Name: 一个实用的方法遗传诱导的命运映射:一个视觉引导标记和跟踪细胞在体内 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 了解遗传诱导命运图谱技术，利用他莫昔芬诱导的CreER系统在小鼠胚胎中标记和追踪特定遗传谱系的细胞，研究早期大脑发育和祖细胞对组织的贡献。该技术结合整体荧光分析和外植体分析，为神经科学和发育生物学提供重要的谱系追踪工具。

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我们感谢 S. Arber 提供 mGFP 小鼠，感谢 Zervas 实验室成员对论文的审阅及提供的技术支持。A. Brown 获得了脑科学 Kaplan 暑期研究生研究奖的支持。E. Normand 获得了脑科学项目研究生研究奖的支持。本研究还得到了启动研究资金（MZ）的资助。

他莫昔芬的制备与灌胃操作（E8.5）
<ul>
 <li> 通过将他莫昔芬溶解于预热的玉米油中，配制20 mg/ml的他莫昔芬储备液。 </li>
 <li> 将溶液置于37°C条件下，在旋转混合仪上孵育2小时，并间歇性涡旋混匀。 </li>
 <li> 避光保存他莫昔芬储备液，置于4°C储存，可使用长达一个月。 </li>
 <li> 进行谱系示踪实验时，建立交配组合：雌性为Swiss Webster品系（野生型；购自Taconic），雄性则同时携带一个基因特异性的CreERT等位基因和一个报告等位基因。为演示目的，本实验使用Wnt1-CreERT;mGFP雄性小鼠（Ellisor 2009）。 </li>
 <li> 每天早晨检查Swiss Webster雌鼠是否出现阴道栓。发现阴道栓当天上午（0900）记为交配后0.5天，并以此为起点计算他莫昔芬给药时间。（本实验使用胚胎发育第8.5天）。 </li>
 <li> 使用1 ml注射器连接动物喂食针头（20G x 1-1/2），吸取200 μl他莫昔芬储备液（含4 mg他莫昔芬）。 </li>
 <li> 牢牢固定妊娠时间明确的Swiss Webster雌鼠，捏住其颈背部以固定头部，并将小鼠翻转至仰卧位。 </li>
 <li> 用空闲的手指夹住尾巴，使身体保持直线状态。 </li>
 <li> 将喂食针头从口角插入，并沿口腔顶部轻柔推进。 </li>
 <li> 旋转针头使其与身体平行，同时向后倾斜头部以保持颈部伸直。 </li>
 <li> 将针头沿食道向胃部推进。注意避免插入气管。若针头遇到阻力、动物出现咽反射或剧烈挣扎，应立即撤出针头并重新进行灌胃操作。 </li>
 <li> 当喂食针头进入胃部后，将他莫昔芬注入胃内，随后将雌鼠放回原饲养笼，直至解剖日为止。 </li>
</ul>
开颅手术：
<ul>
 <li> 用 4% 多聚甲醛对成年命运图谱小鼠进行心脏灌流，然后用剪刀在肩部上方切断脊柱，取下头部。</li>
 <li> 沿头部背侧中线（从头侧到尾侧）使用解剖刀切开头皮，暴露颅骨。</li>
 <li> 使用解剖刀刮除颅骨侧面和后部多余的组织或肌肉。</li>
 <li> 用镊子在嗅球前方中线处穿刺颅骨，制造一个小孔，以便插入精细剪刀的刀尖。</li>
 <li> 将精细剪刀插入小孔，从中线向两侧剪开，长度约与嗅球相当。该切口将在鼻骨与额骨交界处裂开颅骨，便于剪刀顺利进入。</li>
 <li> 沿颅骨的矢状缝（背侧中线）剪开，注意始终保持剪刀尖端向外倾斜，远离脑组织，以避免损伤下方组织。</li>
