破骨细胞与人诱导多能干细胞的分化和表征

破骨细胞 （OC） 是造血来源^{的 1,2} 多功能细胞类型，通常被研究人员用于骨病研究 ^3,4、癌症研究 ^5,6、组织工程 ^7,8 和内假体研究 ^9,10 等领域.然而，OC 分化可能具有挑战性，因为单核前体融合成多核 OC 对于产生功能性 OC¹¹ 是必要的。一些生物学因素，如NF-κB配体受体激活剂（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），是OC分化所必需的。据报道，M-CSF 对细胞增殖、细胞存活和 RANK 表达有积极影响 12,13,14。另一方面，RANKL 与 RANK 结合，后者激活诱导破骨细胞生成的下游信号级联反应。激活通过 TNF 受体相关因子 6 （TRAF6） 介导，这导致 B 细胞抑制剂 α （IκB-α） 中 κ 轻多肽基因增强子的核因子降解，α 是一种结合 NF-kB 二聚体的结合蛋白^16,17。因此，IκB-α降解释放NF-kB二聚体，然后转位到细胞核中并诱导转录因子c-Fos和活化T细胞核因子1（NFATc1）的表达。这反过来又触发了大量 OC 分化相关蛋白^{的转录 15,18}。上调蛋白（如 DC-Stamp 和 Atp6v0d2）介导 OC 前体的细胞间融合，导致合胞体形成 19,20,21。

就人原代细胞而言，CD34⁺ 和 CD14⁺ PBMC 是目前用于分化为 OCs²² 的最广泛使用的细胞类型。然而，这种方法受到来自供体²³ 的收获细胞 CD34⁺ 群体内的异质性及其有限的扩增性的限制。人 iPSC 是 OC 的替代来源。由于它们可以无限繁殖²⁴，因此它们允许 OC 生产的可扩展性和升级。这允许区分大量的OC，从而促进OC研究。

已经发表了几种将 iPSC 分化为 OC 的方案 25,26,27。整个分化过程可分为iPSC增殖部分、中胚层和造血分化部分以及OC分化。在分化过程之前繁殖 iPSC 允许在分化之前扩大 OC 产量。关于中胚层和造血分化存在几种方法。传统上，胚状体 （EB） 形成已被用于分化造血细胞，但基于单层的方法代表了另一种不需要 EB 诱导的造血分化策略。然而，基于单层的系统似乎需要进一步优化，因为我们和其他人发现基于EB的方法对于OC的区分更可靠。

在这里，我们描述了使用基于EB的方案将OC与人iPSCs区分开来。该方案改编自Rössler等人²⁶ ，并进行了修改以提高稳健性并允许在分化过程中进行冷冻保存。首先，我们在分化 10 天后仅收获一次造血细胞。然后对造血细胞进行冷冻保存，以便在分化过程中具有更大的灵活性。此外，我们将造血细胞接种密度从 1 x 10⁵ 增加到 2 x 10⁵ 个细胞/cm² 用于 OC 分化。使用较新的人 iPSC 无血清培养基（hiPSC-SFM，见 材料表），并用 200-300 μg/mL 的基础膜提取物（见 材料表）代替 0.1% 明胶进行孔包被。青霉素/链霉素未添加到培养基中。

Rössler等人²⁶的方案最初从iPSC改编为巨噬细胞分化方案²⁸，该方案使用EB形成进行造血分化。虽然研究人员已经将 EB 的形成用于造血分化很长一段时间^29,30，但文献中已经描述了几种 EB 诱导方法，例如自发聚集、圆底孔板离心、悬滴培养、生物反应器培养、锥形管培养、慢转侧血管和微模凝胶培养³¹.该方案使用在圆底孔板中离心解离的iPSC，使单个iPSC细胞彼此靠近并允许球体（EB）形成，如下所述。

注意:本协议中使用的所有试剂都可以在 材料表中找到。除非另有说明，否则所有介质在使用前都预平衡至37°C。所有离心步骤均在37°C下进行，并使用最慢的加速/减速模式。除非另有说明，否则上清液始终使用一次性巴斯德玻璃移液器去除。

