卒中临床前评估网络多中心实验室溶栓治疗血栓性脑卒中模型：TE-MCAo

摘要

为了模拟血栓栓塞性卒中，将由异源大鼠血液制备的栓子注入大脑中动脉，随后进行全身溶栓治疗以实现血管再通。该模型版本经过优化，适用于多实验室网络研究，并支持对多种候选治疗药物的测试。

摘要

目前的转化型啮齿类动物卒中模型通过使用尼龙线栓、注入栓子、血管内凝血酶或血管周围内皮素-1来诱导大脑中动脉闭塞（MCAo），以模拟人类卒中。在这些方法中，继以溶栓治疗的血栓栓塞注射法最能模拟人类患者中观察到的神经炎症事件，可能优于目前最广泛使用的惰性尼龙线栓法。然而，领先的单一实验室所采用的标准血栓栓塞性模型往往耗时较长，结果变异较大，且需要较高的操作技巧才能掌握。为克服这些局限性，我们开发了一种血栓栓塞性MCAo模型，该模型通过靶向血管闭塞，并采用静脉溶栓实现再通，从而模拟临床实践中所应用的全身性溶栓治疗。为减少实验动物使用数量，我们建立了一种方法，可将供体动物的血液储存起来，用于后续为多个受试动物制备栓子。我们采用预制的Doccol微导管，通过预先将血栓栓子装入微导管，再将其插入颈内动脉，从而简化了血栓制备与注射过程。为实现血管再通，我们以1.5 mg/kg剂量静脉输注替奈普酶（Tenecteplase）。为提高可重复性，我们制定了标准操作规程，并进行了现场测试，同时配套开发了培训视频和实操外科培训课程。该模型采用标准手术入路，所有熟悉广泛使用的尼龙线栓模型的研究人员均可快速掌握。将微导管插入远端颈内动脉并避开翼腭动脉的操作方式，与尼龙线栓插入方法类似。卒中后的恢复及评估可采用常规的行为学、影像学和组织学检测方案。该模型为希望开展具有可控再通特性的血栓栓塞性MCAo研究的研究人员提供了一种实用、可重复且易于推广的技术路径。

引言

中风是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因¹许多患者可从静脉溶栓治疗中获益，部分患者可从机械取栓中获益。由于并非所有患者都能在溶栓或取栓治疗的时间窗内到达医院，且并非所有患者都能实现完全康复，因此仍迫切需要进一步开发其他或辅助性的脑保护治疗手段。目前最常用的啮齿类动物缺血性卒中模型是通过单丝线栓法阻塞大脑中动脉（MCA）并随后实现完全再灌注。该模型模拟了大血管闭塞（LVO），适用于研究接受成功完全机械取栓的大面积卒中患者。然而，该模型仅能反映临床卒中的一小部分情况。相比之下，更多患者卒中是继发于动脉粥样硬化的血栓栓塞性卒中原位 动脉粥样硬化斑块破裂或系统性疾病所致的动脉栓塞），仅采用全身溶栓治疗，而尼龙线模型无法模拟这一情况^2,3此外，尼龙丝线MCAo模型缺乏血栓性闭塞相关的炎症级联反应^4,5采用血栓栓塞后给予全身溶栓治疗的动物模型，能够代表许多脑卒中患者体内发生的病理生理过程和基本生物学变化^4,6然而，迄今为止，啮齿类动物血栓栓塞性卒中模型被认为具有较高的复杂性且难以重复。在配备专业研究人员的独立实验室中，该模型虽可实现相对良好的可重复性，但因其局限性，难以广泛应用于多实验室合作项目。

本文提供了经改进和标准化的血栓栓塞性大脑中动脉闭塞（TE-MCAo）模型及其随后进行全身溶栓的详细实验方案。具体而言，我们简化了血栓制备流程，标准化了将血栓装入导管的操作，并验证了该模型在多实验室联合研究中的可扩展性。本模型最初为“卒中临床前评估网络”（SPAN）开发，但我们希望该模型也可适用于任何希望开展大规模临床前网络化试验以评估新型候选治疗手段的研究团队。在研究期间，采用本标准化模型，每个研究单位每天可对6只大鼠成功诱导TE-MCAo。