 <li> 用镊子轻轻夹住颅骨，沿中线切口向外剥离骨片以暴露脑组织。颅骨可能碎成小片或大块脱落。继续使用镊子去除所有额骨、顶骨、间顶骨和枕骨。</li>
 <li> 通过挤压位于小脑水平脑侧缘的副绒球周围骨性结构，将其周围的骨片压碎，然后轻轻移除这些骨片。</li>
 <li> 将头部倒置（背侧朝下），用镊子切断脑神经，使脑组织与颅骨分离。</li>
</ul>
整体装片显微技术：成年果蝇大脑
<ul>
 <li>使用荧光解剖显微镜评估成年果蝇大脑中的GFP标记。</li>
 <li>将大脑转移至含有PBS的培养皿中，并使用PictureFrame或其他合适软件进行拍照。</li>
</ul>
整体封片显微成像：E12.5 胚胎
<ul>
 <li>使用荧光体视显微镜通过整体胚胎观察 GFP 标记情况。</li>
 <li>将整体胚胎中显示 GFP 阳性的样本转移至含有 PBS 的培养皿中，并使用 PictureFrame 或其他适当软件进行拍照记录。</li>
 <li>用镊子从每只胚胎上夹取一小段尾部组织，分别放入 PCR 管中，通过 PCR 方法（Ellisor 2009）对两个等位基因进行基因型鉴定，以确认整体胚胎分析所获得的结果。</li>
</ul>
E12.5 胚胎腹侧中脑的显微解剖与组织块制备
<ul>
 <li> 从子宫链中解剖出胚胎后，通过整体荧光标记确定命运图谱的胚胎，随后将胚胎转移至细胞培养皿中的冰上预冷的无菌 PBS 中。</li>
 <li> 使用精细剪刀，在菱脑节1（rhombomere 1）尾侧作横向切割，移除胚胎的头部部分。</li>
 <li> 接着，通过在间脑处进行冠状切口，移除头部的吻侧部分。此操作将暴露一个管状结构，其中第四脑室经中脑泡形成一条连接背侧与腹侧组织的通道。</li>
 <li> 小心地将剪刀尖插入第四脑室，沿背侧中线从尾侧向吻侧剪开，完全打开该管状结构，形成“开放式书本”制备样本。此时腹侧中脑将居中暴露，而中脑的两个背侧半部分则位于外侧。</li>
 <li> 清除腹侧中脑下方残留的非神经组织，使组织更平整地铺展。如有需要，可在吻侧和尾侧边缘做切口，使外植体的背侧“翼状”部分也能平展。此时外植体应形似一只“蝴蝶”，其中背侧中脑构成翅膀，菱脑节1构成尾部。</li>
 <li> 若需进一步分离腹侧中脑用于FACS分析或细胞培养实验，可去除组织的外侧（背侧部分）。</li>
</ul>
代表性结果：
在此GIFM实验中， Wnt1-表达细胞在胚胎发育过程中通过在E8.5时给予他莫昔芬而被永久且可遗传地标记 Wnt1-CreERT;mGFP 胚胎。随后，通过整体荧光观察和切片免疫组织化学对这些标记细胞进行可视化，以确定其发育过程中的变化规律 Wnt1衍生细胞在发育过程中对神经结构有贡献。整体荧光成像依赖于mGFP报告系统中膜结合的GFP组分，因此既能提供细胞水平的信息，也能呈现整体结构的概览 Wnt1-来源的神经投射。例如，在 E8.5 时期给予他莫昔芬处理， Wnt1-CreERTmGFP E12.5 胚胎在中脑、后部后脑和脊髓区域主要表现出 GFP 荧光（图 1A）。在高倍镜下，可见细小的神经元投射支配中脑、体壁、肢体以及颅面区域。在此发育阶段，胚胎呈半透明状，内部的 GFP 标记易于分辨。然而，随着脑组织的发育，成熟组织的密度会遮蔽来自脑内部结构的 GFP 荧光。因此，在 E8.5 时给予他莫昔芬，成年个体中仅能在上丘观察到微弱的 GFP 标记（图 1C，插图）。