1. 人iPSCs的解冻和繁殖

1. 在解冻 iPSC 前一天，用浓度为 200-300 μg/mL 的 1 mL 基础膜提取物包覆 6 孔板的孔。将孔板置于4°C过夜。
2. 第二天，解冻并使用 P1000 移液器将细胞转移到 15 mL 管中。滴加 5-7 mL DMEM/F-12 和 15 mM HEPES。
3. 将细胞以300 ×g 离心5分钟。轻轻地从离心机中取出细胞，并确保不要干扰细胞沉淀。
4. 用巴斯德玻璃移液管小心地除去上清液，并使用宽口径吸头的P1000将细胞重悬于1mL hiPSC-血清游离培养基（含有10μMRho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632的hiPSC-SFM）中。
5. 从前一天包被的孔中抽吸基底膜提取物（步骤1.1），并将1mL hiPSC-SFM和10μM Y-27632转移到孔中。向孔中加入重悬的 iPSC，以达到每孔 2 mL 的最终体积。
6. 旋转板以均匀分布iPSC聚集体，然后放入37°C和5%CO₂的培养箱中。
7. 使用hiPSC-SFM（不添加ROCK抑制剂Y-27632）每隔一天进行一次完全培养基更换。iPSCs通常在繁殖3-4天后达到70-80%的汇合度。

2. 传代iPSCs

1. 在传代 iPSC 前一天，用浓度为 200-300 μg/mL 的基础膜提取物包被 6 孔板的孔。将孔板置于4°C过夜。
   注意:确认细胞已达到大约 70-80% 的汇合度。确保 iPSC 不会过度融合（融合度超过 80%），因为这将促进自发分化。
2. 通过使用10μL或20μL移液器吸头或细胞刮刀在体视显微镜下去除分化区域或具有许多死亡iPSC聚集体的区域来开始传代iPSC。分化区域的颜色会显得更密集或更白。
   注意:刮掉的细胞聚集体可能仍部分附着在井底。
3. 用宽口径 P1000 移液管清洗井底数次，以去除可能仍部分附着在井底的任何聚集体。
4. 弃去培养含有分离的iPSC聚集体的培养基。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）再重复洗涤步骤两次。
5. 接下来，每孔加入 1 mL 5 U/mL 分散酶。iPSC菌落的边缘将从孔板上脱落，在室温下孵育3-5分钟后，可以在体视显微镜下观察到。
6. 小心地去除分散酶以避免轻微分离的聚集体脱落，并加入 1 mL DMEM/F-12 和 15 mM HEPES。使用一次性细胞升降机将聚集体切成小尺寸。使用干细胞传代工具可以提高iPSC聚集体大小的一致性。
7. 用孔中的培养基洗掉切片的iPSC聚集体，并使用5 mL血清移液管或具有宽孔吸头的P1000将培养基与聚集体转移至15 mL锥形管中。
8. 用 DMEM/F-12 冲洗孔，并将培养基转移到装有 iPSC 聚集体的 15 mL 管中。
9. 将切片的iPSC聚集体以200 ×g 离心3分钟。用巴斯德玻璃移液管取出上清液，加入 2 mL hiPSC-SFM 以去除并使用 5 mL 血清移液管或具有宽口径吸头的 P1000 重悬 iPSC。
10. 从预包被孔板中抽出剩余的基底膜提取物，并向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL hiPSC-SFM。
11. 使用具有宽孔尖端的 P1000 将 iPSC 转移到 6 孔板的新孔中，使最终体积为每孔 2 mL hiPSC-SFM。根据iPSC细胞系的不同，需要优化分流比。在这里，使用了 1:6 的分流比。
12. 在立体显微镜下检查孔中的浮动骨料和骨料尺寸。理想情况下，聚集体尺寸应在 50-200 μm 之间。
13. 在聚集体转移后，旋转孔板以使细胞均匀分布在板上，并在37°C下以5%CO₂ 孵育至70-80%汇合。

3. 冷冻 iPSC

1. 要冷冻iPSC细胞，如上所述传代细胞（参见方案步骤"2.iPSCs的传代"）。将细胞切成菌落并洗掉孔底（步骤2.10）后，将切片的聚集体以200 ×g 旋转3分钟。吸出上清液。
2. 向 15 mL 试管中加入 1 mL 无血清冷冻保存培养基，并使用具有宽孔尖端的 P1000 重悬切片聚集体。
3. 将细胞转移到预先标记的冷冻管中。关闭试管并将试管转移到4°C的预冷冻存容器中。 将细胞储存在-80°C下24-48小时。
4. 将冷冻管转移到液氮中进行长期储存。
   注:OC分化过程的示意图如 图1所示。

