绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

摘要

本文介绍了一种利用化学探针和质谱技术从原代细胞和组织中捕获并鉴定疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用的实验方案。通过专用的基于网络的分析平台对获得的相互作用数据集进行分析，以揭示与疾病相关的动态网络功能障碍及通路改变。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络在疾病过程中会动态重塑，然而大多数系统生物学方法集中于蛋白质丰度的变化，忽略了在相互作用层面上的关键功能障碍。本文介绍一种稳健的化学蛋白质组学方法——功能障碍蛋白质-蛋白质互作组（dfPPI），该方法可在细胞和原代人组织中实现高通量、系统性、疾病背景相关的PPI网络功能障碍的全面绘制。该方法结合了可选择性捕获基于表伴侣体（epichaperome）互作组复合物的化学生物学探针、无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）以及基于网络的计算分析，揭示仅从转录组或蛋白质组数据中无法察觉的蛋白质网络重构现象。dfPPI平台可广泛应用于不同疾病状态、物种和组织，用于识别可干预的功能障碍节点，并提供高分辨率、系统层面的疾病进展机制见解。在本实验方案中，我们逐步展示了样本制备、化学探针处理、亲和富集、无标记LC-MS/MS分析以及用于生成和解析dfPPI数据集的生物信息学工作流程。本文旨在促进该方法的可重复性和可及性，支持其在更广泛的系统生物学和转化研究领域中的推广应用。

引言

细胞的功能以及生物体的功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的精确协调^1,2。这些网络负责组织和执行几乎所有的生物学过程。尽管PPI网络本质上具有动态性并能响应应激刺激，但在疾病状态下，它们可能发生异常重连，导致适应不良的功能。重要的是，这种重连并不一定涉及基因或蛋白质表达水平的改变；相反，它源于原本正常表达的蛋白质之间物理相互作用的改变^3,4,5。系统生物学中的传统方法，如转录组学或蛋白质组学，无法捕捉到这些关键的相互作用层面的变化。

蛋白质相互作用（PPI）图谱技术已取得显著进展，为揭示细胞网络的组织结构与调控机制提供了重要见解^{6,7,8,9,10,11}。常用的技术方法包括亲和纯化-质谱法（AP-MS）、交联-质谱法（XL-MS）、邻近标记以及共分级分离技术，每种方法均具有特定优势，例如高特异性、空间分辨率，或检测瞬时复合物的能力^6,8,9,10,11。然而，这些方法通常需要诱饵蛋白、基因操作或复杂的生物信息学分析，且在捕捉天然生物系统中由疾病驱动的大规模蛋白质网络重连方面存在困难^{6,7,8,9,10,11}。大多数方法还缺乏可扩展性，难以适用于大规模样本队列的分析，或在不同条件、细胞类型或时间点之间系统性地绘制相互作用组的变化^{6,7,8,9,10,11}（表1）。

为弥补这一空白，我们开发了功能失调蛋白质-蛋白质相互作用组（dysfunctional Protein-Protein Interactome, dfPPI）平台，这是一种化学蛋白质组学方法，可直接鉴定导致疾病表型的蛋白质相互作用网络功能障碍¹²。该方法基于一个关键的生物学认知：在疾病状态下，一部分分子伴侣会形成称为“表伴侣体”（epichaperomes）的超分子支架结构^13,14,15。这些结构并不参与蛋白质折叠，而是作为支架式相互作用枢纽，重新组织蛋白质之间的连接关系³。关键的是，被招募进入表伴侣体的蛋白质并非随机选择，而是直接参与维持疾病表型的蛋白质^{16,17,18,19,20}。通过捕获这些与表伴侣体结合的蛋白质及其相互作用伙伴，dfPPI 能够识别驱动特定疾病状态的确切网络改变。由表伴侣体介导的网络重连在多种疾病中普遍存在——在阿尔茨海默病队列中占大多数，在癌症样本中约占70%^16,20，这支持了 dfPPI 在大规模、以疾病为中心的研究中的广泛应用前景。

dfPPI 平台涵盖了从样本制备、表伴侣体亲和捕获、质谱鉴定相互作用组到下游生物信息学分析（如通路富集分析和功能蛋白网络建模）的完整工作流程（图1）。该方法利用固定在亲和基质上的表伴侣体特异性化学探针（PU-珠粒或其他探针）^13,16,17，从细胞或组织中分离功能性相互作用组。这些探针已在多项研究中被严格验证，证实其对表伴侣体具有特异性，并适用于 dfPPI 分析^{16,17,18,20,21,22}。捕获的复合物通过珠上消化和凝胶内消化两种流程进行质谱分析，并采用无标记 LC-MS/MS 技术。所得数据可通过专用的生物信息学流程进行分析，以定义相互作用层面的功能障碍，并将其与生物学过程和表型相关联。由于表伴侣体可作为特定背景下相互作用组的支架结构^17,18,20，dfPPI 能够揭示蛋白质网络在特定疾病、细胞类型或发育阶段中的重构方式，因而成为一种强大的系统生物学工具，可用于精确表型分析。

该方法具有高度可扩展性，已应用于数百个临床和实验样本，包括癌症和神经退行性疾病等多种疾病的人类尸检组织和培养细胞^{16,17,18,19,20,22,23}。通过揭示定义病理状态的蛋白质相互作用（PPI）变化，dfPPI 能够提供机制性见解，并有助于发现可干预的治疗靶点^{16,17,18,19,20,22,23}。

在本实验方案中，我们详细描述了dfPPI平台的实验组成部分，从亲和捕获与表伴侣体结合的相互作用组，到用于LC-MS/MS分析的样品制备，再到通过质谱（MS）进行相互作用组的鉴定。由于篇幅限制，本文未涵盖计算分析流程，即如何利用质谱鉴定出的蛋白质列表来定义差异性相互作用及其功能影响。然而，该分析流程可通过dfPPI Shiny应用程序（https://epichaperomics.mskcc.org，已更新为https://dfppi.mskcc.org）以及Chiosis实验室网站（https://www.chiosislab.com/resources）免费获取，并有详尽文档说明。除上述资源门户外，完整的生物信息学分析流程及配套脚本还包含在多项将dfPPI应用于癌症^16,17,19和阿尔茨海默病^18,20的研究出版物中。