由于许多有前景的神经保护剂从临床前研究到临床实践的转化屡次失败，SPAN 及类似的网络应运而生⁷。2019年，美国国家神经疾病与卒中研究所（National Institutes of Neurological Disorders and Stroke, NINDS）启动了 SPAN⁸。SPAN 旨在通过集中化设盲、随机化和自动化集中结果分析来减少偏倚，从而更有效地筛选潜在治疗药物。在前两次试验中，SPAN 1 采用了尼龙丝线模型，因为所有参与实验室此前已在使用该模型，且该模型易于实施⁹。为了更真实地模拟血栓栓塞和溶栓治疗的多个方面，SPAN 致力于建立本文所述的 TE-MCAo 模型。该模型将有助于正在从尼龙丝线模型过渡到 TE-MCAo 模型的临床前外科研究人员。我们建议临床前实验室在 MCAo（或 TE-MCAo）术后24/48小时采用影像学技术（如磁共振成像，magnetic resonance imaging, MRI）确认脑卒中的存在。

SPAN 网络已在先前的研究中得到全面描述⁹，所有 SPAN 标准操作程序（SOP）均可在 SPAN 网站获取。简而言之，该网络由一个协调中心（CC）进行管理，负责药物分发、数据质量控制、方案依从性验证以及网络间的沟通。所有 SOP 均由协调中心起草，并经指导委员会审核后批准。在 SPAN 项目中，所有啮齿类动物在抵达研究实验室时即被植入兼容 MRI 的条形码耳标，并将所有实验动物登记至 SPAN 研究电子数据采集（REDCap）数据库中。动物的随机分组由协调中心使用按实验地点和性别分层的随机表完成。在 SPAN 1 和 SPAN 2 中，六家参与的研究实验室共同对潜在治疗药物的疗效进行了考察。所有测试药物均由协调中心封装于外观相同的药瓶中，并在项目开始时运送至各研究实验室。

方案

所有参与的 SPAN 实验室，包括位于南加州大学的协调中心，均遵循美国国立卫生研究院（NIH）和美国实验动物管理协会（AAALAC）关于动物人道与伦理待遇的指南。各参与单位均获得了当地实验动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 血栓制备

注意：所有血液和血栓的处理均应遵循当地机构关于生物危害物的所有指导原则。所有接触过血液的材料，应作为生物危害废物丢弃，或对手术器械而言，需通过高压灭菌器彻底清洁和消毒。为了减少本试验中血液供体动物的使用，我们开发了一种方法，用于储存供体血液，并根据需要利用该血液制备血栓栓子。

1. 从动脉抽取新鲜供体血液至1.5 mL微量离心管或小儿用乙二胺四乙酸（EDTA）微量管中，仅填充至500 µL刻度线。
   注：我们倾向于采用股动脉插管方式进行采血，因为股动脉管腔直径较大，便于插管；且为双侧分布，可进行两次独立采血；对啮齿类动物而言，该手术具有可存活性。据我们经验，血液可在4 °C下保存4周。
2. 向500 µL储存的抗凝血液中加入1 mL氯化钙（CaCl₂）溶液（5 mg/mL） 。
3. 在使用CaCl₂逆转抗凝作用后，立即通过轻柔抽吸将血液从微量离心管吸入100 cm长的PE-50导管中。
   注：延迟操作将导致血液在吸入PE-50导管前即发生凝固。
4. 将盘绕的导管置于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在台式恒温箱内37 °C孵育2小时。
   注：将培养皿置于开启的加热板上会导致加热不均，结果不一致。
5. 2小时孵育结束后，立即将充满血液的PE-50导管转移至4 °C保存。该样本在后续20至72小时内仍可使用。