4. 胚状体诱导

1. 如上所述培养和扩增足够的 iPSC 用于 EB 诱导。
   注意:可以通过增加胚状体的数量来扩大OC的产量，这反过来又会产生更高的造血细胞产量。一个 70-80% 汇合 iPSC 的孔在 6 孔板孔中每孔产生约 8.4 x 10⁵ 个细胞。需要 12,500 个单细胞 iPSC 才能形成一个胚状体。
2. 从 iPSC 培养物中抽吸用过的培养基，并用 D-PBS 冲洗 iPSC 菌落。
3. 向 6 孔板的每个孔中加入 0.5 mL 预热至室温的单细胞解离试剂，并旋转培养容器以覆盖整个孔表面。将培养容器在37°C孵育5-8分钟。
4. 从培养箱中取出容器，吸出单细胞解离试剂，并向孔中加入 1 mL 阶段 1 分化培养基，该培养基由含有 50 ng/mL 人骨形态发生蛋白 4 （hBMP4）、50 ng/mL 人血管内皮生长因子-165 （hVEGF）、20 ng/mL 人干细胞因子 （hSCF） 的 hiPSC-血清游离培养基组成， 和 10 μM Y-27632。
5. 用 Stage 1 培养基冲洗孔，轻轻分离细胞。将解离的 iPSC 汇集到 15 mL 锥形管中。
6. 向孔中加入 1 mL 第 1 阶段分化培养基，洗掉任何剩余的细胞，或对不易洗掉的菌落使用细胞刮刀。
7. 将所有细胞转移到试管中后，在室温下以200 ×g 离心5分钟以形成细胞沉淀。使用 5 mL 血清移液管或具有宽孔吸头的 P1000 将细胞吸入并重悬于总共 2 mL 预平衡的 1 阶段分化培养基中。
8. 使用血细胞计数器或自动细胞计数装置对细胞进行计数。将培养基加入含有单细胞悬浮液的 15 mL 试管中，在 100 μL 阶段 1 分化培养基中的圆底超低附着 96 孔板中每孔板 12,500 个细胞。
   注意:在显微镜下，细胞将显示为单细胞悬浮液，细胞分散在整个孔中。
9. 将96孔板以100 ×g离心3分钟。离心后，在显微镜下观察时，细胞应开始类似于球状体。将板置于37°C培养箱中24小时。
10. 在第 1 天和第 2 天用第 1 阶段分化培养基更换一半的培养基。为了提高效率，使用多通道移液器将 50 μL 用过的第 1 阶段分化培养基置入培养皿中。
11. 从96孔板中取出培养基后，在体视显微镜下检查可能被意外取出的EB。使用带有宽口径吸头的 P1000 移液器将意外移除的 EB 转移到 96 孔板中。
12. 使用多通道移液器向圆底超低附着 96 孔板的每个孔中加入 50 μL 新鲜的 Stage 1 分化培养基。

5. 造血分化

1. 在开始造血分化前一天，用浓度为 200-300 μg/mL 的 1 mL 基底膜提取物包覆 6 孔板的孔。将孔板置于4°C过夜。
   注意:在本协议的稍后时间点，每口井将接收 8 个 EB。根据制备的EB数量，相应地涂覆孔。
2. 用 3 mL 阶段 2 分化培养基吸出 6 孔板的过量基底膜提取物和预填充孔，该培养基由造血基础培养基组成，其中加入 2 mM 超谷氨酰胺、55 μM 2-巯基乙醇、25 ng/mL 人白细胞介素 3 （hIL-3） 和 100 ng/mL 人巨噬细胞集落刺激因子 （hM-CSF）。
3. 使用具有宽孔尖端的 P1000，将 8 个 EB 转移到 6 孔板的每个孔中。转移后，通过肉眼或在体视显微镜下确认每个孔中有 8 个 EB。
   注意:1 天后，浮动 EB 将粘附在井底。在接下来的 5-7 天内，包含造血细胞的漂浮细胞群应该变得可见。造血分化期可以变化，从 7 天开始。10 天的分化显示造血群体由大的 CD45⁺、CD14⁺ 和 CD11b⁺ 亚群组成。
4. 用第 2 阶段分化培养基处理 5 天后，通过取出用过的培养基并将其分配到 50 mL 锥形管中来进行培养基更换。缓慢移液以尝试去除尽可能少的浮动细胞，并保持尽可能低的剪切应力。在体视显微镜下移液有助于避免意外去除细胞。
5. 立即向孔中加入 1 mL 新鲜的 Stage 2 分化培养基。为了恢复在分化过程中此时可能已经存在的任何漂浮造血细胞，请勿丢弃分配的培养基。相反，用用过的培养基以300 ×g 旋转管5分钟，然后吸出上清液。
6. 将新鲜的第 2 阶段分化培养基添加到试管中并重悬，以分离可能已与用过的培养基转移的细胞。
7. 将 2 mL 新鲜的 Stage 2 分化培养基和回收的细胞加入到每个孔中，该孔先前填充了 1 mL Stage 2 分化培养基。
8. 在造血分化的第 10 天，检查是否存在大量漂浮的造血细胞。通过将它们收集在 50 mL 管中收获。它们可以在 10% DMSO、50% FBS 和 40% 培养基中冷冻，也可以立即用于将细胞分化为 OC。