此外，可见部分轴突投射沿后脑腹侧表面走行（未显示）。相比之下，在 E9.5 给予他莫昔芬时，整个下丘均出现显著的 GFP 标记（图 1B，插图）。这种整体荧光强度的增加可能表明 Wnt1在E9.5时期表达的细胞对背侧中脑浅层区域的贡献较E8.5时期表达Wnt1的细胞更为显著，或在该区域内延伸出更多的突起。无论何种情况，整体荧光染色结果中所呈现的差异均反映了Wnt1在发育过程中表达的动态特性，并表明基因诱导谱系追踪技术（GIFM）可用于追踪从胚胎期到成体阶段不同细胞群体的发育轨迹。
通过免疫组织化学方法，在细胞水平上分析来自 Wnt1-CreERT;mGFP 动物的命运图谱组织切片。联合使用抗GFP和β-半乳糖苷酶（β-gal）抗体以及多种组织特异性生物标志物，以确定Wnt1谱系对神经结构和细胞类型的精细细胞贡献。在E8.5时期给予他莫昔芬处理，并于E12.5时期进行组织分析，可在中脑和后脑广泛观察到双阳性细胞（GFP+ 和 β-gal+），其投射通路贯穿腹侧中脑（图1B）。在成年脑中，E8.5时期标记的Wnt1谱系发育形成多个中脑结构，包括上丘和下丘，以及腹侧被盖区和黑质中多巴胺能细胞群附近的区域（图1D）（另见Zervas 2004）。相比之下，E9.5时期标记的Wnt1谱系则发育为下丘以及多巴胺能细胞群附近的神经元（图1F）。
<img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="EGFP 和 nß-gal 染色小鼠胚胎中的基因表达；荧光显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. Wnt1-谱系示踪的代表性结果：
整体染色与免疫细胞化学实验结果示例 Wnt1-CreERT;mGFP 在E8.5（A-D）和E9.5（E-F）进行命运图谱标记（标记）的胚胎和成年大脑。A. Wnt1-CreER;mGFP E12.5 胚胎在中脑（Mb）、后部后脑（Hb）和脊髓（Sp）主要表现出 GFP 荧光。B. 通过免疫组织化学在细胞水平上观察和分析标记细胞，如本图所示的 1-μm 厚光学切片（40倍物镜，z轴序列采集）。细胞核β-半乳糖苷酶（nβ-gal）抗体标记（红色）与GFP抗体标记（绿色）显示命运图谱标记的细胞位于腹侧中脑。此处，重组细胞呈双阳性（nβ-gal+/GFP+），这是由条件性等位基因的特性所决定的 mGFP 报告基因。C. 整体荧光显微镜显示成年小鼠上丘（SC）中微弱的GFP荧光（插图）。评估 Wnt1 在成年切片中以低倍显微镜（5X）观察E8.5标记的谱系显示 Wnt1 谱系发育产生中脑结构，包括上丘（SC）和下丘（IC）的丘体（C）。D. 一张来自腹侧中脑多巴胺能神经元附近区域的40倍放大、1 mm光学切片，显示nβ-gal+细胞及丰富的GFP+轴突网状结构。E. 在E9.5进行标记后，可在中脑下丘通过整体荧光成像清晰观察到显著的GFP标记（插图）。 Wnt1 在成年切片中于 E9.5 标记的谱系（β-gal+，红色）集中分布于下丘（中脑背侧后部），低倍显微镜（5X）下可见（E）。F. 来自腹侧中脑多巴胺能神经元附近、厚度为 1 mm 的 40 倍光学切片，显示 nβ-gal+ 细胞及密集的 GFP+ 轴突网状结构Wnt1-在E8.5与E9.5标记的衍生神经元对背侧中脑的贡献逐渐受限，而 Wnt1 谱系持续参与腹侧中脑的发育。