2. 导管装载

1. 将盘绕的PE-50导管（内径：0.58 mm）连接至装有生理盐水的3或5 mL注射器，轻轻推动注射器，将血栓排出至含有PBS的培养皿中。
   注意：此步骤可能需要较大的力量。在推注时需在连接处施加反向压力，以确保导管与注射器不会在推出过程中脱开。如有需要，可将PE-50导管剪成较短的节段（10–50 cm），以方便推出。
2. 使用刀片将血栓切成约6 cm长的节段。
3. 通过将每个血栓节段轻柔地吸入PE-50导管并完全推出5次，对血栓进行清洗。
4. 接着，将血栓轻柔地吸入PE-10导管（内径：0.279 mm）并完全推出15次，以进一步清洗。
   ​注意：如果在此步骤中频繁发生血栓断裂，建议使用手术显微镜或手术放大镜 进行放大观察，以确保血栓沿导管开口方向被吸入。
5. 可选步骤：使用伊文思蓝染色以可视化血栓
   1. 配制4%伊文思蓝的1×PBS溶液。
   2. 取200 µL的4%伊文思蓝加入盛有10 mL 1×PBS的培养皿中。此为较高浓度溶液，记为伊文思蓝稀释液#1。
   3. 取400 µL伊文思蓝稀释液#1，混入另一盛有20 mL 1×PBS的培养皿中。此为稀释后的溶液，记为伊文思蓝稀释液#2。
   4. 将血栓置于较高浓度的伊文思蓝培养皿溶液（稀释液#1）中1秒，随后转移至稀释的伊文思蓝培养皿（稀释液#2）中。
6. 采用湿对湿法，将一个已清洗的血栓装入预制的微导管（内径：0.2 mm，外径：0.360 mm，长度：300 mm，连接雌性鲁尔锁接头）中，避免引入空气栓子。
   注意：建议在此步骤中使用放大设备（例如2.5倍放大镜）。
7. 当血栓完全装入后，推出适量血栓，使微导管内恰好保留5.0 cm长的血栓，用刀片切除多余部分。
   注意：根据所需脑卒中模型的大小，可调整装入血栓的长度。
8. 从微导管尖端起16 mm处做标记，用于指示导管在颈总动脉分叉处应向前推进的管腔内距离。

3. 动物手术与麻醉

1. 使用30:70的氧气:一氧化二氮混合气体中含4%异氟烷诱导麻醉，并以相同气体混合物中含1-2%异氟烷维持麻醉。
2. 术中为维持动物舒适，皮下注射卡洛芬5 mg/kg，腹腔注射阿托品0.05 mg/kg。
   注：许多外科医生会在切口部位注入1.0 mL布比卡因（2.5 mg/mL）。
3. 手术全程使用直肠温度探头控制的加热垫，将体温维持在37 ± 0.5 °C。
4. 术后至少3天内，每日一次或两次皮下注射卡洛芬5 mg/kg或美洛昔康1 mg/kg，作为镇痛治疗。

4. 供体血液的采集

1. 采集供体血液 通过 股动脉插管。匹配供体与受体的生物学性别。
2. 若血液需在同一天使用：
   1. 准备三个1.5 mL离心管。标记每支离心管 用永久性实验室记号笔在500 µL刻度处标记。
   2. 准备三套PE-50导管，每套长100 cm，并连接至1.0 mL注射器 通过 23 号钝针
3. 若血液需保存以备后续使用，请准备六支儿科用EDTA微量采血管，并将管盖稍拧松，以便后续使用。
4. 准备一段长度为10.0 cm的PE-50导管，一端用带橡胶头的夹子夹住，另一端切成钝斜面。
   1. 制作带橡胶护套的止血钳时，将标准止血钳的一侧钳臂插入PE-100导管中，并修剪至合适长度。另一侧同样操作。
   2. 为使PE-50管末端呈钝斜面，首先以斜角剪切管端，然后使用显微剪修剪掉斜面尖端的最顶端部分。
      ​注意：插入后必须去除针尖，以避免刺破动脉后壁；但若去除过多针尖部分，将丧失斜面效应，导致导管难以插入血管腔内。
5. 在股动脉上进行标准的切开术。
6. 准备实验动物（剃除大腿内侧区域毛发），将其置于手术台上呈仰卧位。用70%乙醇擦拭皮肤3次，再用聚维酮碘或其他消毒液擦拭1次，进行皮肤消毒。随后用聚维酮碘或其他消毒液与70%乙醇交替擦拭3轮，进行皮肤去污处理。
7. 使用软性固定装置以展开的方式固定后肢。
8. 在大腿内侧腹股沟与腿部自然交界褶皱处做一长约1.5–2 cm的纵向切口。该切口将垂直于股动脉的预期解剖走行方向。
9. 使用钝性分离法，仔细分离至股血管。小心地将股动脉与同束走行的股静脉和神经分离。
10. 用5-0丝线结扎股动脉远端，并利用缝线的线尾通过止血钳在远端施加轻微张力。
11. 尽可能向近端游离股动脉，沿动脉追踪至其腹膜后起始处。将5-0丝线松松地环绕股动脉一周，并利用线尾再次对动脉近端施加轻柔张力。此时不要打紧丝线结。此张力可在动脉切开后实现止血。
    ​注意：可使用动脉瘤夹将环进一步向近端移动。
12. 在距离近端缝合环约2/3处，将一根丝线缝线置于动脉下方，并使用显微剪刀在松解缝线的远端做一小段动脉切口。插管完成后，将该松解缝线结扎，以固定管腔内导管。
13. 用尖头镊子提起动脉切口的顶端开口，将钝头斜面导管插入切口。尽可能向近端推进导管。
    ​注意：导管与血管内壁之间可能存在摩擦。以下两种方法可帮助缓解此问题：1）在将导管插入血管前，用腿部内侧的浆液涂抹导管末端外表面；2）使用钝头带槽镊子夹住血管外壁，同时推进导管。此举可防止血管随导管一同向前移动。
14. 当导管尖端已推进至近端环几乎到位时，松开该缝线尾端的张力。导管与血管内壁的紧密贴合应可防止出血。
15. 推进导管至适当位置，确保在收紧松散环时能够将导管包裹其中。轻轻收紧缝线，注意不要过度收紧而导致导管闭塞。同时，由于该导管段呈锥形，需确保缝线未位于导管的斜面处。
16. 松开橡胶包被的夹子，导管应立即充满血液。
17. 将开放的离心管或儿科EDTA微量管装满，每种收集容器中放置的液体不得超过500 µL。
18. 微管充满后，从股动脉中移除PE-50导管，结扎近端，并用间断的5-0 Prolene缝线关闭切口。
19. 若需后续使用血液，将已装满的儿童EDTA管盖上管帽，并于4 °C保存。
20. 若血栓需用于同一天，继续进行步骤 1.2 如上所述。
21. 立即对剩余的离心管重复上述操作。
22. 如果仅进行单侧插管，动脉采血供体在麻醉恢复后可被送回动物房。对侧股动脉可在之后进行插管，但在完成双侧股动脉插管后，应根据IACUC规定对供体实施安乐死。