6. M-CSF成熟和OC分化

1. 将浓度为 200,000 个细胞/cm² 的细胞接种到组织培养物处理的孔板上，并用补充有 10% FBS 和 50 ng/mL hM-CSF 的 α-MEM 处理。
2. 为了进行功能测定或成像，在接种后3天，使用具有宽孔尖端的P1000用预热的PBS洗涤至37°C，分离M-CSF成熟细胞。可能需要重复洗涤步骤才能完全分离细胞。
3. 使用具有宽孔尖端的P1000将分离的细胞转移到15mL管中，并以300 ×g 离心5分钟。弃去上清液。
4. 用OC分化培养基重悬并溶解细胞沉淀，该培养基由补充有10%FBS，50ng / mL hM-CSF和80ng / mLhRANKL的α-MEM组成。使用血细胞计数器或自动细胞计数装置对细胞进行计数，并以 200,00-250,000 个细胞/cm² 的密度将 M-CSF 成熟细胞重新接种在适当的培养皿中用于功能测定或成像（即骨吸收测定、用于成像的盖玻片载玻片等）。
5. 用OC分化培养基分化7-9天。每 2-3 天用新鲜的 OC 分化培养基进行一次完整的孔培养基更换。
   注意:多核 OC 通常在 5-7 天后出现。

在整个分化过程中监测细胞形态
下面描述的所有结果均使用 MCND-TENS2 iPSC 系进行 OC 分化生成。该 iPSC 系之前已用于多项研究32,33。尽管如此，其他iPSC细胞系也已成功用于该分化方案。

定期的视觉评估揭示了iPSCs在整个分化过程中与OCs的不同和不同的形态学特征（图2）。将iPSC菌落（图2A）解离成单细胞悬浮液，在离心前在整个圆底孔板中显示为单个细胞（图2B）。离心后（方案中的步骤4.9），细胞将聚集在圆底超低附着孔板的中心，随后形成球体（胚状体，EB， 图2C）。在整个中胚层分化过程中，EB的大小将增加两到三倍（图2D），并在4天分化期结束时变得容易肉眼可见（图2E）。在将 6 孔板转移到孔中以进行造血分化后，可以看到 EB 粘附并与孔板底部融合（方案中的步骤 5.3， 图 2F）。7-8天后，大量漂浮的造血细胞在培养基中可见（图2G）。在收获并重新铺板造血细胞后，随后进入 M-CSF 成熟阶段，并开始 OC 分化（方案中的步骤 6.4）。在5-6天内，具有大透明细胞体的多核细胞首先变得可见（图2H）。在这个阶段仍然可以看到大量的单核细胞。在 OC 分化 2-3 天后，OC 将进一步与相邻细胞融合，形成具有更多细胞核的大型多晶体（图 2I）。

评估EB来源的造血人群
造血分化可以在不同的时间长度内进行。文献中描述了从 7 天到 9 周的时间段。在该方案中，进行造血分化为期10天。我们发现，10天的造血分化产生早期CD34+ （0.53%， 图3A）数量较少，中期CD43+ （48.5%， 图3B）造血祖细胞数量较多。更关键的是，在10天的处理期后，产生了足够数量的CD45+ （96.2%， 图3C），CD14+ （33%， 图3D）和CD11b+ （35.9%， 图3E）HPC，以成功地将它们进一步分化为OC。然而，造血分化的细胞因子治疗期（方案中的步骤 5.4）可能需要根据 iPSC 系进行调整和优化，以产生足够量的 CD45+、CD14+ 和 CD11b+ 细胞。

平均而言，在分化 10 天后，从每个孔中收获 600 万个造血细胞，其中有 8 个 EB。

评估 OC 形态和活性
OC分化后，可以从形态和功能上评估OC。在M-CSF成熟步骤之后，将OC前体重新接种到腔室载玻片或盖玻片上，以提高TRAP或组织蛋白酶K染色时的图像质量。此外，可以看到在多核 OC 之间散布着轻微的 TRAP 阳性单核细胞。未添加 RANKL 的阴性对照不显示融合多核 OC。然而，可以描绘少量略呈TRAP阳性的单核细胞（图4B）。