方案

本方案遵循本机构人体研究伦理委员会和动物护理与使用委员会的指导原则。研究中使用的仪器和试剂列于材料表中。

1. 亲和捕获的样品制备

1. 从组织中提取蛋白质
   注意：本方案已针对死后脑组织样本进行了优化。
   1. 配制含有 20 mM Tris（pH 7.5）、20 mM KCl、5 mM MgCl₂ 和 0.01% NP-40 的蛋白质提取缓冲液（天然裂解缓冲液）。使用前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。将缓冲液置于冰上保存。
   2. 将冷冻组织（目标体积约为 50 mm³）放入微型组织匀浆管中，该匀浆管由配有研杵的特制 1.5 mL 微量离心管组成。加入 500–700 µL 天然裂解缓冲液，根据组织致密程度和匀浆难易程度调整体积。在冰上通过轻轻上下移动研杵并沿匀浆管粗糙内壁摩擦，直至形成均匀悬浮液，完成样品匀浆。
      注意：所有步骤均需在冰上操作，以维持蛋白质复合物的天然构象，并防止蛋白质降解。
   3. 将裂解物置于旋转仪上，在 4 °C 下孵育 30 分钟。孵育期间通过缓慢旋转轻柔混匀样品。
   4. 使用台式离心机在 4 °C 下以 13,000 ×g 离心 10 分钟，去除碎片。
   5. 收集上清液并转移至透明的 1.5 mL 微量离心管中。转移过程中避免扰动沉淀。
   6. 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）检测试剂盒测定上清液中的总蛋白浓度。
      注意：蛋白裂解物可储存于 -80 °C 直至使用。避免反复冻融。有关反复冻融及储存温度对蛋白质复合物完整性的影响，请参阅先前发表的研究²⁴。
2. 样品归一化
   注意：HSP90α 和 HSP90β 是表伴侣体（epichaperome）的核心组分，也是用于相互作用组捕获的化学探针的直接结合伴侣^13,21,23。基于 HSP90α（或 HSP90β）对样品进行归一化，可确保各样品中探针可靶向的表伴侣体量一致，这对于准确比较捕获的相互作用组至关重要。可通过 Western blot 检测 HSP90 水平来实现样品归一化，但也可采用其他方法。若各样品中 HSP90 水平相近，可跳过本节，直接进入步骤 1.3。此处 HSP90α/β 的 Western blot 仅用于上样量归一化，不应将其解释为表伴侣体丰度的衡量指标。
   1. 配制 2× Laemmli 上样缓冲液，包含 4% 十二烷基硫酸钠（SDS）、20% 甘油、10% 2-巯基乙醇、0.02% 溴酚蓝和 0.125 M Tris-HCl（pH ~6.8）。
      警告：2-巯基乙醇具有毒性和挥发性，应在通风橱中操作。
   2. 在 1.5 mL 透明微量离心管中，将 5 µg 总脑蛋白提取物（来自步骤 1.1）与 2× Laemmli 上样缓冲液按 1:1（v/v）混合。
   3. 将样品在加热设备中 95 °C 加热 3–5 分钟，使蛋白质变性，随后上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
   4. 将样品上样至预制的 8% Tris-甘氨酸蛋白凝胶。也可使用手工灌制的凝胶。
   5. 每块凝胶上样 5 µL 预染蛋白标准品（例如，加至第一孔），用于确定蛋白质分子量。
   6. 在室温下使用 1× TGS（Tris-甘氨酸-SDS）电泳缓冲液进行电泳。通常在 100 V 条件下运行 1.5–2 小时。
   7. 配制转膜缓冲液，包含 25 mM Tris、192 mM 甘氨酸和 20% 甲醇。
      警告：甲醇易燃，应按照安全指南操作。
   8. 在 4 °C 条件下，以恒定电压（100 V）在转膜缓冲液中将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，持续 60 分钟。
   9. 配制膜洗涤液（1× TBS-0.1% Tween-20）和封闭液（5% 脱脂奶粉溶于 1× TBS-0.1% Tween-20）。本方案使用市售的脱脂奶粉粉末。
   10. 将膜置于封闭液中，在室温下轻轻振荡封闭 1 小时。每块小型凝胶使用 10 mL 封闭液。
   11. 弃去封闭液，加入抗 HSP90α 抗体（1:6,000 稀释于 10 mL 封闭液中），在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜。
   12. 弃去一抗溶液，用 10 mL 洗涤液每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。
   13. 加入 HRP 标记的山羊抗兔二抗（1:5,000 稀释于 10 mL 1× TBS-0.1% Tween-20 中），在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
   14. 弃去二抗，用洗涤液按上述相同体积和时间洗涤四次。
   15. 根据制造商说明书，使用增强型化学发光（ECL）试剂盒检测 HSP90α 特异性化学发光信号。可使用化学发光成像系统或放射自显影胶片。
   16. 基于信号强度定量各样品中的 HSP90α 水平，并计算下游 pull-down 实验的归一化因子。
       ​注意：HSP90 信号强度反映了各样品中探针可靶向的表伴侣体量。通过比较各样品间的信号强度，并以每块凝胶上均运行的参考样品为基准进行归一化，可相应调整相互作用组捕获的上样体积。可使用密度分析软件进行定量。每次 Western blot 均应在每块凝胶上包含一份参考样品，以便实现不同印迹间的归一化。
3. PU-bead 制备
   注意：PU-bead 和对照 beads 可按先前报道的方法在实验室内部合成^21,25，或在签署材料转移协议（MTA）后向 Chiosis 实验室申请获取。应将其储存于 -20 °C 的异丙醇中。
   1. 直接从异丙醇储存液中取出适量聚氨酯（PU）beads 或对照 beads。为补偿洗涤和操作过程中的 bead 损失，建议多取约 30% 的量。
   2. 去除储存溶剂：让 beads 沉降后，吸除异丙醇。加入天然裂解缓冲液（1.5 mL 管加 1 mL；15 mL 锥形管加 5 mL），通过轻柔吹打或颠倒混匀，使 beads 完全重悬。
   3. 洗涤并平衡三次：每次洗涤时涡旋重悬，离心（1.5 mL 管：10,000 × g，1 分钟；15 mL 锥形管：3,000 × g，5 分钟），然后用连接真空管线的移液枪头小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
   4. 向洗涤后的 beads 中加入天然裂解缓冲液，按 1:1 体积比（beads:缓冲液）配制成均匀的工作用 bead 悬液。
   5. 将 40 µL PU-bead（或对照 bead）悬液（例如，1:1 v/v beads:缓冲液）分装至各 1.5 mL 微量离心管中，每管一份样品。使用剪去尖端的移液枪头，以便于 bead 的顺利分配。
      注意：PU-bead 对光敏感。在 pull-down 步骤中应使用避光管或铝箔包裹的 1.5 mL 管。由于其表面涂有小分子表伴侣体结合剂，具有疏水性，PU-bead 易发生聚集并粘附于塑料表面。操作时应轻柔吹打并充分混匀，以确保均匀重悬。必须向每个样品中加入等体积的 bead 悬液，以避免蛋白质捕获的差异，否则可能导致结果不一致或不可重复。
   6. 用天然裂解缓冲液洗涤 beads 三次：每次向各管中加入 1 mL 缓冲液，涡旋混匀，在 10,000 × g 下离心 1 分钟，然后通过抽吸弃去上清液。每次洗涤之间确保 beads 完全重悬。
      注意：抽吸时避免接触 beads。移除液体时，将移液枪头轻轻抵住管壁。
   7. 最后一次洗涤后，小心吸除大部分液体，注意不要扰动 bead 沉淀。
      注意：洗涤后的 beads 可在 4 °C 下储存数天。通常在制备后 1–2 天内使用。
4. 相互作用组 pull-down
   注意：pull-down 的第一步是使用对照 beads 进行预清除，这些 beads 与一种不结合表伴侣体的惰性小分子偶联¹⁶。此步骤可从裂解物中去除非特异性结合蛋白、聚集体和不溶性碎片，从而提高后续 PU-bead pull-down 的特异性。预清除可降低背景结合，增强对表伴侣体相关蛋白的检测。
   ​本方案回收的相互作用组通过质谱（MS）进行分析，而 MS 对实验污染物极为敏感。为确保准确的蛋白质鉴定并保持数据质量，应始终使用新鲜配制的缓冲液和试剂，尽量减少灰尘和角蛋白的污染，在处理样品、耗材或设备时佩戴洁净无粉手套。所有 pull-down 和胶内消化步骤应使用专用于 MS 的玻璃器皿/耗材，并将用于 Western blotting 的物品物理隔离。若重复使用玻璃器皿，应依次用 100% 甲醇、超纯水、80% 乙酸、超纯水冲洗去污，然后风干。切勿使用洗涤剂；即使微量残留也可能污染液相色谱柱和离子源。
   1. 将归一化后的蛋白提取物（根据步骤 1.2 中 HSP90 Western blot 信号强度计算所得）加入含有 40 µL 对照 beads 悬液（即 20 µL beads + 20 µL 缓冲液）的各个 1.5 mL 微量离心管中，并加入适量天然裂解缓冲液，将最终体积调至 250 µL。
      注意：为确定各样品的上样体积，使用公式 A1 = (60 / C1) × X1，其中 A1 为需加入的归一化总蛋白体积（µL），C1 为测得的蛋白浓度（µg/µL），X1 为根据 HSP90 Western blot 得出的归一化因子（见步骤 1.2）。需添加的额外缓冲液体积为 250 µL 减去 A1。若无需归一化，则在 250 µL 体积中使用 250 µg 总蛋白。
   2. 在 4 °C 下，以 10–15 rpm 的速度在翻转旋转仪上孵育 30 分钟。
   3. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 1 分钟，使对照 beads 及其结合的聚集或不溶性蛋白沉淀。
   4. 使用 1 mL 移液器小心收集对照 beads 的上清液，并转移至含有 40 µL 洗涤后 PU-beads 悬液的 1.5 mL 管中。
   5. 在 4 °C 下，以 10–15 rpm 的速度在翻转旋转仪上孵育 3 小时。
   6. 每管在 10,000 × g 下离心 1 分钟，吸除上清液后，用 1 mL 天然裂解缓冲液洗涤 beads 四次。每次洗涤均按步骤 1.3 所述参数进行：涡旋、离心、抽吸。
      注意：此时样品可通过以下两种工作流程之一进行 LC-MS/MS 分析：(1) SDS-PAGE 后进行胶内消化，或 (2) 对捕获的蛋白质进行 bead 上直接消化。
      如采用胶内消化工作流程，请继续按本方案操作。如采用 bead 上直接消化，则需再用冷 PBS 洗涤 beads 两次，并立即进入第 3 节。若进行 bead 上直接消化，则不得冷冻 beads；样品必须在同一天新鲜处理。冷冻 bead 结合的蛋白复合物可能因促进聚集或降低蛋白溶解度而影响消化效率，导致肽段回收率降低和变异性增加。根据质谱核心实验室建议，为确保 bead 上消化的一致性，样品应在同一天新鲜处理。
5. 胶内消化的样品制备
   1. 向步骤 1.4.6 制备的 bead 样品（置于 1.5 mL 微量离心管中）加入 25 µL 2× Laemmli 上样缓冲液。
      注意：此时样品可在 -80 °C 储存最多 24 小时。进行胶内消化时，应将全部样品体积上样至 SDS-PAGE 凝胶，以最大化蛋白质组覆盖度并确保相互作用组的完整呈现。不建议部分上样。若样品体积有限且部分上样不可避免，剩余材料应分装储存，以减少冻融循环并保持相互作用组完整性。
   2. 将各样品在 95 °C 加热 3 分钟（加入上述 2× Laemmli 上样缓冲液），使蛋白复合物变性并从 beads 上洗脱，随后上样至 SDS-PAGE。缓冲液中的 SDS 和还原剂可破坏蛋白质相互作用，使蛋白从基质中释放。
   3. 在室温下以 10,000 × g 离心 1 分钟。
   4. 将各上清液上样至 4–20% 预制梯度 SDS-PAGE 凝胶。
   5. 在室温下使用 1× TGS 电泳缓冲液进行电泳，运行至中途停止（通常在 100 V 条件下进入凝胶约 3.5–4 cm，运行时间约 30–60 分钟）。
   6. 从电泳装置中取出凝胶，按制造商说明书进行考马斯亮蓝染色。
      注意：染色后的凝胶可置于塑料容器中，加入 5–7 mL 超纯水浸没，随后运送至质谱平台进行蛋白质鉴定。若不能立即处理，可在超纯水中 4 °C 储存 1–2 周。根据执行工作的核心平台和实验目标，采用了两种不同的蛋白质组学工作流程：第 2 节描述了胶内消化后使用四极杆轨道阱质谱仪进行数据非依赖性采集（DIA-MS）分析；第 3 节详细介绍了为平行累积-串行碎裂的捕获离子迁移谱（diaPASEF）优化的 bead 上直接消化方案²⁶。相关步骤可适当交叉参考。