5. TE-MCAo

注意：TE-MCAo 方法采用标准的颈总动脉暴露术式。麻醉方式及暴露术式的选择由使用者决定。本方案从外科医生已分离出颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）的步骤开始。

1. 暴露颈总动脉（CCA），并用3-0丝线牵引。同样处理颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。
2. 使用结扎线或电凝法暴露并阻断枕动脉。
3. 暴露翼腭动脉（PPA），并进行牵引或阻断。
   注意：经验足够时，此步骤可省略。建议初学者始终执行此步骤。
4. 通过轻柔牵拉，将ECA和ICA调整为"T"形配置。
5. 待上述所有步骤完成后，再结扎CCA的牵引线。
6. 使用显微剪刀在ECA上做动脉切口（Zea Longa CCA开放法¹⁰）。
7. 采用第4.4.2步所述的钝斜面法，制备已装入的微导管尖端（内径：0.2 mm，外径：0.360 mm，长度：300 mm，连接至雌性鲁尔锁接头）。
8. 将预装血栓的微导管小心插入ECA。松开ICA的固定环，直视下将微导管沿颅内方向推进至颈动脉分叉处16 mm，以避免意外进入颅外PPA。
   注意：若导管倾向于进入CCA，可用尖头棉签轻轻施加压力，帮助导管转向进入ICA。
9. 使用3-0丝线将腔内微导管固定于ICA和CCA，注意避免过度收紧。
10. 使用电动注射泵，以10 µL/min的速度向1 mL注射器中注入20 µL液体，持续2分钟。
    注意：通常注射泵最初不会推进，需待压力足够升高后方可启动。
11. 使用相同的泵参数，再注入20 µL无菌生理盐水。
    注意：在采用激光散斑成像研究血流时，我们发现使用20 µL冲洗液的成功率为100%。
12. 取出微导管，并在动脉切口近端用缝线永久结扎ECA。移除所有固定环。仔细观察是否有渗血，必要时用额外结扎线加固。
13. 使用钉合器或连续缝合的5-0聚丙烯缝线暂时关闭皮肤切口。
14. 将动物从麻醉状态中移出，放入温暖的恢复笼中。
15. 可选：实验室可使用激光多普勒血流仪确认大脑中动脉（MCA）是否成功闭塞。或者可在术后24或48小时获取磁共振成像，以确认并量化脑梗死范围。
    注意：许多使用者倾向于在手术结束后皮下注射1.5 mL生理盐水或乳酸林格液。