<ol><li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li>
<li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li>
</ol>

所有作者对本工作的贡献均等，按姓氏字母顺序列出。每位作者的具体贡献可通过其在视频文章中的参与情况体现。

我们所展示的 GIFM 系统可用于回答多种细胞过程中广泛的问题。例如，可通过构建携带不同 Cre 驱动元件的小鼠，靶向任意特定的细胞类型、组织或遗传谱系。此外，由于他莫昔芬可在任何胚胎期或出生后时间点给予，因此可将重组事件控制在发育过程中的任意相关阶段。该系统的空间和时间控制特性，非常适用于研究表达特定基因的细胞如何参与特定结构或区域的形成，以及在发育过程中细胞迁移和模式形成事件。
除了通过免疫组织化学对细胞进行简单的标记和可视化（图1）外，GIFM技术还可用于多种应用。将GIFM与条件性基因敲除等位基因相结合，可实现对相关细胞群体的时空特异性基因功能缺失研究，同时利用报告等位基因对这些细胞进行标记。 Alternatively，从命运图谱动物中获取的组织可与荧光激活细胞分选（FACS）技术联合使用，从而将表达报告基因或特定标记物的细胞物理分离为不同的细胞群体。在胚胎发育过程中或从成年动物中分离的标记组织可进行体外培养，以便向特定谱系递送药物或遗传构建体。 体外.
我们的实验室利用GIFM研究获得的结果，...

一种用于遗传诱导命运图谱绘制的实用方法：标记与追踪细胞的可视化指南 体内

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

命运图谱通过在体内标记并追踪细胞，以确定前体细胞如何贡献于发育中及成体组织中的特定结构和细胞类型。Genetic Inducible Fate Mapping（GIFM，遗传诱导型命运图谱技术）是该概念的一项进展，可将基因表达、细胞命运和细胞行为在体内关联起来，从而基于遗传谱系构建命运图谱。
GIFM 利用 X-CreER 小鼠品系，其中 X 代表一个基因或一组基因调控元件，可驱动修饰的噬菌体蛋白——Cre 重组酶（CreERT）的空间特异性表达。CreERT 包含一个修饰的雌激素受体配体结合结构域，使得在无他莫昔芬药物存在时，CreERT 被滞留在细胞质中。他莫昔芬的结合可释放 CreERT，使其转位至细胞核，并介导位于 loxP 位点之间的 DNA 序列发生重组。在 GIFM 中，重组通常发生在 loxP 位点侧翼的终止盒（Stop cassette）与报告基因（如 GFP）之间。
小鼠经过培育，携带特定区域或特定细胞类型的CreER以及一种条件型报告等位基因。未经处理的小鼠不会产生标记，因为报告基因中的终止盒（Stop cassette）会阻止报告基因的进一步转录。我们通过灌胃法向定时妊娠的雌性小鼠给予他莫昔芬（tamoxifen），从而实现对CreERT活化的时间控制，使其随后转入细胞核，切除报告基因中的终止盒。在发生重组后，报告等位基因将被持续且可遗传地表达。这一系列事件使得细胞被永久标记，其遗传历史被不可逆地记录下来。因此，发生重组的报告基因可作为一种高保真的遗传谱系示踪工具，一旦启动表达，其信号即与最初驱动CreERT表达的基因表达状态无关。
我们在小鼠中应用基因诱导型谱系追踪技术（GIFM）来研究正常发育过程，并确定遗传谱系对成体细胞类型和组织的贡献。我们还利用GIFM追踪突变遗传背景下的细胞，以更深入地理解模拟人类遗传性疾病关键特征的复杂表型。
本视频文章指导研究人员成功应用基因诱导型荧光标记技术（GIFM）的实验方法。我们以特征明确的Wnt1-CreERT;mGFP小鼠为例，通过在胚胎第8.5天（E8.5）经口灌胃给予他莫昔芬，随后在胚胎第12.5天（E12.5）进行解剖，并利用落射荧光体视显微镜进行分析，展示该技术的操作流程。此外，我们还演示了如何对命运图谱标记的区域进行显微解剖，以制备外植体或用于流式细胞术（FACS）分析，并对成年期命运图谱标记的小鼠脑组织进行整体解剖，用于全组织荧光成像。综合而言，这些实验步骤使研究人员能够深入探究发育生物学及疾病模型中的关键科学问题。

可诱导的遗传谱系示踪（GIFM）可实现对细胞的精细时空控制下的标记与追踪 体内 并阐明特定遗传谱系的细胞如何贡献于发育中及成体组织。本文演示了对E12.5小鼠胚胎进行命运图谱绘制以开展表层荧光和外植体分析所需的技术。