2. 通过凝胶内蛋白质消化结合液相色谱-串联质谱法进行蛋白质鉴定

1. 凝胶内半胱氨酸化蛋白的还原与烷基化
   1. 切下考马斯亮蓝染色凝胶泳道中着色的区域，并将其切成约五个大小相近的凝胶片。将每一片凝胶在500 µL的50%（v/v）甲醇溶液中孵育三次，每次1 分钟，37 °C下以700 rpm在温控微量管振荡器上振荡脱色。
      注意：每块凝胶的尺寸不应超过约1 cm × 0.5 cm × 1 cm，以确保后续步骤中试剂的有效扩散以及过夜凝胶内胰蛋白酶消化的效率。将凝胶中染色较深的蛋白区域（如HSP90和HSC70，它们是化学探针的直接结合蛋白及表伴侣体的核心组分^15,16,23）与其他部分分开切取。否则，这些高丰度蛋白可能干扰LC-MS/MS分析过程中低丰度互作蛋白的检测与定量。
   2. 将每块凝胶片置于500 µL含30%乙腈（ACN）的5 mM碳酸氢铵（ABC）溶液中，37 °C下以700 rpm在温控微量管振荡器上振荡15分钟，以去除残留染料。重复孵育直至凝胶片完全脱色。
      注意：任何残留的可见蛋白染料都可能在肽段纯化步骤中干扰肽段与C18基质的结合，从而降低回收率和下游质谱灵敏度。
   3. 使用细尖移液枪头小心移除并弃去ABC/ACN溶液，注意不要丢失凝胶碎片（即不要将凝胶碎片随液体吸出）。然后向每管中加入500 µL 100% ACN，确保凝胶碎片完全浸没。在室温下以700 rpm于旋转振荡器上孵育10分钟，或直至凝胶碎片变为半透明、体积缩小并呈现类似白纸的外观。
      警告：乙腈易燃，应在通风橱中操作。
   4. 使用细尖移液枪头小心移除并弃去各管中的ACN，避免吸出凝胶碎片。短暂离心（1,000 × g，10 s）以收集残余液体，并用细尖移液枪头小心吸去剩余液滴。将敞口管置于室温下的真空离心浓缩仪中10–15分钟，或直至凝胶片干燥且变硬。
      注意：切勿过度干燥。应定期检查，避免凝胶碎片开裂或过度收缩。干燥后，将凝胶碎片储存在4 °C密封的低吸附管或微量离心管中，直至进行消化；凝胶结合并纯化的蛋白质在4 °C下可稳定保存数天。
   5. 还原：向每个样品管中加入约100 µL 10 mM二硫苏糖醇（DTT）（用50 mM碳酸氢铵将500 mM母液新鲜稀释制备），确保凝胶碎片完全浸没。在56 °C下以700 rpm在温控微量管振荡器上振荡孵育45分钟。
      警告：DTT对皮肤和呼吸道有刺激性。应在化学通风橱内操作并佩戴手套。
      注意：孵育期间确保管盖紧密关闭，以防蒸发并维持DTT浓度。
   6. 烷基化：使用细尖移液枪头小心移除各管中的DTT溶液，避免扰动凝胶碎片。立即加入约100 µL含55 mM碘乙酰胺（IAA）的50 mM ABC溶液，完全覆盖凝胶片。在避光条件下室温振荡（700 rpm）孵育30分钟。
      警告：IAA有毒且对光敏感。操作时应在通风橱内佩戴手套。
      注意：添加IAA前必须彻底去除DTT，以防止烷基化反应被淬灭。孵育期间应将管子用铝箔包裹或使用避光容器，以减少IAA降解。
   7. 在室温下短暂离心（1,000 × g ，5 s），使残余液体沉至管底。使用细孔移液枪头（如P10枪头）小心移除上清液，避免扰动凝胶碎片。略微倾斜管子，从边缘处吸液，以最小化吸入凝胶碎片的风险。
   8. 平衡：用含30% ACN的500 µL 50 mM ABC溶液覆盖凝胶碎片。在加热旋转振荡器上室温振荡（700 rpm）孵育10分钟。此步骤有助于去除多余的烷基化试剂，并在脱水前使凝胶达到平衡状态。
   9. 移除溶液：如上所述，短暂离心（1,000 × g，5 s）后使用细尖移液枪头弃去上清液。
   10. 再次脱水：重复步骤2.1.3和2.1.4，使用100% ACN重新脱水凝胶碎片，随后进行真空离心直至干燥。此步骤可确保酶解过程中获得最佳肽段回收率。
2. 凝胶内蛋白酶解与肽段纯化
   1. 向干燥的凝胶样品中加入质谱级胰蛋白酶，终浓度为5 ng/µL（溶于50 mM ABC），充分重悬凝胶碎片（通常总体积为50–100 µL，或足以覆盖凝胶片）。在1.5 mL微量离心管中37 °C孵育过夜，确保管盖密封严实以防蒸发。如有可能，轻柔振荡（例如在温控微量管振荡器上300 rpm）。
   2. 过夜消化后，逐滴加入10%甲酸（FA）酸化样品，使终浓度达到1%（v/v）（例如，在100 µL消化液中加入1 µL 10% FA）。轻柔混匀后，在室温水浴超声仪中超声10分钟，以增强肽段提取。
   3. 使用细尖移液枪头（如P10窄孔枪头）小心移取含肽段的上清液，避免扰动凝胶基质或吸入凝胶碎片。将收集的上清液转移至低吸附500 µL管中，并置于冰上。
   4. 向每管中加入5% FA/50% ACN（v/v）溶液（通常约50–100 µL，或足以完全覆盖凝胶碎片），在室温下轻柔振荡（例如在振荡器上70 rpm，10–15 分钟），以提取残留肽段。小心收集上清液，并与步骤2.2.3中获得的原始肽段溶液合并。
   5. 使用室温下的真空离心浓缩仪（例如1,000 × g约30分钟）浓缩合并后的肽段提取物，直至仅剩少量液滴。切勿让样品完全干燥，否则可能导致肽段因粘附管壁而损失。部分干燥的提取物可立即用于脱盐，或储存在密封的低吸附管中于-20 °C保存。
   6. 使用手工填充的小规模C18填充移液枪头（即StageTips）对肽段进行脱盐处理，该枪头由两个堆叠的C18萃取盘插入200 µL移液枪头制成，具体方法如前所述²⁷，但作如下修改：
   7. 加入40 µL甲醇以活化C18盘。将装有C18盘的移液枪头（插入空的200 µL移液枪头并置于500 µL管中）在台式离心机中以1,500 × g离心3分钟。
      ​注意：所有步骤中均不得让C18盘干燥。干燥会影响肽段的结合与洗脱。用于固定手工填充小规模C18移液枪头的外层200 µL移液枪头（套管）可能需要剪短约1 cm，以确保双枪头-管组件能正确放入离心机。
   8. 加入0.1% FA并按上述条件离心，以平衡C18盘。
   9. 将溶于20 µL 0.1% FA中的肽段溶液直接加至堆叠盘顶部。
   10. 以1,500 × g离心5分钟，促进肽段与C18盘的结合。
   11. 用40 µL 0.1% FA冲洗已结合的肽段。
   12. 用含0.1% FA的40 µL 70% ACN洗脱肽段。将洗脱的肽段储存在低吸附管中于-80 °C，直至进行LC-MS/MS分析。避免反复冻融。
3. 使用DIA模式的纳米液相色谱-质谱联用分析
   1. 使用真空离心浓缩仪（例如室温下1,000 × g 20–30分钟）浓缩脱盐后的肽段洗脱液，保留少量液滴。用移液枪轻柔吹打并短暂涡旋，将肽段重新溶解于10 µL含0.1% FA的LC-MS级水中。进样前短暂离心，使液体沉至管底。
   2. 取4 µL重悬的肽段样品进行纳米液相色谱-质谱/质谱（nano-LC-MS/MS）分析。在自装反相色谱柱（75 µm内径 × 2 cm，C18树脂，3 µm粒径）上分离肽段，柱温维持在50 °C。使用压力炸弹²⁸将C18树脂浆液（甲醇中，1:3 v/v）填充至带有集成10 µm喷雾尖端（360 µm外径 × 75 µm内径 × 10 µm尖端）的熔融石英毛细管中制备色谱柱。通过纳米电喷雾离子化接口连接至支持DIA工作流程的高分辨率杂合质谱仪（四极杆-Orbitrap型）。
      ​注意：推荐使用20 cm柱长，因其可为SDS-PAGE凝胶切片产生的肽段混合物提供最佳分离效果。
   3. 使用柱温箱或加热块将分析柱维持在50 °C，以确保肽段保留和分离的一致性。运行过程中确保温度控制稳定，因波动会影响重复性。
   4. 以250 nL/min流速，使用0.1% FA中3–40% ACN的线性梯度洗脱肽段，持续110分钟。该梯度可在质谱检测前实现有效的肽段分离。包括柱平衡在内的总分析时间为120分钟。
   5. 按照先前描述的方法²⁹，以DIA模式在高分辨率质谱仪上采集数据。
      1. 设置全MS1扫描在轮廓模式下进行，分辨率为120,000（m/z 200处），扫描范围为300–1650 m/z。每次MS1扫描后，采用滑动隔离窗口方案对30个连续前体窗口（364–1370 Th）进行MS2碎裂。
      2. 使用25.5、27.0和30.0的阶梯归一化碰撞能量进行碎裂。前体离子最大电荷态默认为4。设置MS/MS扫描的固定第一质量为200 Da，并以30,000分辨率采集MS2谱图。
      3. MS2采用自动进样时间设置，MS1最大进样时间为60 ms。对于MS1和MS2扫描，均将离子目标值（AGC）设为3e6。
4. 亲和捕获互作组的相对定量
   注意：为定量DIA-MS分析中鉴定出的亲和捕获表伴侣体互作组蛋白，应使用支持DIA工作流程的软件平台，并基于肽段强度或谱图计数提供可靠的定量结果。本方案使用MaxQuant（例如版本2.5.1.0）及其MaxDIA工作流程^20,29进行肽段/蛋白鉴定及基于强度的非标记定量。搜索采用反向序列诱饵策略，在PSM/肽段和蛋白水平上FDR为1%；"Reverse"和"Potential contaminant"条目在生物信息学分析前已被过滤。未使用内标；通过250 ng HeLa消化物（及间歇性10 fmol六蛋白混合物）验证仪器状态，满足内部鉴定和保留时间稳定性标准。
   1. 使用一致参数分析所有样品的原始DIA-MS数据。允许最多两个漏切，并设置如下修饰：固定修饰为半胱氨酸的羧甲基化；可变修饰为甲硫氨酸的氧化和蛋白质N端乙酰化。
   2. 使用基于UniProt人类蛋白数据库（例如约20,000条目）的in silico预测谱图库，确保包含诱饵和污染物序列，以准确估计假发现率（FDR）。除非使用其他酶，否则指定胰蛋白酶消化。一个经过验证的人类谱图库（基于2020年6月18日UniProt发布版本，共20,956条目）可从马克斯·普朗克生物化学研究所数据库获取³⁰。
      注意：作为使用预测谱图库工作流程的替代方案，步骤3.4展示了无需谱图库的处理方法，其在这些数据集上产生了相当的鉴定和定量结果。
   3. 使用强度值（而非非标记定量[LFQ]强度）进行蛋白丰度定量，因为这些值更适合下游的蛋白质互作网络分析。应取消选择LFQ以避免归一化伪影，这些伪影可能扭曲亲和富集数据。相反，应使用来自肽段谱图匹配的原始强度值，这些值更能反映互作强度而非全局蛋白表达水平。应用适当的过滤标准（例如每蛋白组至少一个唯一肽段）以提高蛋白鉴定和定量的可靠性。导出最终的蛋白强度表，用于后续统计和基于网络的分析。
      注意：与标准蛋白质组学工作流程不同，在后者中LFQ值有助于在整个裂解液中标准化蛋白上样量，而此处蛋白是通过表伴侣体的亲和捕获富集的。该富集步骤引入了生物学变异，而LFQ归一化可能掩盖这种变异。因此，优先使用原始强度值，因其能更好地反映不同条件下蛋白-表伴侣体互作的差异，并保留下游网络水平（例如dfPPI）分析所需的信号。在先前使用Mascot搜索的研究中^16,18，也使用了MS/MS谱图计数代替强度值。在此类亲和捕获工作流程中，谱图计数反映互作频率，适用于识别不同条件下差异互作的蛋白。与LFQ值不同，MS/MS计数不假设整个蛋白质组的全局归一化，因而保留了表伴侣体富集步骤带来的生物学上有意义的变异。

