一种用于遗传诱导命运图谱绘制的实用方法：标记与追踪细胞的可视化指南 体内

命运图谱通过在体内标记并追踪细胞，来确定前体细胞如何贡献于发育中及成体组织中的特定结构和细胞类型。这一概念的进一步发展是遗传诱导型命运图谱技术（GIFM），该技术将基因表达的时间点与体内细胞行为关联起来，从而基于遗传谱系构建命运图谱。大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学与生物化学系Mark Services实验室的Deborah Ellisor。

今天，我的同事Ashley Brown、Liz Norman Neen Hagen、Steve Brown和我将演示一种基因诱导型命运图谱技术的操作流程。我们在实验室中利用该方法研究早期脑发育，也可将此技术应用于基因失活研究以及人类疾病的动物模型研究。

那么，让我们开始吧。在 X cre、E-R-M-G-F-P 胚胎中，MGFP LAE 是一种报告等位基因，存在于所有由灰色椭圆表示的细胞中，X cre, er 中的 X 代表调控元件，控制 C ER 的表达，其空间分布局限于基因 X 的表达区域（以蓝色显示），而 CRE ER 蛋白则被 HSP 90 封存在细胞质中。

在无他莫昔芬的情况下，报告基因将处于关闭状态。给予他莫昔芬后，由于CER从HSP90释放并转位至细胞核，从而移除报告基因等位片段中的终止盒，导致在X结构域中实现细胞命运示踪。永久且可遗传的重组确保细胞持续表达MG FP LA Z。报告基因等位片段CER与他莫昔芬联用，可在胚胎原始脑区根据基因表达对特定细胞群进行初始标记；即使驱动CER的初始基因表达随后消失，这些命运被示踪的细胞仍可被持续追踪。

通过这种方法，可以在成体中确定基因定义的细胞谱系的最终分布和终末命运。该实验程序首先配制浓度为 20 毫克/毫升的他莫昔芬溶液：将 200 毫克他莫昔芬溶解于 10 毫升预热的玉米油中，置于玻璃吸入瓶内。

然后将溶液在 Tator 涡旋振荡器上于 37 摄氏度孵育两小时。间歇性地用铝箔包裹小瓶，以避光保存配制好的他莫昔芬储备液，并置于 4 摄氏度储存。该储备液可使用长达一个月。

进行命运图谱实验时，建立一个由野生型Swiss Webster雌鼠和一只同时携带基因特异性CreER等位基因及报告等位基因的雄鼠组成的交配对。在本演示中，我们将使用一只win to one CreER MG FP雄鼠。每天早晨检查Swiss Webster雌鼠是否有阴道栓出现。

将观察到阴道栓的当天早晨定为交配后0.5天，并据此计算他莫昔芬给药的时间。根据本实验的起始时间点，他莫昔芬将在胚胎发育第8.5天给予。使用1毫升注射器连接动物喂食针头，吸取200 µL他莫昔芬储备溶液。

牢固地抓住经定时交配的Swiss Webster雌鼠的颈背部皮肤以固定其头部，并将小鼠翻转，使其腹侧朝上。用空闲的手指夹住尾巴，以保持身体呈直线。接着，将喂食针插入小鼠口腔的侧角，轻柔地沿口腔顶部平行推进，直至喂食针尖端大约到达眼睛位置处。

轻轻将头部后仰，以暴露食道。引导针头越过会厌，沿食道向胃部推进。注意避免进入气管。

将喂养针插入胃部后，给予他莫昔芬，然后取出针头。随后将雌鼠放回其原有饲养笼，直至解剖当天。在解剖当天，从定时交配的怀孕雌鼠中取出 E 12.5 胚胎，游离后检测 GFP 标记情况。

在GFP阳性的胚胎中，我们观察到风一来源的神经元对中脑、小脑后脑及脊髓均有贡献。MG FP报告基因标记了轴突投射，这些结构也可在整体装片的GFP阳性胚胎中观察到。将胚胎转移至含有PBS的培养皿中，使用成像系统进行拍照。胚胎拍照完成后，用镊子从每个胚胎上夹取一小段尾部组织，并将每段组织分别放入PCR管中。随后将利用PCR对两个等位基因进行基因分型，以验证整体装片分析所观察到的结果。

以下操作步骤使我们能够在开始开颅手术之前，分析源自胚胎区域的标记细胞如何分布于成年大脑中。通过脚趾挤压确认小鼠已完全麻醉后，使用戊巴比妥钠进行切口，经肋骨间隙进入心脏。

接下来，将蝴蝶针插入心脏的尖端或左心室，并用C形夹固定。用剪刀在右心房创建一个液体流出部位，然后用10至15毫升冰冻生理盐水灌注，直至流出液变澄清。随后用20至25毫升4%多聚甲醛灌注。

当心脏灌注完成后，用剪刀在肩部上方的脊柱处剪断，取下头部。用手术刀沿头部背侧中线从前向后切开头皮，暴露颅骨。用手术刀刮除颅骨侧面和后部多余的组织或肌肉。

用镊子在嗅球前方正中线处刺穿颅骨，制造一个小孔以容纳精细剪刀的尖端。将精细剪刀插入此孔，并从正中线开始沿嗅球长度方向进行两侧对称的切口。该切口将在鼻骨与额骨交界处断开颅骨，为剪刀提供良好的操作通路。

沿颅骨的矢状缝剪开，注意保持剪刀尖端朝向远离脑组织的方向，以避免损伤下方的组织。接着，用镊子轻轻夹住颅骨，沿正中切口剥离骨片，以暴露脑组织。颅骨可能会碎成小块，也可能断裂成较大的部分。