6. 全身溶栓治疗

注意：可购买替奈普酶（TNK，1.5 mg/mL）用于全身溶栓治疗。使用者也可选择其他溶栓药物。每瓶50 mg的药品用50 mL蒸馏水重新溶解后，精确分装2.5 mL至3.0 mL小瓶中。分装后的样品可在-20 °C下冷冻保存以备后续使用。重组组织型纤溶酶原激活剂在-20 °C下保存的稳定性为60天¹¹。

1. 为每个实验对象解冻一份冷冻保存的TNK，在室温下解冻约15分钟。
2. 使用1 cc注射器，准确抽取1.5 mg/kg剂量。例如，一只300 g的大鼠需要0.45 mg。
3. 重新麻醉动物，并移除临时的皮肤闭合。
4. 暴露颈外静脉的任意一支分支。
   注意：如果实验室更熟悉尾静脉注射，也可使用尾静脉。我们倾向于使用颈外静脉，因为SPAN外科医生对颈外静脉游离更为熟练，且在我们的线栓模型中该操作是常规步骤。
5. 使用30或32 G针头，通过直接穿刺将TNK注入静脉。
   注意：初学者可能希望用3-0丝线环将静脉隔离固定。随着操作熟练，此步骤将不再必要。
6. 使用间断的5-0 Prolene缝线或其他非吸收性缝线关闭切口。
7. 将动物放回恢复笼中，操作同步骤5.14。

7. 统计学方法

1. 进行描述性统计时，对于正态分布的数值数据，使用均值和标准差；对于非正态分布的数据，使用中位数和四分位距。分类数据以频数分布形式呈现。在假设检验中，对于符合正态分布的参数数据，根据情况选用 t 检验或方差分析（ANOVA）；否则，不进行假设检验。

结果

图 1：供体动物的血液采集与血栓制备。 通过股动脉插管从供体动物采集血液，并转移至含 EDTA 的微量离心管中（可保存长达 4 周）或不含 EDTA 的管中（当日使用）。为制备血栓，向储存的血液管中加入氯化钙溶液，并立即吸入 PE-50 导管中。将盘绕的 PE-50 管置于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 37°C 的台式烘箱中孵育 2 小时。孵育 2 小时后，将充满血液的 PE-50 管立即转移至 4°C 保存。详见实验方案第 1 节。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2： 将血栓装入导管以进行注射。（A）在MCAo手术当天，将血栓从PE-50导管中挤出至含有PBS的培养皿中。（B）在培养皿中，使用剃须刀片将血栓修剪至约6 cm长。（C）通过将血栓吸入PE-50导管并推出5次，再吸入PE-10导管并推出15次，用PBS洗涤血栓。（D）将血栓转移至含有浓缩伊文思蓝溶液的培养皿中。（E）将血栓转移至含有稀释伊文思蓝溶液的培养皿中，并装入预制的微导管中。（F）将微导管经由大鼠颈内动脉推进，直至导管尖端超过颈总动脉分叉处16 mm，并使用电动注射泵进行注射。详见实验方案第2节。请点击此处查看该图的放大版本。

在一项初步可行性研究中，我们在6个研究实验室共招募了135名受试者。尽管受试者被随机分配至8种治疗方案之一，但本文仅报告汇总数据，以说明该模型的可行性。在135名入组受试者中，有132名（98%）在正确的时间接受了正确剂量的TNK。由于33名（24%）动物在扫描前死亡，102名（75%）受试者在TE-MCAo术后3天成功获取了MRI图像。所有6个实验室在第3天前的动物损耗率基本一致（表1），表明该模型可在多个研究场所推广应用。梗死灶平均大小为13 ± 16%（梗死面积包括缺血和水肿，占同侧半球的百分比），各实验室之间存在一定变异（表2）。代表性MRI图像及死后栓子见于补充图1。

	实验室
变量	AG	DK	IW	MG	SD	YL
样本量 (N)	23	30	11	28	24	19
完成 MRI 检查	19	24	9	23	14	13

表1：各实验室的可行性。参与研究的实验室包括奥古斯塔大学（AG）、杜克大学（DK）、爱荷华大学（IW）、麻省总医院（MG）、圣地亚哥大学（SD）和耶鲁大学（YL）。表中列出了入组动物数量（N）以及卒中后第3天存活并完成MRI扫描的动物数量。该数据支持该模型的可行性。