3. 通过磁珠上蛋白消化结合液相色谱-串联质谱法进行蛋白质鉴定

1. 磁珠上消化
   注意：为确保在磁珠上进行蛋白质消化以用于质谱分析时获得最佳的蛋白质回收率并尽量减少样品损失，必须使用低蛋白吸附的微量离心管。此类管材经过特殊设计，可减少蛋白质在管壁上的吸附，从而提高样品回收率。本步骤中使用的所有试剂均应使用液相色谱-质谱级水和试剂新鲜配制。若将样品送至蛋白质组学核心平台进行分析，请查阅当地相关规定，因为部分机构可能要求所有缓冲液在使用前经过滤除菌。
   1. 移除步骤1.4.6中可能残留在管内的任何PBS。用80 µL新配制的2 M尿素（溶于50 mM ABC，pH 8.5）重悬磁珠。通过移液或短暂涡旋确保充分混匀。
      注意：根据磁珠的数量和类型按比例调整体积。本方案针对 40 µL PU 磁珠悬液进行优化。
   2. 加入DTT，使其终浓度为1 mM。
      注意：新鲜配制10 使用前，立即用LC-MS级水将1 M DTT储备液稀释成所需浓度的mM级DTT溶液，因为DTT在溶液中易被氧化。将所需体积的DTT溶液直接加入样品中，并用移液器轻轻混匀。
   3. 盖上管盖，在37 °C下于加热振荡培养箱中以1,100 rpm振荡孵育30分钟。密封管盖以尽量减少蒸发。
   4. 加入IAA，使其终浓度为3.67 mM。室温避光孵育，以1,100 rpm振荡45分钟。
      注意：配制新鲜的 10 使用前立即用LC-MS级水配制mM IAA储备液。将所需体积加入样品中，并用移液器轻轻混匀。
   5. 加入额外的DTT以淬灭未反应的IAA，使终浓度达到3.67 mM。用移液器轻轻混匀。
      注意：淬灭未反应的碘乙酰胺（IAA）可防止过度烷基化，过度烷基化可能影响蛋白酶活性和消化效率。二硫苏糖醇（DTT）需新鲜配制，并根据当前样品体积计算所需体积，以达到目标浓度。
   6. 向样品中加入750 ng的0.5 mg/mL质谱级Lys-C蛋白酶。37 °C、1,150 rpm振荡孵育1 h。
      注意：通过将Lys-C溶解于液相色谱-质谱级水中来制备。将酶分装后于-80 °C保存，避免多次冻融。
   7. 加入750 ng新配制的、浓度为0.5 mg/mL的测序级胰蛋白酶。在37 °C、1,150 rpm振荡条件下孵育过夜。孵育时间不得超过16–18小时，以防止过度消化和肽段降解。
   8. 第二天，将样品在1,000-5,000 × g 在室温下孵育1-5分钟，用移液器将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。弃去磁珠。
   9. 将消化液的 pH 值用 50% 三氟乙酸（TFA）逐滴调节至 3 以下，使用 pH 指示试纸确认 pH 值。
      注意：pH 值通常应在 ~2.5–3.0 范围内，且样品在脱盐前应进行酸化处理。
      警告：三氟乙酸（TFA）具有腐蚀性和挥发性。应在通风橱中添加，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
2. 多肽脱盐
   注意：用于多肽脱盐和纯化的操作，请使用小规模C18填充的移液枪头（例如StageTips）³¹. 通过将三层C18材料（例如C18固相萃取圆盘）装入200 µL移液枪吸头中制备C18 StageTips。也可使用市售的预装C18离心柱。请遵循制造商提供的方案进行平衡、上样和肽段洗脱。自制装置与商业装置在性能（如保留效率、回收率）上可能存在差异。小规模的C18填充移液枪吸头应紧密填充，以避免液体绕流。
   1. 依次用以下溶液对小规模C18填料移液枪头进行预处理：(1) 100 µL甲醇。在400 × g 并弃去穿流液；（2）加入100 µL 70% ACN/0.1% TFA。在400 × g 弃去穿流液；(3) 100 µL 0.1% TFA。在400 × g 弃去穿流液，重复此步骤两次。
      注意：预处理可确保疏水性C18树脂充分润湿。对于市售的预装C18离心柱，也可使用真空 manifold。用户应参考生产商提供的说明书以获取具体的操作建议。
   2. 将酸化后的肽段消化液通过移液枪缓慢加入已预处理的小型C18填料移液枪头中。在300 × g 使消化产物流经树脂，并弃去穿流液。若样品体积超过柱容量，需分多次上样.
      注意：将消化液直接移至密实的树脂床中，避免产生气泡。若使用低吸附性枪头，应让枪头内壁接触小规模C18填充的移液枪头内壁，以缓慢且均匀地释放液体。
   3. 将100 µL 0.1% FA直接加入小规模C18填料移液枪头中，确保溶液充分浸润C18材料。在400 × g下离心，弃去穿流液。重复此步骤两次，以去除盐分和干扰物质。
      注意：每次离心前，确保液体完全流经C18材料。沿移液枪头内壁缓慢加入洗涤液，以避免产生气泡。
   4. 通过移液器将50 µL 70%乙腈/0.1%甲酸加入小规模C18填装移液枪头中，洗脱结合的肽段。在300 × g条件下离心 g 将洗脱液收集到一个洁净的低吸附微量离心管中。重复此步骤两次，以确保完全洗脱。
      注意：可能需要进行多轮离心才能完全回收洗脱液。如果残留液体仍滞留在吸头尖端底部，可轻轻敲击小规模C18填料柱吸头或进行短暂的额外离心，以收集剩余液体。合并洗脱液，并在继续后续步骤前检查最终体积。
   5. 使用真空浓缩仪将洗脱的多肽冷冻并干燥至完全干燥。确保管盖松开以允许排气，但避免液体溅出。
   6. 将12 µL含0.1%甲酸的液相色谱-质谱级水直接加入管底，以重悬干燥的多肽。轻轻涡旋并超声处理各管，使多肽完全溶解。
      ​注意：确保整个沉淀或干燥薄膜完全重悬。使用移液枪溶解可能导致肽粘附于吸头表面，造成肽损失。
   7. 将重组后的肽在装有冷水的浴式超声仪中进行超声处理5分钟，以确保完全溶解并防止过热。
   8. 将肽段在 20,000 × g 4 °C 下离心 10 分钟。将肽段上清液转移至合适的自动进样瓶中，用于上样至液相色谱-质谱（LC-MS）系统。使用低容量、高质量、经气相色谱（GC）检测的聚丙烯进样瓶，并配以带键合硅胶/聚四氟乙烯（PTFE）隔垫的瓶盖，以最大限度减少样品损失。用样品编号和进样顺序清晰标记进样瓶。
   9. 使用分光光度计在280 nm处估算肽浓度。请注意，该方法仅为近似值，可能受芳香族残基含量或污染物的影响。 alternatively，可采用比色法肽定量检测以获得更准确的定量结果。
3. 液相色谱与质谱参数
   ​注意：以下液相色谱和质谱参数是针对本实验方案中所用的纳米液相色谱系统与质谱仪联用条件进行优化的。对于其他纳米液相色谱系统和质谱仪，应相应调整参数。
   1. 每周配制流动相，以确保液相色谱-质谱兼容性并尽量减少污染：（1）流动相A：将1 mL LC-MS级甲酸加入1 L LC-MS级水中；（2）流动相B：将1 mL LC-MS级甲酸加入1 L LC-MS级乙腈中。
      注意：仅使用LC-MS级溶剂和酸。在洁净的玻璃瓶中配制两相，并根据液相色谱系统要求进行脱气。每周丢弃未使用的流动相，以避免微生物生长或降解。
   2. 安装一根25 cm长、内径为75 µm的熔融石英毛细管柱，内填1.7 µm C18反相颗粒。
      注意：操作色谱柱时需小心，避免引入气泡或损坏填料。请遵循制造商提供的安装和色谱柱平衡说明。
   3. 使用3%流动相B，将流速从50 nL/min逐步增加至300 nL/min，对色谱柱进行平衡。
      ​注意：此步骤可确保在进样前固定相充分润湿并达到平衡。在梯度增加流速的过程中需监测柱压，压力突然升高可能表明存在气泡或柱子堵塞。当基线压力稳定时，可认为平衡完成。
   4. 将色谱柱温度维持在 50 °C，以确保最佳的色谱性能。
   5. 注入100 ng HeLa细胞胰蛋白酶消化产物作为质控（QC）标准，以评估系统性能。
      注意：该质控进样用于评估液相色谱保留时间的一致性、质谱灵敏度以及不同运行间的蛋白质组覆盖度。在分析实验样品前，应将蛋白质鉴定数量、保留时间重现性及信号强度与参考质控数据集进行比较，以确认系统状态是否就绪。为确保实验间重现性，应使用已知浓度的商业化HeLa消化标准品。
   6. 采用梯度洗脱，在90分钟内将流动相B从2%升至35%，流速为300 nL/min。该90分钟梯度可实现高分辨率的肽段分离，适用于复杂的蛋白质组。梯度结束后，以95%流动相B保持7分钟以清洗色谱柱。
      注意：在下一次进样前需包含重新平衡步骤（例如，以2% B相回流10–15分钟），以确保色谱柱在多次运行间的重现性。避免梯度的急剧变化，以免影响保留时间的稳定性和峰形。
   7. 使用配备纳米流兼容电喷雾电离源（例如 CaptiveSpray 风格）的质谱仪进行质谱分析。
      ​注意：CaptiveSpray 离子源可在低纳流速下提供稳定的电喷雾，从而提高电离效率和灵敏度。对于使用其他质谱仪的实验室，应相应调整采集和电离参数。分析前需确保正确调谐和校准，以保持准确性和分辨率。正确放置喷雾发射器，并在运行过程中监测喷雾稳定性，以防止信号中断。
   8. 采用数据非依赖性采集 diaPASEF 方法³²对于不熟悉 diaPASEF 的用户，请参考制造商的技术文档或近期描述捕获离子淌度质谱（TIMS）-DIA 工作流程的相关方案。³³ 以优化不同样本类型或梯度长度的条件。
      注意：diaPASEF 将 TIMS 与 DIA 相结合，通过在迁移率维度上对齐前体离子和碎片离子，从而提高测序速度和灵敏度³⁴确保TIMS设备已正确校准，并与四极杆同步，以避免离子淌度与质荷比窗口的错位。
   9. 使用以下仪器参数设置：（1）质荷比范围：100–1700 m/z；（2）离子淌度范围：0.60–1.60 V·s/cm²；（3）碰撞能量：20–59 eV，梯度递增；（4）扫描时间：100 ms；（5）累积时间：100 ms；（6）diaPASEF 质量范围：400–1201 Da；（7）质量窗口宽度：26 Da，重叠1 Da；（8）每循环质量步数：32；（9）循环时间：约1.8 s
      注意：这些参数设置旨在平衡覆盖深度与扫描速度。根据样本复杂性、梯度长度及液相色谱-质谱（LC-MS）系统性能的不同，可能需要进行微调（如窗口宽度或步数）。HeLa 酶解物中鉴定出超过 7,500 种蛋白质表明系统性能处于最佳状态。鉴定数量可能因仪器而异，应据此进行评估。
   10. 每次进样加载300–400 ng肽段样品，以防止分析柱超载。超载可能导致峰展宽、离子抑制以及重现性降低。进样前使用分光光度计或比色法肽段定量检测确认肽段浓度，以避免不同运行间的差异。
   11. 在样品组之间运行空白进样以避免交叉污染。使用100%流动相A（含0.1% FA的水）作为空白进样。此步骤可将残留的肽段从色谱柱中冲洗出去，减少运行之间的污染。监测基线和背景离子以确认清洗充分。
4. DIA 数据分析
   1. 使用支持通过 directDIA 工作流程进行数据分析的合适软件³⁵ 以及无需文库的DIA蛋白质组学数据分析。基于UniProt FASTA数据库进行蛋白质鉴定与定量³⁶，采用标准搜索参数和默认定量设置。
      注意：所有参数，包括酶特异性、修饰设置、FDR 阈值以及分析后输出，均在下文中详细说明 补充文件 1. 诸如 DIA-NN 的替代 DIA 分析平台³⁷ 如果支持类似的流程和输出，也可使用。
   2. 以库无关的directDIA方法进行分析，设定q值截断标准，使前体离子、肽段和蛋白质组水平的错误发现率（FDR）均控制在1%；在下游分析前排除伪库（decoy）鉴定结果。
      注意：未添加iRT标准品；性能评估基于HeLa消化产物的检测结果，参照预定义的鉴定和保留时间稳定性标准进行。