继续使用镊子去除所有额顶骨、间顶骨和枕骨。在小脑水平，沿脑的侧缘轻轻捏住两侧的球形骨，以松解位于此处的副眼骨。使用剪刀小心剪开围绕脑干的骨骼的背侧部分。

将剪刀的一侧插入骨背侧缘下方，从脊髓切断处开始，向小脑方向剪开，以游离脑干和小脑。用镊子清除脑干周围残留的骨组织。

轻轻移开骨骼，将头部背面向下翻转，用镊子切断颅神经，使脑组织从颅骨中分离。将脑组织放入盛有冰块的培养皿中。用冰冷的PPS溶液处理后，在荧光解剖显微镜下评估成年脑组织的GFP标记，并使用图像采集系统拍照记录。

在此示例中，中脑除了用于胚胎发生过程中的谱系分析外，还由GFP标记；在成体中，GIFM可与发育生物学中常用的其他技术相结合，例如显微解剖和组织外植实验。例如，腹侧中脑是发育中多巴胺能神经元的前体区域，这些神经元表达wind one基因。因此，通过显微解剖分离腹侧中脑，可建立体外实验体系，以进一步研究其发育过程。

这仅是利用GIFM技术根据遗传历史分离特定祖细胞区域的一个示例。开始该操作时，使用精细剪刀将先前鉴定出的GFP阳性胚胎转移至细胞培养皿中的冰冷无菌PBS中。通过横向剪切靠近rommy的胚胎头部区域，移除胚胎的头部部分。

接下来，通过在头节进行冠状切口，移除头部的吻侧部分。这将暴露出一个管状结构，其中第四脑室经中脑泡形成连接背侧与腹侧组织的通道。小心地将剪刀尖插入第四脑室，沿背侧中线从尾侧向吻侧剪开，完全打开该管状结构，从而制备成“开放书”形态。

现在将内侧暴露中脑的腹侧部分。当中脑的两个背侧部分位于外侧时，可能需要去除中脑腹侧下方残留的任何非神经组织。为了使外植体能够平展放置，其形态应类似于一只蝴蝶，其中背侧中脑代表翅膀，而腹侧部分代表尾部。

为了进一步分离腹侧中脑组织以进行传真分析或细胞培养实验，需去除组织的外侧部分。接下来，我们将展示一些谱系示踪（GIFM）的代表性结果。在本实验中，通过标记在 E 8.5 时期表达 Wnt1 的细胞，来观察 Wnt1 表达细胞在发育过程中对神经结构的贡献情况。

例如，在 E 12.5 时期的 wint one C EER MG FP 胚胎中，高倍镜下可见 GFP 荧光主要出现在中脑、后脑和脊髓区域，并可观察到精细的神经元投射支配这些区域。通过免疫组织化学方法，可在细胞水平上可视化并分析中脑体壁、肢体以及颅面区域标记的细胞。如这幅在 E 8.5 时期给予他莫昔芬标记、厚度为一微米的 E 12.5 胚胎光学切片所示，红色显示核 β-半乳糖苷抗体标记，绿色显示 GFP 抗体标记，共同指示了命运图谱标记的细胞位于腹侧中脑。

此处，由于成年脑组织中条件性 MGFP 报告基因的特性，这些细胞呈双阳性。成熟组织的密度可能会遮蔽来自脑内部结构的 GFP 荧光。因此，整体荧光显微镜仅能在成年个体的上部 CUI 中观察到微弱的 GFP 荧光，从而评估嵌合体比例。

在成年切片上以低倍显微镜观察E 8.5时期标记的一个谱系，结果显示该WIN单一谱系可生成中脑结构，包括上丘和下丘。在靠近多巴胺能神经元的腹侧中脑区域拍摄的这幅高倍放大图像中，可见细胞核β-catenin阳性细胞以及丰富的GFP阳性轴突丛，形成鲜明对比。而在E 9.5时期进行标记时，通过整体荧光观察可明显看到中脑下丘存在广泛的GFP标记。在成年切片上，E 9.5时期标记的WINT单一谱系经低倍显微镜观察显示，其主要集中于中脑下丘区域。

在此张来自多巴胺能神经元腹侧中脑的高倍放大图像中，可见核内 β-gal 阳性细胞以及丰富的 GFP 阳性轴突丛。因此，尽管源自 WIN 一系的神经元在 E 8.5 与 E 9.5 标记后对背侧中脑的贡献逐渐受限，WIN 一系的细胞谱系仍持续参与腹侧中脑的形成。

我们刚刚向您展示了用于体内标记和追踪细胞谱系的可诱导遗传命运图谱技术。该方法能够根据细胞的遗传谱系对其进行标记，并在基因表达终止后仍可对其进行长期追踪。通过在8.5天给予他莫昔芬，我们已证明wit1结构域不仅参与成年小鼠整个中脑的形成，也参与发育中中脑的形成。

相比之下，在胚胎发生期间，当 Wnt1 基因结构域受到限制时，于九个半时间点给予他莫昔芬，会导致对发育中中脑的贡献更加受限，且这种限制会持续至成体阶段。进行该操作时需注意，该系统以嵌合方式标记细胞，因此特定结构中的每一个细胞并非都会被标记。这可能是由于所使用的 CRE-ER 系或条件性报告等位基因所致。

重要的是，尽管细胞标记呈嵌合性，但 mar 细胞的分布模式和空间分布具有高度可重复性。我们发现，与腹腔注射给药相比，通过口服灌胃给予他莫昔芬更具优势，因为这种方法可最大限度地减少腹腔内的炎症反应以及对胚胎造成的机械性损伤。以上即为全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。