位点	样本量 (N)	病灶体积 (%) 均值 ± 标准差	中线移位指数 (%) 均值 ± 标准差
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

表2：各研究中心第3天MRI扫描所见病灶体积。为评估该模型在六个研究中心之间的可重复性，对病灶体积（缺血区加水肿区）和中线移位程度进行了比较。病灶体积以同侧半球面积的百分比表示，中线移位以颅内空间最大宽度的线性百分比表示。数据证实了各实验室之间存在异质性。

补充图1：代表性图像。（A-E）大鼠TE-MCAo术后48小时获取的多种多回波多扫描（MEMS）脑部图像。切片位置约在前囟前方1 mm处。（F-J）大脑中动脉起始处栓子滞留的若干示例。请点击此处下载该图。

讨论

我们改进了缺血性卒中的血栓栓塞啮齿类动物模型，以便在多实验室临床前测试网络 SPAN 中使用。通过建立供体血液的储存方法以供后续使用，我们大幅减少了实验动物的使用数量。同时，我们简化了血栓栓塞物的制备过程和手术操作，从而便于在一天内完成多次大脑中动脉阻塞（MCAo）手术。我们的目标是使血栓栓塞法 MCAo（TE-MCAo）达到与广泛使用的尼龙丝线法 MCAo 相当的操作便捷性和手术通量。为实现这一目标，我们组织了两次线下外科医生培训研讨会，参与本研究的所有外科医生此前均已具备数月甚至数年的标准丝线法模型操作经验。我们在六个不同的研究实验室中验证了该方法的可行性，并显示出极佳的方案依从性。

在决定实施本方案时，研究者应考虑以下决定方案成败的关键因素。首先，采集血液时必须格外谨慎，这将直接影响血栓形成的成败。应采集动脉血而非静脉血，以避免过早凝血。其次，建议采集的血量应多于看似所需量。有时一份样本可能在过夜后未能形成血栓，而其他样本则成功形成。第三，我们强烈建议在导管装载过程中使用光学放大设备，例如带头灯的外科放大镜或带照明的放大镜。第四，对颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）的解剖必须谨慎细致，以避免血管撕裂和血管内血栓形成。此外，必须清晰辨认翼腭动脉（PPA），以确保输送导管正确进入颈内动脉（ICA）。第五，注射溶栓药物后在啮齿类动物中很少观察到不良反应。在我们的研究中，注射TNK后未观察到任何不良事件，例如血管性水肿或外周出血。这并非排除可能性，但我们未发现有关溶栓药物在啮齿类动物中引起全身性副作用的报道。首次尝试实施本方案的研究者，建议咨询本文所列的任一共同作者，因为我们发现个性化指导非常有帮助。

在为候选疗法选择动物疾病模型时，准确代表药物拟治疗的患者群体至关重要。局灶性缺血性卒中模型包括玫瑰红光化学血栓模型、皮层软脑膜动脉阻断以及立体定位内皮素-1注射^13,14,15。这些模型的优势在于可在皮层的可预测区域产生高度可重复的病灶，因此在研究细胞机制或病灶位置与行为学结果的相关性时更具优势。然而，由于成本较高、操作复杂，且缺乏再灌注成分，这些模型在药物筛选中的应用价值较低。

采用血管内单丝线栓或血栓栓塞的MCAo是大血管闭塞（LVO）公认首选的动物模型^10,16,17。硅胶包被的单丝线栓模型操作简便，应用广泛。尽管其病灶位置和大小的可预测性较低，但在大规模药物筛选中，这种异质性反而被视为优势，因为人类脑卒中本身也具有高度异质性^18,19。单丝线栓法的缺点在于其闭塞过程在生物学上是惰性的。而在临床患者中，血栓形成及溶栓过程会引发炎症级联反应，伴随凝血酶、纤溶酶原及其他血栓成分的释放^20,21,22。为克服这一局限，许多研究提出了在兔、猪、犬及非人灵长类动物中建立血栓栓塞模型的方法^{23,24,25,26,27}。然而，这些模型通常较为复杂，且普遍需要特殊的专业技术。尽管如此，我们仍致力于将血栓栓塞模型适配于多实验室参与的临床前测试网络。为此，我们需简化血栓制备流程，优化手术操作，并显著减少所需实验动物数量。我们设计了一种血栓栓塞模型（TE-MCAo），可在六个不同实验室成功实施，且具有良好的方案依从性（表1）和相对一致的病灶大小（表2）。实验通量充足，平均每周可完成6只动物的实验。