结果

在成功执行该方案后，用户应获得适合进行下游dfPPI分析的高质量相互作用数据集。蛋白质鉴定基于DIA数据在1%错误发现率（FDR）下进行（包括PSM和蛋白质水平），定量则使用原始强度值或MS/MS谱图计数（而非LFQ）。预期的质量控制指标包括：技术重复样本在主成分分析（PCA）中呈现紧密聚类，前体离子/蛋白质的中位变异系数（CV）约为10–12%，层次聚类结果由生物学来源驱动而非重复样本，并在g:Profiler/Reactome上观察到显著的通路水平富集。

使用前PU磁珠探针的制备及活性验证

PU-beads 通过将一种表分子伴侣复合物结合的小分子类似物偶联到 NHS 活化的琼脂糖上制备，方法如前所述²⁵。一个标准的 25 mL 树脂装量可获得约 25 mL 的 PU-beads，以异丙醇中 1:1 悬浮液的形式保存。分装至低吸附离心管中，于 −20 °C 避光保存（例如用铝箔包裹）。在此条件下，一批次样品可稳定保存 ≥12 个月。使用前，去除异丙醇，并用天然结合缓冲液平衡 beads（步骤 1.3）。每批产物在合成时均需通过两种检测进行质量验证，之后定期复检（图 2）：（i）生物学特异性——在相同条件下（40 µL beads 悬浮液与 250 µg 总蛋白；4 °C 孵育 3 小时；天然洗涤）对表分子伴侣复合物高表达裂解液（如 MDA-MB-468）和低表达裂解液（如 ASPC1）进行配对 pull-down 实验，洗脱并变性后，对 HSP90、HSC70 和 HOP 进行免疫印迹分析。验收标准：高表达样本中显著富集，低表达样本中信号极弱；条带强度比值与参考批次相比在 ±20–30% 范围内。（ii）整体货物蛋白谱——使用 PU-beads 与配对的惰性对照 beads 平行从表分子伴侣复合物高表达裂解液中捕获蛋白，将等体积洗脱液上样进行 SDS-PAGE 电泳，并用考马斯亮蓝染色。验收标准：PU-beads 显示出丰富的高分子量货物蛋白，而对照 beads 条带背景信号极低。一批 25 mL 的 PU-beads 可支持约 600 次捕获实验（每次 40 µL），若经重新洗涤/再平衡后，其特异性或货物蛋白谱仍超出验收范围，则应弃用该批次。

凝胶内和磁珠上实验方案的代表性结果

在对表观分子伴侣高表达的 MDA-MB-468 细胞进行的初步头对头比较中，凝胶内法和磁珠上法产生的相互作用组高度一致：在蛋白质组水平上，6,333 个蛋白质中有 4,616 个（73%）重叠，其中仅凝胶内法检测到 1,275 个（20%），仅磁珠上法检测到 442 个（7%）。通路水平的一致性更高：在 860 个 Reactome 通路术语中，有 727 个（85%）共同存在，81 个（9%）为凝胶内法特有，52 个（6%）为磁珠上法特有。凝胶内法的蛋白质中位强度比磁珠上法高出约 3 倍，这与凝胶洗脱浓缩效应一致，但并未显著影响通路层面的一致性。

队列规模示例与质控特征

以一个实例为例，我们分析了十二个生物学样本（图3）。其中四个样本通过凝胶内消化进行洗脱和处理；另外八个样本则经过表分子伴侣复合物的亲和纯化，随后进行珠上消化，并以技术重复的方式进行纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）分析。观察到了预期的质量控制特征：技术重复样本在主成分分析（PCA）中呈现紧密聚类，前体离子/蛋白质的中位变异系数（CV）约为10–12%，层次聚类主要由生物学来源而非重复性驱动，并且在g:Profiler/Reactome分析中显示出稳健的通路水平富集。这些结果表明，整个实验流程各环节具有良好的可重复性，能够广泛检测到参与表分子伴侣复合物的蛋白质，并在通路水平上对差异互作蛋白实现清晰的功能解读。两种实验流程所得的通路富集结果均与我们此前发表的该细胞系的dfPPI结果一致，并已通过多项生化及功能正交实验验证¹⁷。

输入材料的质量与消化

对通过胶内消化处理的四个样品，展示了具有代表性的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶结果（图3A）。该凝胶显示蛋白质捕获具有可重复性，且各泳道条带分布一致，证实了在质谱分析前，已成功从天然裂解液中富集到蛋白质复合物。这些变性状态下的相互作用组谱图表明，亲和捕获步骤能够为后续质谱分析提供足量且稳定的蛋白质输入。

捕获的相互作用组在分子量范围内显示出广泛的蛋白质覆盖，反映出从天然裂解液中成功富集了蛋白质复合物。重要的是，这种回收不仅限于高丰度蛋白质，还包括低丰度相互作用蛋白，从而提供了系统水平分析所需的复杂性和深度。

大规模的对照与特异性

在此工作流程中，我们仅使用对照珠进行预清除（见步骤 1.3 和 1.4）；不对每个生物样本进行常规的“惰性探针”比较性捕获。对于大规模临床队列，惰性捕获会消耗宝贵的样本材料，但对dfPPI的解释价值有限，因为下游统计分析是在网络/通路水平上进行的，而非针对单个蛋白质。随机污染物或树脂非特异性结合的杂质不会在同一条通路的成员中协调性地出现，因此无法通过通路水平的富集检验或队列水平的一致性筛选。在实际操作中，特异性通过以下方式得以保障：(i) 预清除步骤，(ii) 高重复性（PCA/CV），以及 (iii) 在不同阈值和重采样条件下通路的稳定性。历史上，我们曾评估过惰性捕获和可溶性竞争剂（PU-H71）阻断实验，发现这些操作并未改变dfPPI通路分析结果^16,17,21，同时却消耗了不可替代的临床样本；因此，我们仅在初步验证实验中保留这些步骤。对于倾向于进行明确运行级别检测的研究团队，我们指出这两种选择均可与本方案兼容，但在队列规模的dfPPI分析中并非必需。

重复次数

dfPPI 中的通路推断基于集合，无需固定的重复次数。在数据采集可靠的情况下，每个实验条件下单个样本即可用于探索性通路分析。对于验证性分析，我们建议每个实验条件至少设置3个生物学重复（对于培养细胞，若条件允许，每个样本进行两次 LC-MS/MS 进样），而对于人体组织样本，则应根据队列特点设定适当的样本量（通常在发现阶段每组至少5–10例，若需按协变量分层，则需更大样本量）。我们通过重复样本的聚类分析（PCA）、前体离子变异系数中位数（目标值约为10–15%）以及富集结果的自助法（bootstrap）或重采样分析来评估结果的稳定性。

不同运行间的可重复性

采用主成分分析法（PCA）对磁珠上消化样本（八个小鼠脑组织，每个样本重复检测两次）的肽段强度数据进行分析，以评估技术重复性（图3B）。每个生物学样本的重复检测点紧密聚集，而不同样本则在前两个主成分轴上清晰分离。前两个主成分分别解释了总方差的28.6%和22.0%，且样本分布主要反映生物学差异，而非技术性噪声。该结果表明分析具有高度的一致性，并证实该方法能够保留生物学相关的差异，这对于dfPPI检测特定条件下网络重构至关重要。

不同样本间检测的一致性

前体离子强度的变异系数（CV）分布显示，绝大多数特征的CV值低于20%，在不同条件下中位数范围为9.7%至11.9%（图3C）。这些结果证实了在重复样本中质谱检测和肽段回收具有良好的一致性。

动态范围与蛋白质组覆盖度

对经对数转换的蛋白质丰度值进行层次聚类分析（图3D）显示，样本之间具有明显的分离，且样本间的差异得以保留，同时反映了质谱检测所覆盖的宽动态范围。蛋白质信号强度涵盖从低丰度互作蛋白到高度富集的蛋白质群组，这在图中以蓝色至黄色的渐变清晰呈现。数据证实，该实验方案能够检测多种蛋白质复合物及互作分子，可同时捕获核心组分和外围组分。

通过 dfPPI 进行功能注释

为了支持数据解读和实验可重复性，我们为 dfPPI 数据集分析提供了两种互补资源：（i）一个交互式 Shiny 网络应用程序（https://epichaperomics.mskcc.org/ 已更新为 https://dfppi.mskcc.org）；（ii）开源、可脚本化的分析流程以及随先前 dfPPI 研究发布的 Cytoscape 会话文件（GitHub/Zenodo）^38,39,40,41。该应用程序可导入原始强度值或 MS/MS 谱图计数表格，执行质量控制（重复样本聚类、缺失值检查）、可选的噪声/批次效应处理（协变量回归），识别差异结合蛋白，并通过交互式图表和可下载报告提供通路/网络分析结果，全程无需编程操作。

dfPPI 将测得的强度值或谱图计数视为“表伴侣体参与度”的代理指标。用户可选择差异连接性（DC）模型，范围从简单的双尾 t 检验（默认）到考虑协变量的线性模型；也可跳过 DC 步骤。在完成 DC 分析后，用户设定倍数变化（fold-change）和 p 值阈值（默认值沿用先前 dfPPI 研究的标准；例如，FC > 1.0，名义 p ≤ 0.25），以筛选候选蛋白进入富集分析阶段。提供两种富集分析引擎：基于排序的 GSEA（使用带符号的统计量）和通过 g:Profiler 实现的过表达分析（超几何检验），后者包含多重检验校正。为了提供以分子伴侣为核心的分析背景，该流程还提供相互作用组富集分析（Interactome Enrichment Analysis, iEA），用于检测分子伴侣支架蛋白的直接互作蛋白是否在差异参与的蛋白中显著富集。网络图视图根据效应量和/或统计支持度对节点和边进行加权，从而实现对协同性重连现象的可视化，而非仅展示单个蛋白的变化。对于偏好脚本化工作流程的用户，构建网络图和图表所用的底层 R 代码及 Cytoscape 会话文件已公开提供（例如 GitHub/Zenodo）^38,39,40,41，并随相关出版物^17,18,19,20 一并发布，可本地运行或适配于新数据集。