命运图谱通过在体内标记并追踪细胞，以确定前体细胞在发育过程中如何贡献于特定结构和细胞类型而生成……

命运图谱通过在体内标记并追踪细胞，来确定前体细胞如何贡献于发育中及成体组织中的特定结构和细胞类型。这一概念的进一步发展是遗传诱导型命运图谱技术（GIFM），该技术将基因表达的时间点与体内细胞行为关联起来，从而基于遗传谱系构建命运图谱。大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学与生物化学系Mark Services实验室的Deborah Ellisor。今天，我的同事Ashley Brown、Liz Norman Neen Hagen、Steve Brown和我将演示一种基因诱导型命运图谱技术的操作流程。我们在实验室中利用该方法研究早期脑发育，也可将此技术应用于基因失活研究以及人类疾病的动物模型研究。那么，让我们开始吧。在 X cre、E-R-M-G-F-P 胚胎中，MGFP LAE 是一种报告等位基因，存在于所有由灰色椭圆表示的细胞中，X cre, er 中的 X 代表调控元件，控制 C ER 的表达，其空间分布局限于基因 X 的表达区域（以蓝色显示），而 CRE ER 蛋白则被 HSP 90 封存在细胞质中。在无他莫昔芬的情况下，报告基因将处于关闭状态。给予他莫昔芬后，由于CER从HSP90释放并转位至细胞核，从而移除报告基因等位片段中的终止盒，导致在X结构域中实现细胞命运示踪。永久且可遗传的重组确保细胞持续表达MG FP LA Z。报告基因等位片段CER与他莫昔芬联用，可在胚胎原始脑区根据基因表达对特定细胞群进行初始标记；即使驱动CER的初始基因表达随后消失，这些命运被示踪的细胞仍可被持续追踪。通过这种方法，可以在成体中确定基因定义的细胞谱系的最终分布和终末命运。该实验程序首先配制浓度为 20 毫克/毫升的他莫昔芬溶液：将 200 毫克他莫昔芬溶解于 10 毫升预热的玉米油中，置于玻璃吸入瓶内。然后将溶液在 Tator 涡旋振荡器上于 37 摄氏度孵育两小时。间歇性地用铝箔包裹小瓶，以避光保存配制好的他莫昔芬储备液，并置于 4 摄氏度储存。该储备液可使用长达一个月。进行命运图谱实验时，建立一个由野生型Swiss Webster雌鼠和一只同时携带基因特异性CreER等位基因及报告等位基因的雄鼠组成的交配对。在本演示中，我们将使用一只win to one CreER MG FP雄鼠。每天早晨检查Swiss Webster雌鼠是否有阴道栓出现。将观察到阴道栓的当天早晨定为交配后0.5天，并据此计算他莫昔芬给药的时间。根据本实验的起始时间点，他莫昔芬将在胚胎发育第8.5天给予。使用1毫升注射器连接动物喂食针头，吸取200 µL他莫昔芬储备溶液。牢固地抓住经定时交配的Swiss Webster雌鼠的颈背部皮肤以固定其头部，并将小鼠翻转，使其腹侧朝上。用空闲的手指夹住尾巴，以保持身体呈直线。接着，将喂食针插入小鼠口腔的侧角，轻柔地沿口腔顶部平行推进，直至喂食针尖端大约到达眼睛位置处。轻轻将头部后仰，以暴露食道。引导针头越过会厌，沿食道向胃部推进。注意避免进入气管。将喂养针插入胃部后，给予他莫昔芬，然后取出针头。随后将雌鼠放回其原有饲养笼，直至解剖当天。在解剖当天，从定时交配的怀孕雌鼠中取出 E 12.5 胚胎，游离后检测 GFP 标记情况。在GFP阳性的胚胎中，我们观察到风一来源的神经元对中脑、小脑后脑及脊髓均有贡献。MG FP报告基因标记了轴突投射，这些结构也可在整体装片的GFP阳性胚胎中观察到。将胚胎转移至含有PBS的培养皿中，使用成像系统进行拍照。胚胎拍照完成后，用镊子从每个胚胎上夹取一小段尾部组织，并将每段组织分别放入PCR管中。随后将利用PCR对两个等位基因进行基因分型，以验证整体装片分析所观察到的结果。