存在若干可能有用的故障排除步骤。血液无法形成血栓是导致方案失败的最常见原因，通常由于制备导管被EDTA或肝素污染所致，尤其是在导管放置于手术台时。我们建议采用严谨的采集技术。此外，建议每周或每两周新鲜配制用于灭活EDTA的氯化钙溶液。在从制备导管中洗脱血栓后，将血栓切割成所需的5 cm片段可能具有挑战性。某些血栓较为脆弱，容易碎裂。我们建议在光学放大条件下制备血凝块，在极端情况下可考虑更换其他供体的血栓。抽吸和洗脱血栓需要一定的操作技巧，因此我们建议进行较长时间的培训。应使用光学放大确认抽吸导管尖端无钩挂或损伤。血栓可能卡在植入导管中，我们建议在抽吸与洗脱之间轻柔地进行“前后”交替操作。对于熟悉典型MCAo线栓模型的外科医生而言，识别PPA可能是一个新的步骤。我们强烈建议使用伊文思蓝对血栓进行标记，以便追踪导管沿颈内动脉上行的路径。通过沿颈内动脉进行仔细且深层的解剖，可轻松定位颈内动脉/PPA分叉处，该分叉通常位于颈内动脉神经的一条细小分支深部，位置恒定。

该方案存在一些局限性。进行啮齿类动物颈动脉插管需要一定的手术技巧，但线栓模型同样如此。血液凝块的操作也要求具备手术技能。与所有血栓栓塞性模型一样，该模型产生梗死的成功率较线栓模型为低。如果研究目标是获得更频繁的梗死事件，则线栓模型更为理想。相反，如果研究目标是模拟血栓形成及溶栓过程，则该模型更具优势。

该模型旨在利用真实存在的血栓及溶栓过程来测试潜在的脑保护剂。未来的研究方向还可包括针对无复流现象的辅助治疗研究。许多研究者已提议将抗凝剂和抗血小板药物用于此目的。

总之，本文介绍的TE-MCAo方案经过优化，可适用于多个实验室开展。我们简化了血栓的制备过程，并优化了手术操作流程。我们设计了一种供体血液保存方法，显著减少了所需实验动物的数量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	BD	309628
10倍放大镜
1 cc 注射器	泰尔茂	SS-01T
23号钝针	格雷格纳	5FVK7
3.0 cc 注射器	BD	309656
3-0 丝线结扎线
30g针头	BD	305128
5-0 Prolene 缝线	Ethicon	8698	缝合皮肤切口
5-0 丝线结扎线	Ethicon	A182
动脉瘤夹
硫酸阿托品	Vet One	NDC86136-006-10	减少支气管分泌物
钝头带槽镊子
布比卡因	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	局部麻醉药
氯化钙	Sigma	C7902
卡洛芬	硕腾公司	NADA #141-199	镇痛药
离心管	Eppendorf	22364111	用于血液采集
乙醇	Koptec	UN1170
Evan’蓝色	Sigma	E2129
加热垫	哈佛仪器公司	K021-435
止血钳
异氟烷	Vet One	NDC13985-528-60
由我制作的终极编织环	地平线组	不适用	软性约束
显微剪刀	F.S.T.	15000-00
微导管	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	预制注射导管
PE-10 导管	BD	427401
PE-100 导管	Intramedic	7426
PE-50 导管	BD	427410
儿童EDTA管	BD Microtainer	K2E-363706	储存供体血液
培养皿	Eppendorf	30702115
磷酸盐缓冲液	Fisher	B2438
普雷瓦尼克丝	PDI 公司	NDC10189-1080-1	消毒剂
棉签	VWR	89031-288
剃刀刀片	AccuTec Pro	71960
生理盐水	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
剪刀	F.S.T.	14958-11
尖头镊子
注射泵	New Era Pumps Inc.	BS-300
台式烤箱	博克尔	132000
替奈普酶（TNK）	基因泰克，旧金山	NDC50242-120-47	溶栓治疗
耳标	RapID 实验室，加利福尼亚州旧金山	RapID 标签