建议采用宽松的截断标准（倍数变化 > 1.0；名义 p 值 ≤ 0.25），以保留由亲和富集引入的相互作用状态信号。随后将统计控制转移至通路水平：使用 g:Profiler 检测候选蛋白在人工审编的本体数据库（如 GO、Reactome）中的富集情况，并依据多重检验校正后的通路 p 值确定其显著性与排序。该设计体现了 dfPPI 的核心目标——检测协调性的网络重连，而非单个蛋白的差异表达——并避免了全蛋白质组归一化可能掩盖下拉数据集中富集信号的问题。如先前的 dfPPI 研究所示^17,20，更宽松的蛋白水平阈值可产生稳定且与疾病相关的通路结果；而在方差或批次协变量需要考虑时，也可采用其他模型（例如结合经验贝叶斯压缩的线性模型），而不改变以通路为中心推断的核心逻辑。

亲和捕获不可避免地会共富集“黏性”蛋白（例如角蛋白、细胞骨架蛋白、核糖体蛋白），而PU磁珠也可能捕获一般的分子伴侣相互作用蛋白。在dfPPI分析中，由于以下几个原因，这些蛋白不会驱动生物学结论。首先，预清除步骤和严格的洗涤过程可去除大多数非特异性结合蛋白。其次，包括许多分子伴侣互作蛋白在内的通用结合蛋白在不同条件下表现出接近1.0的倍数变化（fold change），和/或检测结果不一致，因此无法通过倍数变化和p值筛选。第三，通路富集分析是基于基因集且考虑背景的：其显著性是相对于实验特异检测到的蛋白质组进行计算的，并要求同一通路中的多个成员共同变化。随机或高丰度的污染蛋白分散于多个功能条目中，因此不会形成连贯且经FDR校正后显著的富集结果。单个蛋白——无论是污染物还是其他蛋白——都无法“主导”通路判断。第四，dfPPI关注的是网络层面的连贯性，而非单个蛋白；通路判断必须通过多重检验校正（例如g:Profiler调整后的p值）、最小基因集大小阈值以及重复实验的一致性验证。结合匹配的惰性磁珠预清除步骤和常见污染物过滤策略，该框架使dfPPI对背景干扰具有较强的鲁棒性：即使存在数百个无信息量的蛋白，也不会改变通路排序，因为富集程度取决于通路内一致变化的蛋白数量，而非蛋白列表的总长度。此外，迄今为止每项已发表的dfPPI研究均通过大量实验验证（如靶向生化分析、信号通路读数、遗传或药物干预）证实了其在通路和网络层面的预测结果^{16,17,18,19,20}，表明dfPPI输出的并非仅仅是噪声蛋白列表，而是可重复的、与疾病相关的PPI网络功能障碍图谱。

为了评估 图3D 中 dfPPI 数据集所捕获的功能图谱，我们使用 g:Profiler⁴² 进行了富集分析（图3E）。结果显示，在所有主要功能本体中均具有稳健的注释覆盖度，包括基因本体生物学过程（GO-BP）、分子功能（GO-MF）和细胞组分（GO-CC），以及人工审编的通路资源，如 Reactome、KEGG 和 WikiPathways。该代表性分析展示了 dfPPI 方法的一个关键优势：即使在相对较小的样本量下，它也能够揭示跨多种注释类型具有生物学意义的通路关联。此处观察到的广泛 Reactome 覆盖度可能反映了 dfPPI 基于相互作用水平的变化——即捕捉蛋白质网络的重构，而这些重构直接映射到多组分过程和信号级联反应，这在 Reactome 的结构中得到了充分表征。由于 dfPPI 利用的是连接性变化而非表达水平变化，因此特别适用于检测转录组学或仅基于丰度的蛋白质组学可能遗漏的系统层面功能转变。这一发现与其他研究结果一致，在这些研究中，由 dfPPI 衍生的蛋白质集合在 Reactome 中始终产生最一致且与疾病相关的富集结果^{14,15,16,17,18,20,21}。

Reactome 围绕多蛋白过程和复合物（信号转导级联、细胞周期模块、代谢组装体）进行组织。由于 dfPPI 富集的是参与表分子伴侣体的相互作用蛋白——即在疾病支架结构中被功能上共同招募的蛋白群组——其输出结果自然包含连贯的通路模块，而非孤立的阳性信号。这种协同捕获可在相关亚通路及层级结构中实现广泛且具有高度显著性的 Reactome 覆盖。相比之下，以丰度为中心的组学方法（转录组学；全局蛋白质组学）仅报告表达水平的变化，而非相互作用状态；单诱饵的亲和纯化-质谱（AP-MS）或邻近标记技术一次只能提供围绕单一设计诱饵的局部相互作用区域；而交联或共洗脱方法通常只能获得稀疏的连接信息。这些方法均无法像 dfPPI 那样，通过一次内源性捕获从细胞或组织中常规地获得具有上下文选择性和系统层面的蛋白集合。其结果是通路富集既广泛（多个 Reactome 分支均被激活）又在机制上具有一致性（蛋白协同变化，是因为表分子伴侣体重构了它们之间的相互作用，而不仅仅是其表达量的改变）。然而，需要指出的是，dfPPI 是一种互补性技术，而非替代方案：每种相互作用组学方法都有其独特的优势与局限性，最佳方法（或组合）的选择应基于具体的生物学问题、样本限制以及所需的分辨率。

综上所述，这些结果证实了该方案能够产生可重复且具有生物学信息的高质量数据集，可用于揭示不同疾病状态或实验干预条件下相互作用组的差异性重塑。dfPPI 的输出结果非常适合与通路富集分析框架整合，能够识别出基于标准丰度检测方法所无法发现的功能性网络重连事件。

图 1：dfPPI 平台概述。 （A）dfPPI（功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用组，dysfunctional Protein-Protein Interactome）平台通过化学蛋白质组学工作流程，实现对疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络功能障碍的鉴定。第 1 部分涉及样本制备及使用固定在亲和基质上的表分子伴侣靶向化学探针（例如 PU-beads）进行相互作用组捕获。第 2 和第 3 部分描述了两种兼容的消化流程——珠上消化或凝胶内消化——随后通过无标记 LC-MS/MS 进行相互作用组鉴定。计算分析（包括统计建模和通路富集分析）通过 dfPPI 生物信息学分析流程完成，该流程未在本方案中详述，但可免费访问 https://epichaperomics.mskcc.org/。 （B）dfPPI 的原理。在与疾病相关的背景下，内源性表分子伴侣会形成超分子支架，从而重构 PPI 网络。靶向表分子伴侣的化学探针（例如 PU-beads 或等效探针）可直接从完整细胞或天然裂解液中捕获这些支架及其结合的相互作用蛋白，从而在单次实验中实现多诱饵共沉淀。匹配的对照（例如惰性珠对照和/或游离探针竞争对照）可并行处理。捕获的物质在珠上或凝胶内进行洗脱和消化，通过 LC-MS/MS 分析，并对蛋白质进行定量（强度值或 MS/MS 谱图计数）。所得相互作用组用于计算不同条件间的差异相互作用蛋白，并进行通路/网络富集分析，从而在系统层面揭示特定背景下的 PPI 功能障碍。该工作流程无需基因标记或过表达，适用于细胞和组织样本，并可扩展至队列研究。相比之下，传统的亲和纯化-MS 方法每次仅针对一个标记的诱饵蛋白，每次构建仅产生局部相互作用网络，通常需要多个构建体和多次运行才能覆盖整个网络。而 dfPPI 则利用内源性表分子伴侣作为诱饵，从天然系统中同时捕获大量功能失调的 PPI，从而加速疾病特异性网络重连的发现，并通过单次捕获提供通路水平的功能读出。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：PU磁珠批次验证及捕获特异性。（A）生物学特异性与批间一致性。将MDA-MB-468（epichaperome高表达）和ASPC1（epichaperome低表达）细胞在天然缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4；20 mM KCl；5 mM MgCl₂；0.01% NP-40；蛋白酶/磷酸酶抑制剂）中裂解。每次捕获反应中，将40 µL PU磁珠悬液与250 µg总蛋白（1 µg/µL）在4 °C旋转孵育3小时。磁珠用天然缓冲液洗涤后，复合物在约100 µL SDS上样缓冲液中变性并洗脱。每种洗脱液取5–10 µL进行SDS-PAGE分离，并对HSP90、HSC70和HOP进行免疫印迹检测。图中同时展示了输入样品裂解液作为对照。两个不同批次的PU磁珠（批次1为新鲜制备，批次2为长期储存后）均在MDA-MB-468细胞中显示出强富集效果，在ASPC1细胞中信号极弱，表明其特异性保持良好且批间一致性高。（B）全蛋白载物与对照磁珠的比较。MDA-MB-468细胞裂解液按（A）中条件分别使用PU磁珠或匹配的对照磁珠进行处理。每种洗脱液取约20 µL上样，经SDS-PAGE分离后进行考马斯亮蓝染色。PU磁珠可富集到具有epichaperome结合复合物特征的复杂、高分子量蛋白群，而对照磁珠仅显示极低背景信号。图中标注了分子量标记物（kDa）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：dfPPI亲和捕获、相互作用组鉴定及生物信息学分析的代表性结果。（A）从四个代表性人脑样本（PT1–PT4）中捕获的epichaperome结合相互作用组经PU磁珠亲和纯化后，洗脱蛋白的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶图。磁珠结合的蛋白复合物经SDS上样缓冲液煮沸变性后，通过SDS-PAGE分离并染色，以评估不同分子量范围内的相互作用组回收情况。每个样本分别上样于独立泳道，样本间留有空泳道以尽量减少交叉污染；这些空泳道中偶尔观察到的微弱信号反映了电泳过程中轻微的样品溢出。这些凝胶代表了提交至质谱（MS）平台的样本，其中每条泳道被均分为五个片段，用于胶内酶解及后续质谱鉴定蛋白。（B）对八个人源小鼠脑样本（每个样本设置技术重复）中磁珠上直接酶解获得的epichaperome相互作用组蛋白强度进行主成分分析（PCA），结果显示技术重复样本高度聚集，且在PC1和PC2轴上呈现出清晰的生物学分组。这表明实验具有高度的技术可重复性，并具备足够的生物学差异，可用于稳健的dfPPI分析。数据结构表明，样本间的分离主要由相互作用水平的差异驱动，而非技术偏差，从而为后续无需人工归一化的差异相互作用组建模提供了坚实基础。（C）八个样本组间前体离子强度的变异系数（CV）分布显示变异程度持续较低，中位CV值介于9.7%至11.9%之间（由垂直虚线标示）。这些低CV值突显了质谱检测与定量流程的高度可重复性与稳健性。数据的一致性支持将原始强度值或MS/MS计数直接用作dfPPI分析的可靠输入，因为在该分析中，关注的生物学信号是相互作用强度的变化，而非全局蛋白表达水平的改变。（D）所有样本（含技术重复）的log₂转换后蛋白强度值的层次聚类热图显示，样本按生物学来源聚类，而非按技术重复聚类，证实了epichaperome结合相互作用组的有效捕获以及生物学相关变异的保留。蛋白检测具有宽广的动态范围且一致性良好，进一步支持该数据集适用于dfPPI分析。标尺表示log₂转换后的蛋白强度值，范围从2（蓝色，低丰度）到14（黄色，高丰度）。（E）基于dfPPI鉴定出的差异相互作用蛋白进行通路富集分析的曼哈顿图。富集分析使用g:Profiler完成，显著性术语按−log₁₀(p值)绘制，并按注释来源着色：GO分子功能（GO:MF）、GO生物过程（GO:BP）、GO细胞组分（GO:CC）、KEGG、Reactome、WikiPathways及人类表型本体（HP）。该结果体现了dfPPI的核心应用价值：揭示由epichaperome驱动的相互作用组重构所扰动的具有生物学意义的功能通路。广泛的注释覆盖范围凸显了该方法在系统层面解析生物学机制的能力。请点击此处查看该图的高清版本。

