni在技术方面提供的支持与帮助。最后，感谢Hannah Blümke在插图绘制与平面设计方面的支持。
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R35 HL139602-01。我们同时感谢 NIH S10 资助项目 S10 OD016240 对 W. M. Keck 中心仪器设备的资助，以及 NIH 资助项目 1S10OD024979-01A1 对华盛顿大学流式细胞分选核心设施（UW Flow Core Facility）仪器设备的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| 抗体 - 抗组织蛋白酶K | Abcam | ab19027 | |
| 抗体 - APC标记的抗人CD45 | BD | 555485 | |
| 抗体 - APC标记的小鼠IgG1，κ 同型对照 | BD | 555751 | |
| 抗体 - BV711标记的抗人CD14 | BD | 563372 | |
| 抗体 - BV711标记的小鼠IgG2b，κ 同型对照 | BD | 563125 | |
| 抗体 - 羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| 抗体 - PE标记的抗人CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| 抗体 - PE标记的抗人整合素α M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| 抗体 - PE-Cy7标记的抗人CD34 | BD | 560710 | |
| 抗体 - PE-Cy7标记的小鼠IgG1 κ 同型对照 | BD | 557872 | |
| 抗体 - PE/氰基5标记的抗人CD11b | Biolegend | 301308 | |
| 抗体 - PE/氰基5标记的小鼠IgG1，κ 同型对照 | Biolegend | 400118 | |
| 抗体 - PerCP-Cy5.5标记的小鼠IgG1 κ 同型对照 | BD | 550795 | |
| 抗体 - PerCP-Cy5.5标记的抗人CD43 | BD | 563521 | |
| 骨吸收检测试剂盒 | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 自动细胞计数仪 | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex 干细胞认证低生长因子基底膜提取物 | R&D Systems | 3434-010-02 | 基底膜提取物 |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase（5 U/mL） | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| 含15 mM HEPES的DMEM/F-12 | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| 人骨形态发生蛋白4（hBMP4） | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| 人IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| 人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF） | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| 人可溶性核因子-κB受体激活剂配体（hsRANKL） | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| 人干细胞因子（hSCF） | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| 人TruStain FcX（Fc受体阻断溶液） | Biolegend | 422301 | |
| 人血管内皮生长因子-165（hVEGF165） | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen 罗丹明鬼笔环肽 | Invitrogen | R415 | |
| MEM α，含核苷，无酚红 | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | 无血清冷冻保存培养基 |
| mTeSR Plus 培养基 | STEMCELL Technologies | 100-0276 | 人诱导多能干细胞无血清培养基（hiPSC-SFM） |
| Nunclon Sphera 96孔，Nunclon Sphera处理，U型底微孔板 | Thermo Scientific | 174925 | 圆底超低吸附96孔板 |
| P1000 宽口吸头 | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK抑制剂 Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | 造血细胞培养基 |
| TrypLE Select 酶（1X），无酚红 | Thermo Fisher | 12563011 | 单细胞解离试剂 |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基 | Bioscience Lonza | 04-418Q | 造血基础培养基 |
| µ-Slide 8孔高壁板 | Ibidi | 80806 |
参考文献
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and ....
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