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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

一个实用的方法遗传诱导的命运映射:一个视觉引导标记和跟踪细胞在体内

Full Text

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13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

遗传诱导的命运映射（GIFM）标记和细胞与精致的空间和时间的控制轨道

Transcript

命运图是通过在体内标记和追踪细胞来生成的，以确定祖细胞如何对发育中和成体组织中的特定结构和细胞类型做出贡献。这一概念的进步是遗传诱导命运图谱或 GIFM 将体内基因表达硫酸盐和细胞行为联系起来，以创建基于遗传谱系的命运图谱。大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系 Mark Services Laboratory 的 Deborah Ellisor。

今天，我的同事 Ashley Brown、Liz Norman Neen Hagen、Steve Brown 和我将演示遗传诱导命运图谱的程序。我们在实验室中使用该程序来研究早期大脑发育。我们还可以将这项技术应用于基因灭活研究和人类疾病的动物模型。

那么让我们开始在 X cre 中，E-R-M-G-F-P 胚胎。MGFP LAE 是存在于所有细胞中的报告等位基因，由灰色椭圆形 X cre、er表示，其中 X 代表基因调控元件。控制 C ER 表达在空间上仅限于蓝色所示的基因 X 的表达结构域，并且 CRE ER 蛋白被 HSP 90 隔离在细胞质中。

在没有他莫昔芬的情况下，报告基因将关闭。他莫昔芬给药导致结构域 X 中的命运映射细胞，因为 CER 从 HSP 90 释放到细胞核，并从报告基因等位基因中去除终止盒。报告基因等位基因 CER 和他莫昔芬的组合导致标记当细胞群最初根据基因表达在胚胎的原始大脑区域被标记时，即使在用于驱动 CER 的初始基因表达消失后，这些命运映射的细胞也会被追踪。

以这种方式。可以在成人中确定基因定义的细胞谱系的最终分布和最终命运。该程序首先制备每毫升 20 毫克他莫昔芬茎溶液，将 200 毫克他莫昔芬溶解在玻璃吸入瓶中的 10 毫升战前玉米油中。

然后将溶液在 37 摄氏度下在 Tator 涡旋中孵育 2 小时。该溶液通过用箔纸包裹小瓶并储存在 4 摄氏度下，间歇性地保护制备的他莫昔芬储备溶液免受光照。股票最多可以使用一个月。

对于命运映射实验，建立一个由野生型瑞士韦氏母性和携带基因特异性 CreER 等位基因和报告等位基因的雄性组成的育种对。出于此演示的目的，我们将使用 1 对 1 CreER MG FP 男性的胜利。每天早上检查瑞士韦氏雌性是否有阴道栓的外观。

指定阴道塞当天的早晨，如 cotus 后 0.5 天，并计算他莫昔芬给药的日期。基于本实验的这个起点，他莫昔芬将在胚胎第 8.5 天给药。使用带有动物饲喂针头的 1 毫升注射器，吸取 200 微升他莫昔芬茎溶液。

通过抓住脖子和背部的绒毛以固定头部并将鼠标翻转过来，使腹侧朝上，牢牢地束缚定时怀孕的瑞士韦氏雌性。用空闲的手指握住尾巴，使身体保持一条直线。接下来，将喂食针放入嘴角，轻轻引导针头平行于口腔顶部，直到喂食针尖接近眼睛的位置。

轻轻地将

头部向后倾斜以进入食道。将针头穿过会厌，沿着食道向下引导至胃部。小心不要进入气管。

一旦喂食针头进入胃中，施用他莫昔芬并取出针头。然后将雌性放回她的家笼中，直到解剖日期。在解剖当天，对定时怀孕女性的 E 12.5 胚胎进行自由解剖，然后评估 GFP 标记。

在 GFP 阳性胚胎中，我们观察到 wind one 衍生的神经元有助于中脑、后脑和脊髓。MG FP 报告基因标记轴突投影，也可以看到 通过家用支架将 GFP 阳性的胚胎转移到含有 PPS 的培养皿中，并使用相框拍摄它们 拍摄胚胎后，用镊子从每个胚胎上捏下一小块尾巴，并将每块放入 PCR 管中。将使用 PCR 对两个等位基因对组织进行基因分型，以确认通过全安装分析看到的结果。

以下程序使我们能够分析在开始开颅手术之前，来自胚胎区域的标记细胞如何填充成人大脑。通过捏住脚趾确认鼠标完全是 innu。带有 nembutal 的 ized 进行切口以通过胸腔进入心脏。

接下来，将蝶针放入心尖或左心室，并用 C 夹固定。用剪刀在右心房形成一个液体出口部位，然后灌注 10 至 15 毫升冰冷的生理盐水，直到液体清澈。然后是 20 至 25 毫升 4% 多聚甲醛。

心内充血完成后，用剪刀切开肩膀上方的脊柱，取出头部。用手术刀沿着头部的背侧中线，rostral de cottle 切开头皮，露出 S 头骨。使用手术刀从颅骨侧面和后部刮掉任何多余的组织或肌肉。

用镊子在中线刺穿颅骨，就在嗅球的喙部，并挖一个小孔来容纳细剪刀的尖端。将细剪刀插入这个孔中，并沿着嗅球的长度从中线做两个双边切口。这种切口会在鼻骨和额骨的交叉处折断颅骨，并为剪刀提供良好的通道。