方法	检测内容	主要优势	关键局限性	典型用途	可扩展性（队列）
AP-MS（亲和纯化-质谱）	单一诱饵蛋白的直接或近直接互作分子	高特异性；可定量；适用于复合物组成分析	需要诱饵蛋白/标签/抗体；一次仅能检测一个诱饵；可能遗漏瞬时或弱相互作用	确定目标蛋白的互作伙伴	低至中等（需大量诱饵）
邻近标记（例如 BioID/APEX 变体）	随时间在诱饵蛋白纳米尺度范围内的蛋白质	可捕获瞬时或弱相互作用的邻近蛋白；适用于活细胞环境	需要基因工程操作；存在脱靶标记；实验参数复杂	局部邻域图谱构建；动态过程研究	低至中等（每个诱饵均需工程化构建）
交联质谱（XL-MS）	蛋白质内部或蛋白质之间的空间邻近/接触关系	提供结构约束信息；可捕获瞬时接触	数据分析复杂；蛋白质组覆盖度较低；样本特异性强	结构或上下文拓扑分析	低（技术专业化程度高）
共分级分离/质谱（CF-MS）	天然蛋白复合物的共洗脱行为	无需标记；适用于天然复合物分析	实验耗时耗力；推断过程复杂；灵敏度有限	全局蛋白复合物图谱构建	中等
CETSA/TPP	共稳定性或共聚集特征谱	无需标记；在天然条件下进行	对蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）为间接检测；受溶解度限制	靶点结合验证；热稳定性偏移分析	中等
dfPPI（表伴侣组学）	通过内源性表伴侣体作为多重诱饵捕获的网络水平相互作用重编程	内源性检测；无需标记；一次捕获可检测数千种功能异常的蛋白质相互作用；提供通路/网络层面的读出信号；适用于组织样本；适合队列研究	仅适用于疾病背景；需要专用探针（PU-beads, YK5-B）；不适用于通用蛋白复合物发现	疾病背景下相互作用组的重塑分析、通路优先级排序、假设生成	高（可实现数百个样本的分析）

表1：PPI-作图方法与dfPPI的比较。 请点击此处下载该表格。

补充文件1：Spectronaut完整参数设置。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方案利用dfPPI平台，可在天然生物样本中绘制功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）图谱。与传统方法通过丰度或表达变化推断功能障碍不同，该平台通过使用靶向表型伴侣体（epichaperome）的探针进行亲和纯化，结合无标记强度定量质谱技术，在结构层面捕获网络重构，从而分离出疾病特异性的相互作用蛋白。尽管当前应用主要集中于死后脑组织，但该方法广泛适用于其他类型的样本和疾病模型，包括癌变、神经退行性疾病及免疫功能障碍模型中的培养细胞和组织^{16,17,18,19,20,22,23}。

dfPPI 依赖于能够通过动力学选择表伴侣体并捕获其结合互作分子的探针。PU-珠（源自表伴侣体结合化学型如 PU-H71/PU-AD）以非共价但长停留时间的方式结合由 HSP90 核心组织的表伴侣体，这是对表伴侣体构象而非传统伴侣蛋白复合物实现动力学选择性的典型特征²³。YK5-B 是一种生物素标记的共价探针，靶向表伴侣体内的 HSC70，可在细胞裂解前实现细胞内捕获，从而保留内源性蛋白质相互作用¹⁷。选择性源于疾病相关翻译后修饰（PTMs），这些修饰重塑了 HSP90/HSC70 的构象与结合口袋化学性质，并稳定表伴侣体复合物^14,23,43,44；这些改变使 PU 型非共价探针表现出高亲和力和缓慢的解离速率（k_off）⁴⁵，同时也支持 HSC70 靶向的 YK5-B 实现共价捕获，从而在动力学上保留表伴侣体复合物，并共分离其直接和间接互作分子，用于后续 LC-MS/MS 分析。在实际应用中，PU-珠适用于裂解液或匀浆样本的工作流程，而 YK5-B 支持活细胞捕获；两种方法均可保留依赖于细胞环境的复合物，这些复合物可通过 LC-MS/MS 鉴定，并用于下游 dfPPI 分析。

对于dfPPI技术，需要具备化学方面的专业知识以合成捕获探针。然而，这一要求并非dfPPI所独有：目前广泛使用的蛋白质相互作用研究方法（如AP-MS、邻近标记、XL-MS）同样依赖于专业技术，例如克隆/构建带标签的诱饵蛋白、稳定细胞系的建立、标记/交联条件的优化，以及复杂的生物信息学分析流程。相比之下，dfPPI无需进行基因操作和诱饵蛋白的过表达，可直接应用于原代细胞或组织（包括稀有的临床生物样本），并采用蛋白质组学核心实验室中常规使用的标准亲和捕获与液相色谱-质谱（LC-MS）工作流程。为了降低技术应用门槛，经验证的PU磁珠及匹配的对照磁珠可通过与Chiosis实验室签署材料转移协议（MTA）获得，且相关操作与质量控制步骤已在步骤1.3和1.4中详细说明。最后，dfPPI配套的网络分析工具可实现所需的统计分析及通路/网络结果输出，显著减轻了生物信息学分析负担（尤其适用于无编程背景且仅具备基础生物信息学技能的用户）。

AP-MS、XL-MS、邻近标记、共分级分离以及CETSA/TPP各自回答不同的科学问题（直接结合蛋白、空间邻近性、邻域标记、共组装或热共稳定性）。当研究目标是描绘疾病中内源性、依赖于特定环境的相互作用重连网络时——尤其是在无法进行基因标记的原代组织或大规模临床队列中，并且希望从单次捕获获得通路或网络水平的读出结果时，dfPPI是首选方法。dfPPI利用表型伴侣复合体（epichaperomes）作为多重诱饵，在一次免疫共沉淀中捕获多个蛋白质之间协调发生的相互作用变化，从而实现从原始生物材料中进行可扩展的LC-MS/MS鉴定和以通路为中心的分析。在实际应用中，dfPPI可为后续以诱饵为中心的功能验证实验（例如针对特定节点蛋白的AP-MS）提供线索，而传统方法则可用于进一步解析由dfPPI鉴定出的蛋白复合物的拓扑结构（如直接接触关系、空间约束）。参见表1中的并列比较。

多个关键步骤影响该实验流程的成功。首先，高质量的蛋白质提取物至关重要。这要求对组织或细胞进行谨慎处理——理想情况下应速冻并储存在 -80 °C——以最大限度减少蛋白降解并保持天然复合物的完整性。蛋白酶和磷酸酶抑制剂的使用是必不可少的：在此检测中，作为功能性"诱饵"的变构伴侣体（epichaperome）的完整性依赖于核心组分（如 HSP90^23,43）的特定翻译后修饰。例如，Ser226 和 Ser255 的磷酸化对于稳定变构伴侣体的构象并维持其支架功能至关重要²³。若省略磷酸酶抑制剂，则可能导致结构崩解并丧失生物学特异性。

另一个关键因素是PU磁珠亲和基质的质量和处理方式。磁珠应保存在100%异丙醇中，并于-20 °C条件下储存，且应在规定的活性窗口内使用，理想情况下在1-2年内使用完毕。在进行关键实验前应验证磁珠的活性，因为陈旧的磁珠可能表现出结合能力下降或非特异性结合增加。孵育时间和蛋白上样量也必须优化：孵育时间过长可能增加背景信号，而蛋白上样量不足则可能影响检测深度。我们建议孵育时间为3小时，并通过预实验进行拉下试验，以针对每种样本类型校准合适的上样量。

本方案兼容两种消化策略：磁珠上消化和胶内消化。虽然两种流程均可获得可重复的结果，但各有优缺点。胶内消化可能引入角蛋白等污染物，并需要额外的操作步骤。磁珠上消化简化了实验流程，当样本通量或起始量受限时通常更受青睐。然而，蛋白酶的用量需根据总蛋白投入量进行校准：尽管本方法设计使用750 ng胰蛋白酶，但如果蛋白含量较高，则可能出现消化不完全，导致漏切位点增加和肽段回收率降低。建议评估消化效率，并相应调整酶的用量。所有消化步骤均应在低吸附管中进行，并使用新鲜配制且无污染的试剂，以确保实验的一致性并尽量减少背景干扰。

每针LC-MS进样的蛋白上样量取决于捕获流程、肽段产率和色谱柱容量。对于在标准纳米液相C18色谱柱（内径约50–75 µm，长度约15–25 cm）上分析的磁珠上消化样品，我们通常每针上样300–500 ng；当上样量超过约400–500 ng时，未观察到检测性能提升，而更高上样量可能导致离子抑制和色谱峰展宽。对于凝胶内流程（例如每泳道切取5个胶条），我们通常每个重复每条胶段进样脱盐后样品的约25%，并保留约50%作为备份，以备需要时重新进样。在所有情况下，进样前均需测定肽段浓度，使用质控消化样品验证线性响应，并优化上样量，以在避免超载的同时维持良好的色谱峰形和肽段鉴定深度。

基于DIA的无标记定量技术因其可重复性和深度而在蛋白质组学中被广泛应用⁴⁶。然而，在亲和捕获实验（例如本研究）中，目标是鉴定与表伴侣体支架相互作用的蛋白质，而非测量全局蛋白质丰度，因此诸如MaxLFQ之类的归一化策略并不适用。这些方法假设输入样本均匀且整个蛋白质组具有相似性，而本实验方案固有的富集步骤破坏了这些前提条件。相反，质谱信号强度值或MS/MS谱图计数已足以提供具有生物学意义的定量数据，用于后续功能分析。这些指标反映了在不同条件下蛋白质与表伴侣体之间相互作用的相对强度或频率。如先前研究^16,17,18,20所示，这些数值非常适合用于系统水平的相互作用组分析（如dfPPI），可在无需全蛋白质组归一化的前提下识别发生改变的生物学通路。基于强度或MS/MS的定量方法保留了由疾病或处理所引入的真实生物学变异，从而实现对蛋白质相互作用网络功能障碍的准确且稳健的描绘。