以下操作步骤使我们能够在开始开颅手术之前，分析源自胚胎区域的标记细胞如何分布于成年大脑中。通过脚趾挤压确认小鼠已完全麻醉后，使用戊巴比妥钠进行切口，经肋骨间隙进入心脏。接下来，将蝴蝶针插入心脏的尖端或左心室，并用C形夹固定。用剪刀在右心房创建一个液体流出部位，然后用10至15毫升冰冻生理盐水灌注，直至流出液变澄清。随后用20至25毫升4%多聚甲醛灌注。当心脏灌注完成后，用剪刀在肩部上方的脊柱处剪断，取下头部。用手术刀沿头部背侧中线从前向后切开头皮，暴露颅骨。用手术刀刮除颅骨侧面和后部多余的组织或肌肉。用镊子在嗅球前方正中线处刺穿颅骨，制造一个小孔以容纳精细剪刀的尖端。将精细剪刀插入此孔，并从正中线开始沿嗅球长度方向进行两侧对称的切口。该切口将在鼻骨与额骨交界处断开颅骨，为剪刀提供良好的操作通路。沿颅骨的矢状缝剪开，注意保持剪刀尖端朝向远离脑组织的方向，以避免损伤下方的组织。接着，用镊子轻轻夹住颅骨，沿正中切口剥离骨片，以暴露脑组织。颅骨可能会碎成小块，也可能断裂成较大的部分。继续使用镊子去除所有额顶骨、间顶骨和枕骨。在小脑水平，沿脑的侧缘轻轻捏住两侧的球形骨，以松解位于此处的副眼骨。使用剪刀小心剪开围绕脑干的骨骼的背侧部分。将剪刀的一侧插入骨背侧缘下方，从脊髓切断处开始，向小脑方向剪开，以游离脑干和小脑。用镊子清除脑干周围残留的骨组织。轻轻移开骨骼，将头部背面向下翻转，用镊子切断颅神经，使脑组织从颅骨中分离。将脑组织放入盛有冰块的培养皿中。用冰冷的PPS溶液处理后，在荧光解剖显微镜下评估成年脑组织的GFP标记，并使用图像采集系统拍照记录。在此示例中，中脑除了用于胚胎发生过程中的谱系分析外，还由GFP标记；在成体中，GIFM可与发育生物学中常用的其他技术相结合，例如显微解剖和组织外植实验。例如，腹侧中脑是发育中多巴胺能神经元的前体区域，这些神经元表达wind one基因。因此，通过显微解剖分离腹侧中脑，可建立体外实验体系，以进一步研究其发育过程。这仅是利用GIFM技术根据遗传历史分离特定祖细胞区域的一个示例。开始该操作时，使用精细剪刀将先前鉴定出的GFP阳性胚胎转移至细胞培养皿中的冰冷无菌PBS中。通过横向剪切靠近rommy的胚胎头部区域，移除胚胎的头部部分。接下来，通过在头节进行冠状切口，移除头部的吻侧部分。这将暴露出一个管状结构，其中第四脑室经中脑泡形成连接背侧与腹侧组织的通道。小心地将剪刀尖插入第四脑室，沿背侧中线从尾侧向吻侧剪开，完全打开该管状结构，从而制备成“开放书”形态。现在将内侧暴露中脑的腹侧部分。当中脑的两个背侧部分位于外侧时，可能需要去除中脑腹侧下方残留的任何非神经组织。为了使外植体能够平展放置，其形态应类似于一只蝴蝶，其中背侧中脑代表翅膀，而腹侧部分代表尾部。为了进一步分离腹侧中脑组织以进行传真分析或细胞培养实验，需去除组织的外侧部分。接下来，我们将展示一些谱系示踪（GIFM）的代表性结果。在本实验中，通过标记在 E 8.5 时期表达 Wnt1 的细胞，来观察 Wnt1 表达细胞在发育过程中对神经结构的贡献情况。例如，在 E 12.5 时期的 wint one C EER MG FP 胚胎中，高倍镜下可见 GFP 荧光主要出现在中脑、后脑和脊髓区域，并可观察到精细的神经元投射支配这些区域。通过免疫组织化学方法，可在细胞水平上可视化并分析中脑体壁、肢体以及颅面区域标记的细胞。如这幅在 E 8.5 时期给予他莫昔芬标记、厚度为一微米的 E 12.5 胚胎光学切片所示，红色显示核 β-半乳糖苷抗体标记，绿色显示 GFP 抗体标记，共同指示了命运图谱标记的细胞位于腹侧中脑。此处，由于成年脑组织中条件性 MGFP 报告基因的特性，这些细胞呈双阳性。成熟组织的密度可能会遮蔽来自脑内部结构的 GFP 荧光。因此，整体荧光显微镜仅能在成年个体的上部 CUI 中观察到微弱的 GFP 荧光，从而评估嵌合体比例。