沿着颅骨的矢状缝线剪开，确保剪刀尖端远离大脑，以免损坏底层组织。接下来，用镊子轻轻抓住颅骨，沿着内侧切口剥开骨头，露出大脑。颅骨可能会碎成小块或碎裂成大块。

继续使用镊子去除所有额顶骨、顶骨间和枕骨。通过轻轻捏住每一侧的球骨，释放位于大脑外侧边缘的小脑水平的眼旁。用剪刀小心地剪下围绕脑干的骨背侧。

将剪刀的一侧插入骨头背缘下方，从脊髓被切断的地方开始，向小脑切断。释放脑干和小脑。用镊子从脑干周围取出剩余的骨头。

轻轻拉开骨头，将头部背侧向下转动，用镊子切断颅神经，将大脑从颅骨中释放出来。将大脑放入装有冰的培养皿中。冷 PPS 使用荧光解剖镜和相框照片评估成人大脑的 GFP 标记。

在这个例子中，中脑除了用于胚胎发生过程中的谱系分析外，还用 GFP 标记，在成人中，GIFM 可以与发育生物学中常用的其他应用程序相结合，例如显微解剖和组织外植体实验。例如，腹侧中脑是发育多巴胺神经元的祖先区，多巴胺神经元表达基因 wind 1。因此，通过显微解剖分离腹侧中脑可以建立体外设置以进一步研究其发育。

这只是使用 GIFM 分离由遗传历史定义的感兴趣祖先区域的一个例子。要开始此过程，使用细剪刀将先前鉴定的 GFP 阳性胚胎转移到细胞培养皿中冰冷的无菌 PBS 中。通过横向切割来去除胚胎的头部部分。

接下来，去除头部的喙部，冠状切口穿过头骨。这将暴露出一个管状结构，其中穿过头中囊泡的第四脑室在背侧和腹侧组织之间形成导管。小心地将剪刀尖端插入第四脑室，沿着喙部的背中线剪断，完全打开管子，形成一个开放的书本准备。

腹侧中脑现在将暴露在内侧。虽然中脑的两半背侧位于外侧，但可能需要去除腹侧中脑下方任何剩余的非神经组织。为了使 exexplanation 平躺，extopic 现在应该像一只蝴蝶，其中背侧中脑代表翅膀，而血栓仅代表尾巴。

为了进一步分离腹侧中脑以进行传真分析或细胞培养实验，请去除组织的侧面。现在，我们将展示 GIF 的一些代表性结果。在该实验中，可视化了标记为 E 8.5 的 WINT one 表达细胞，以确定 Wint one 直接细胞如何在整个发育过程中为神经结构做出贡献。

例如，在 E 12.5 处的 wint one C EER MG FP 胚胎主要在中脑、后脑和脊髓中表现出 GFP 荧光，在高放大倍率下可以看到精细神经元投射的神经支配。中脑体壁肢体和颅面部区域标记的细胞也可以通过免疫组织化学在细胞水平上可视化和分析。如图所示，E 12.5 胚胎的一微米厚的光学切片以 E 8.5 的他莫昔芬给药为标记，核 β 半乳糖抗体标记为红色，GFP 抗体标记为绿色，表示命运映射细胞显示在腹侧中脑中。

在这里，由于成人大脑中条件性 MGFP 报告基因的性质，我们组合的细胞是双阳性的。成熟组织的密度可能会掩盖从大脑内部结构发出的 GFP 荧光。因此，全安装荧光显微镜在评估获胜的成人的上 CUI 中仅显示微弱的 GFP 荧光。

在成人切片上用低倍显微镜标记的 E 8.5 的一个谱系显示，WIN one 谱系产生中脑结构，包括上 cui 和下 cui。在这张从多巴胺能神经元附近的腹侧中脑拍摄的更高放大倍率的图像中，可以看到核 β 钙阳性细胞和丰富的 GFP 阳性轴丛，在 E 9.5 处的对比标记导致大量的 GFP 标记，这很容易在中脑的下结肠中观察到全安装荧光。在成人切片上标记为 E 9.5 的 WINT 一谱系集中在下 kaulu 中，如低倍显微镜所见。

在这张从多巴胺能神经元腹侧中脑拍摄的更高放大倍率的图像中，可以看到核 β 凝胶阳性细胞和丰富的 GFP 阳性轴丛。因此，虽然 win 1 标记 E 8.5 与 E 9.5 的衍生神经元逐渐受到限制，无法对背侧中脑做出贡献。WIN one 谱系持续有助于腹侧中脑。

我们刚刚向您展示了遗传诱导型命运图谱的程序，用于在体内标记和追踪细胞谱系。这使我们能够根据细胞的遗传谱系标记细胞，并在基因表达消失后随时间追踪它们。通过在 8 岁半时服用他莫昔芬，我们已经表明，除了成人的整个中脑外，wit one 结构域还有助于中脑的发育。

相比之下，当 wit 1 结构域受到限制时，在 9.5 岁时施用他莫昔芬，会导致胚胎发生过程中对发育中的中脑的贡献更加有限，这种情况会持续到成人。在执行此程序时，重要的是要考虑到系统以镶嵌方式标记细胞，因此并非特定结构中的每个细胞都可以被标记。这可能是由于正在使用的 CRE er 系或条件报告等位基因。

重要的是，尽管细胞标记是镶嵌的，但 mar 细胞的模式和分布具有高度可重复性。我们发现，与腹膜间注射给药相比，通过口服管饲法给药他莫昔芬是有利的，因为它最大限度地减少了腹膜间隙的炎症以及对胚胎的机械损伤。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。

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