共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 图像显示组织蛋白酶 K（绿松石）和 F-肌动蛋白（红色）染色的 OC 与 DAPI 核染色（蓝色）（图 4C、4D）。当根据方案用RANKL处理时，可以看到大的多核OC，该方案描绘了广泛的F-肌动蛋白细胞骨架结构和组织蛋白酶K染色阳性（图4C）。另一方面，未添加 RANKL 的阴性对照不显示融合的多核细胞。

通过测量吸收活性，可以在功能上进一步评估 OC。骨或矿物质吸收测定可用于确定吸收活性。在这里，OC前体被接种到磷酸钙包被的孔中并最终分化。矿物涂层被重吸收的大面积区域以蓝灰色可见（图4E）。可以识别不同大小的吸附坑。未被吸收，剩余的磷酸钙涂层呈棕色可见。再吸收凹坑的存在证实了分化的多核细胞作为OC的身份。此外，可以进一步量化吸收坑，以评估和比较吸收活性。重吸矿物占总井表面积的总面积可以量化为百分比度量。此外，可以进一步量化吸收坑的大小和数量。未经处理的阴性对照未显示再吸收凹坑（图4F）。

图 1:破骨细胞与人 iPSC 分化过程的示意图。 插图由 Hannah Blümke 使用 Affinity Designer 2.1.1 绘制。该图使用了以前使用的附图33。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:人类 iPSC 向破骨细胞分化的整个过程中的显微镜图像。 （A） 整个繁殖过程中未分化的 iPSC 菌落。（B） 在离心前解离成单细胞悬浮液后在圆底孔中的 iPSC。（C） 离心后集中收集的单细胞 iPSC。（D） EB 在整个 4 天的中胚层分化期间大小增加。（E） 中胚层分化后可见的胚状体。（F） 在将胚状体转移到基底膜提取物包被的 6 孔板上后，可以看到胚状体粘附并与孔底融合。（G）造血分化5-7天后，培养基中可观察到大量漂浮造血细胞。（H） M-CSF 成熟后，在用 RANKL 分化 5-7 天后出现第一个具有 3-4 个细胞核的破骨细胞。（I）在破骨细胞分化结束时，可以观察到大的多核细胞。比例尺:A、D、F、G = 200 μm、B、C、H、I = 50 μm、E = 1 mm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:使用流式细胞术对胚状体来源的造血细胞进行表面标志物分析。 标记物表达允许分析造血细胞，并在对单体细胞和活细胞进行门控后鉴定亚群。（A）个体发育的早期CD34 + 造血祖细胞群非常少，与本方案一起不存在。（B） CD43+ 细胞约占整个群体的 50%。（C）晚期CD45+ 造血祖细胞占造血细胞群的最大部分，占96.2%。（D、E）更直接的 CD14+ 和 CD11b+ OC 前体分别占 33% 和 36%。红色:未染色的阴性对照，蓝色:同型对照，黄色:用相应标记抗体染色的细胞。绘图使用以前发布的数据33. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:iPSC 分化人破骨细胞的形态学和功能评估。 （A） 破骨细胞分化后的 TRAP 染色显示大的、多核的、TRAP 阳性的破骨细胞。可以看到略微 TRAP 阳性的单核细胞散布在多核破骨细胞之间。（B） 未添加 RANKL 染色的 TRAP 阴性对照不显示融合的多核破骨细胞。然而，可以描绘出少量轻微的TRAP阳性单核细胞。（C） 破骨细胞分化造血细胞在盖玻片上用 F-肌动蛋白（红色）和组织蛋白酶 K（绿松石）染色并结合 DAPI 核染色（蓝色）的破骨细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像显示大的多核组织蛋白酶 K 阳性破骨细胞。（D） 未添加 RANKL 的阴性对照与 （B） 细胞密度较低的单核细胞相似。（E） 功能评估可以通过评估破骨细胞的吸收活性来进行。为此，破骨细胞分化在骨或矿物质吸收测定中进行。在相差模式下用倒置宽视场显微镜获取的平铺井图像描绘了磷酸钙矿物层的大面积吸收区域。通过测量总面积的吸收面积，可以进一步量化吸收活性。（F） 未添加 RANKL 的阴性对照不显示吸收区域。比例尺:A、B = 100 μm、C、D = 50 μm、E、F = 1 mm。图像已根据先前发布的数据进行编辑 33. 请点击这里查看此图的较大版本.

作者声明没有竞争利益。