在成年切片上以低倍显微镜观察E 8.5时期标记的一个谱系，结果显示该WIN单一谱系可生成中脑结构，包括上丘和下丘。在靠近多巴胺能神经元的腹侧中脑区域拍摄的这幅高倍放大图像中，可见细胞核β-catenin阳性细胞以及丰富的GFP阳性轴突丛，形成鲜明对比。而在E 9.5时期进行标记时，通过整体荧光观察可明显看到中脑下丘存在广泛的GFP标记。在成年切片上，E 9.5时期标记的WINT单一谱系经低倍显微镜观察显示，其主要集中于中脑下丘区域。在此张来自多巴胺能神经元腹侧中脑的高倍放大图像中，可见核内 β-gal 阳性细胞以及丰富的 GFP 阳性轴突丛。因此，尽管源自 WIN 一系的神经元在 E 8.5 与 E 9.5 标记后对背侧中脑的贡献逐渐受限，WIN 一系的细胞谱系仍持续参与腹侧中脑的形成。我们刚刚向您展示了用于体内标记和追踪细胞谱系的可诱导遗传命运图谱技术。该方法能够根据细胞的遗传谱系对其进行标记，并在基因表达终止后仍可对其进行长期追踪。通过在8.5天给予他莫昔芬，我们已证明wit1结构域不仅参与成年小鼠整个中脑的形成，也参与发育中中脑的形成。相比之下，在胚胎发生期间，当 Wnt1 基因结构域受到限制时，于九个半时间点给予他莫昔芬，会导致对发育中中脑的贡献更加受限，且这种限制会持续至成体阶段。进行该操作时需注意，该系统以嵌合方式标记细胞，因此特定结构中的每一个细胞并非都会被标记。这可能是由于所使用的 CRE-ER 系或条件性报告等位基因所致。重要的是，尽管细胞标记呈嵌合性，但 mar 细胞的分布模式和空间分布具有高度可重复性。我们发现，与腹腔注射给药相比，通过口服灌胃给予他莫昔芬更具优势，因为这种方法可最大限度地减少腹腔内的炎症反应以及对胚胎造成的机械性损伤。以上即为全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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生物学

一个实用的方法遗传诱导的命运映射：一个视觉引导标记和跟踪细胞在体内</em

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本方案采用光标记方法，在新生小鼠中特异性识别从结肠迁移至肠外部位的免疫细胞。该策略将有助于研究生命早期宿主与微生物组之间的相互作用。...

体内光标记结肠细胞以评估新生小鼠造血细胞的迁移潜能

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。...

利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

免疫反应性成纤维细胞在活化后会发生形态学改变，并促进细胞募集的变化。通过结合双光子成像技术与基因工程改造的成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）-cre；tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB)...

活体双色双光子成像技术用于皮肤中遗传标记报告细胞的观察

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

了解遗传诱导命运图谱技术，利用他莫昔芬诱导的CreER系统在小鼠胚胎中标记和追踪特定遗传谱系的细胞，研究早期大脑发育和祖细胞对组织的贡献。该技术结合整体荧光分析和外植体分析，为神经科学和发育生物学提供重要的谱系追踪工具。

一种用于遗传诱导命运图谱绘制的实用方法：标记与追踪细胞的可视化指南体内

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