尽管亲和捕获相比全裂解液缩小了搜索范围，但dfPPI下拉样品中仍包含数百至数千种蛋白质，其丰度动态范围广泛，并伴有共富集的背景蛋白。在队列规模的比较研究中，数据依赖性采集（DDA）的随机前体离子选择会导致不同运行间出现缺失值，以及对低丰度互作蛋白的采样不一致¹⁸。数据非依赖性采集（DIA）则在预设的质量窗口内系统性地对所有离子进行碎裂，从而实现更深度的检测、更少的缺失值以及更高的运行间重复性——当后续分析聚焦于通路或网络水平而非单个蛋白质时，这些特性尤为关键。因此，我们在dfPPI研究中将DIA作为标准方法。

与所有亲和捕获方法一样，非特异性蛋白结合是一个固有的需要考虑的因素。蛋白质可能由于对树脂的黏附性、高丰度或聚集而被保留下来。尽管此类非特异性相互作用蛋白可能出现在下拉洗脱液中，但它们的存在并不会影响本方案下游分析目标的实现¹⁷。dfPPI 工作流程的设计目的并非确定二元相互作用，而是从系统层面提取蛋白质相互作用重布线的模式。对差异性相互作用蛋白进行功能富集分析，并利用基于网络的统计方法揭示通路水平上的协调性改变。如先前研究所示¹⁷，这种系统层面的方法可最大限度地减少孤立的非特异性蛋白的影响，从而从群体水平的数据中得出可靠的生物学结论。

与传统的相互作用组作图方法（如共免疫沉淀、邻近标记或交联）相比，dfPPI 平台具有独特优势：它能够在与疾病相关的条件下捕获功能性的相互作用组重塑，而无需对诱饵蛋白进行工程化改造或过表达。由于该方法可分离在超分子表分子伴侣复合体周围形成的蛋白质复合物，因此能够检测到在健康系统中不存在的新型蛋白质组装体，从而有助于发现新的疾病驱动因子。该方法可扩展并适用于不同组织、物种和疾病状态，已在癌症和神经退行性疾病的蛋白质组重塑研究中提供了独特的见解。因此，该方法为揭示人类疾病中功能网络的紊乱提供了一种强有力的工具。

除了上述示例外，dfPPI 技术还适用于以下方向：（i）应用于大规模临床队列，根据网络功能障碍对患者进行分层，并发现能够反映靶点结合和通路校正的药效学生物标志物；（ii）进行纵向采样（如治疗前/后、疾病分期）以追踪网络重连轨迹并预测治疗响应者；（iii）与磷酸化蛋白质组学及其他关注翻译后修饰（PTM）的组学技术整合，将相互作用状态的变化与上游信号传导关联；（iv）利用显微切割区域（如肿瘤-正常组织交界区、脑区亚区）的空间分辨捕获技术，描绘局部网络的病理生物学特征；（v）开展扰动筛选（基因或化合物干预），通过 dfPPI 的检测结果识别可干预的关键节点及作用机制；（vi）结合图模型或人工智能建模，从 dfPPI 图谱中学习疾病特异性的网络特征，用于预后判断与治疗策略设计。在方法学层面，微型化、自动化（例如 96 孔板格式）以及标准化的质量控制将推动高通量流程在转化研究和临床试验中的应用。最后，dfPPI 的输出结果可引导针对性的后续实验——如亲和纯化-质谱（AP-MS）、交联-质谱（XL-MS）或邻近标记技术——以解析优先模块的拓扑结构，凸显该方法在互作组学工具箱中的互补性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250	有毒，易燃
乙腈（ACN）Optima	费舍尔科技	A955-1	液相色谱-质谱级（易燃）
Affi-Gel 10 活化亲和层析介质	伯乐	1536099	用于制备 PU-珠粒和对照珠粒（易燃）
碳酸氢铵（ABC）	Sigma-Aldrich	09830-500G
Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLC 色谱柱	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
放射自显影胶片	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Western 印迹后化学发光信号检测的替代方法
Biomasher 微型组织匀浆器	DWK 生命科学 Kimble	7496250010	用于匀浆冷冻脑组织以提取蛋白质
溴酚蓝	费舍尔生物试剂	BP115-25
适用于 1.5 mL 管的离心机	艾本德	5424
适用于 1.5 mL 管的离心机	艾本德	5417R	带温度控制
适用于 15–50 mL 管的离心机	艾本德	5810R	用于锥形管
ChemiDoc MP 成像系统	伯乐	17001402	用于凝胶/印迹的密度测定
色谱柱恒温箱	Sonation GmBH，德国	ES071/ES072	将纳米液相色谱柱维持在 50 °C 以保持保留时间稳定
锥形管（15 mL）	费舍尔科技	352096
对照珠粒	Chiosis 实验室	N/A	Taldone 等（PMID: 21459002）
考马斯亮蓝 G-250 染色剂（生物安全型）	伯乐	1610786
避光 Eppendorf 管（1.5 mL）	USA 科学	1415-2507
二硫苏糖醇（DTT）	罗氏	10197777001	刺激性
Easy nLC 1000	赛默飞世尔科技	Easy nLC 1000	与 Q Exactive HF 联用的液相色谱系统
Empore 固相萃取盘	3M 公司	2215-C18（十八烷基）	用于制备 StageTips 以进行肽段脱盐；用 100% 甲醇活化
增强型化学发光（ECL）试剂盒	赛默飞世尔科技	32209
Eppendorf 管（1.5 mL）	费舍尔科技	05-408-129
甲酸（FA）Optima	费舍尔科技	A117-10X1AMP	液相色谱-质谱级
g:Profiler（e111_eg58_p18_f463989d）	BIIT 集团-塔尔图Ülikool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	通路富集分析
甘油	费舍尔生物试剂	BP229-1	分子生物学级
甘氨酸	费舍尔生物试剂	BP381-5	结晶粉末
山羊抗小鼠 HRP 标记二抗（RRID: AB_2619742）	Sothern Biotech	1030-05	H90-10 抗体的二抗
山羊抗兔 HRP 标记二抗（RRID: AB_2632593）	Sothern Biotech	4010-05	HSP90α 和 HOP 抗体的二抗
山羊抗大鼠 HRP 标记二抗（RRID: AB_2716837）	Sothern Biotech	3030-05	HSC70 抗体的二抗
加热式轨道摇床	艾本德	ThermoMixer C（2231001127）
HeLa 蛋白酶解标准品-Pierce	赛默飞世尔科技	88329	用于液相色谱-质谱质量控制评估
HOP 抗体（RRID: AB_10828378）	细胞信号技术	5670	用于 PU-珠粒质量控制
HSC70 抗体（RRID: AB_10617277）	Enzo	SPA-815	用于 PU-珠粒质量控制
HSP90（H90-10）抗体（RRID: AB_854214）	StressMarq	SMC-107	用于 PU-珠粒质量控制
HSP90 alpha 抗体（RRID: AB_303423）	Abcam	Ab2928	根据第 1.2 节进行归一化
人源细胞系：ASPC1（RRID:CVCL_0152）	ATCC	CRL-1682	对照细胞系，表伴侣体低/伴侣蛋白高
人源细胞系：MDA-MB-468（RRID: CVCL_0419）	ATCC	HTB-132	对照细胞系，表伴侣体高/伴侣蛋白高
ImageJ（v1.54p）	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	密度测定
碘乙酰胺（IAA）	Sigma-Aldrich	I1149-5G	有毒
低蛋白吸附微量离心管	Sarstedt	72.706.600
Lys-C 蛋白酶	普洛麦格	VA1170	液相色谱-质谱级
氯化镁	Sigma-Aldrich	63068	分子生物学级
MaxQuant（v2.1.1.0）	马克斯·普朗克生物化学研究所	https://www.maxquant.org/	MaxDIA 工作流程，用于肽段/蛋白质鉴定及基于无标记强度的定量
甲醇	费舍尔化学	A454-4	高效液相色谱级，易燃，有毒
迷你蛋白酶抑制剂混合片剂（Complete）	罗氏	4693124001
迷你转印电泳转移槽	伯乐	1703930
迷你凝胶电泳槽	赛默飞世尔科技	A25977	用于 Novex 预制胶
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽	伯乐	1658004	用于 Mini-PROTEAN 预制蛋白胶或手工灌胶
Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白胶（4–20%）	伯乐	4561094
NanoDrop	安捷伦	BioTek Synergy H1	用于液相色谱-质谱进样前估计肽段浓度
NanoElute 2	布鲁克	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	用于 diaPASEF 工作流程
Nanospray Flex 离子源	赛默飞世尔科技	ES071	用于纳喷电喷雾电离耦合
New Objective PicoTip 发射器/PicoFrit SELF/P	New Objective 公司	PF360-75-10-N-5	填充 C18 悬浮液，长度为 20 cm
硝酸纤维素膜	Cytiva Amersham	10600006
脱脂奶粉	实验室科学	M0841
Novex 8% Tris-甘氨酸预制胶	赛默飞世尔科技	XP00080BOX
NP-40	罗氏	11754599001
磷酸盐缓冲液（PBS）	吉比科	10010023
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂	罗氏	4906837001
派斯蛋白 BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225
塑料容器	费舍尔科技	FB0875711A
平台式摇床	康宁	6705
氯化钾	费舍尔生物试剂	BP366-1	白色晶体
PowerPac 通用电源	伯乐	1645070
Precision Plus Protein Kaleidoscope 预染蛋白标准品	伯乐	1610375
PU-珠粒	Chiosis 实验室	N/A	Taldone 等（PMID: 21459002）
Q Exactive HF Orbitrap 质谱仪	赛默飞世尔科技	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	用于 DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ，3 µm	Dr. Maisch GmbH，德国	R13.aq	用于肽段分离的硅胶介质；粉末/甲醇（1:3, v/v）悬浮液
旋转装置（翻转式旋转器）	Barnstead 国际	400110
Sep-Pak C18 小柱（100 mg）	沃特世公司	WAT023590
十二烷基硫酸钠（SDS）	费舍尔生物试剂	BP166-500	电泳级
超声波破碎仪	布鲁森	2510
SpectraMax Paradigm 多功能微孔板读板仪	分子器件	SpectraMax Paradigm
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	directDIA 工作流程
SpeedVac 浓缩仪	赛默飞世尔科技	Savant SPD111V
抽吸式真空泵	康德乐健康	CDL-65651-320
TimsTOF HT 质谱仪	布鲁克	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	用于 diaPASEF 分析
三氟乙酸（TFA）Optima	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	液相色谱-质谱级（腐蚀性，易燃）
Tris	费舍尔生物试剂	BP152-5	结晶粉末；分子生物学级
Tris，pH 6.8（1 M）	Teknova	T1068
Tris，pH 7.5（1 M）	费舍尔生物试剂	BP1757-500	分子生物学级
Tris 缓冲盐溶液（20x TBS）缓冲液	VWR，生命科学	97064-338
Tris-甘氨酸-SDS（TGS 10x）电泳运行缓冲液	费舍尔生物试剂	BP13414	电泳
胰蛋白酶	普洛麦格	V5111	测序级
胰蛋白酶金	普洛麦格	V5280
吐温 20	费舍尔生物试剂	BP337-100
尿素	Sigma-Aldrich	U0631-500G
涡旋振荡器	费舍尔科技	02-215-414
水	费舍尔科技	W6-1	液相色谱-质谱级