Name: 原位贴壁和非贴壁的哺乳动物细胞的亚细胞分馏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习原位亚细胞分级分离技术，用于研究哺乳动物细胞中蛋白质的亚细胞定位与共定位。该方法通过免疫荧光显微镜观察细胞质、细胞核及染色质组分，适用于贴壁与非贴壁细胞类型。

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Anyaporn Sawasdichai 和 Nazefah Abdul Hamid 分别感谢泰国皇家政府和马来西亚政府提供的博士奖学金。本工作由 Wellcome Trust 资助项目基金授予 PSJ 和 KG。我们还感谢布里斯托大学 Wolfson 生物成像中心的支持。

一、组分分离的准备工作
本部分介绍聚-L-赖氨酸包被的显微镜盖玻片的制备以及在进行细胞分馏前的细胞贴附。如有需要，可在细胞贴附前或贴附后，使用蛋白表达载体对细胞进行瞬时转染。
A. 多聚-L-赖氨酸包被盖玻片的制备
<ol>
	<li>用蒸馏水配制浓度为1 mg/ml的聚-L-赖氨酸溶液。</li>
	<li>将洁净的盖玻片放入该溶液中，在22°C的摇床上孵育至少1小时，以进行聚-L-赖氨酸包被。</li>
	<li>用无菌蒸馏水洗涤包被后的盖玻片两次，再用96%乙醇洗涤一次。</li>
	<li>将包被后的盖玻片置于滤纸上自然晾干，并存放于干燥容器中以备后续使用（干燥后可叠放）。</li>
</ol>
B. 将细胞附着到盖玻片上
非贴壁细胞（此处使用 K562 细胞）
<ol>
	<li>将一片经多聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysine）包被的盖玻片放入6孔板的一个孔中，确保包被面朝上。</li>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）及青霉素/链霉素（PS，青霉素100单位/mL，链霉素100 mg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，以7×105 个细胞/孔的密度接种K562细胞。对于K562细胞，可在接种前通过电穿孔法进行瞬时转染（使用0.4 cm电穿孔比色皿，200 μL培养基中含1×107 个细胞，参数为250 V / 975 μF）。</li>
	<li>将细胞在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>吸去培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
	<li>随后进行亚细胞组分分离实验步骤。</li>
</ol>
贴壁细胞（此处我们使用 Cos-7 细胞）
<ol>
 <li>将未包被的盖玻片放入6孔板的一个孔中。</li>
 <li>用预热至37°C的PBS洗涤两次。</li>
 <li>在37°C条件下，用含0.03% EDTA和0.25%胰蛋白酶的PBS消化细胞2至5分钟，使细胞脱离。注意避免过度消化，一旦大部分细胞呈单个悬浮状态，应立即终止消化。</li>
 <li>将细胞以3×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中的普通盖玻片上，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和PSG（青霉素100单位/mL、链霉素100 µg/mL和L-谷氨酰胺292 µg/mL）的DMEM，以终止消化。贴壁细胞通常能很好地附着在普通显微镜盖玻片上，但如有需要，也可使用聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。</li>
 <li>将细胞在37°C、5% CO2条件下培养24小时。对于Cos-7细胞，如需进行瞬时转染，可使用Fugene 6（Roche）进行转染，并继续在37°C、5% CO2条件下培养24小时以恢复细胞状态。</li>
 <li>吸去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞两次。</li>
 <li>随后进行亚细胞组分分离实验步骤。</li>
</ol>
 
II. 亚细胞分级分离
原位 组分分离按照图1所示示意图进行，基于先前描述的方法5 参照先前所述的修改方法7 以及下文的详细方案中。建议每次分级处理后，先将盖玻片转移至新的6孔板中，再移除液体。尽管成像仅需四张盖玻片，但若需平行进行Western blotting以制备全细胞提取物和核基质组分，则需额外准备盖玻片。 
<ol>
	<li>配制并过滤细胞骨架缓冲液（CSK）：10 mM PIPES、300 mM 蔗糖、100 mM NaCl、3 mM MgCl2、1 mM EGTA。CSK 缓冲液应在分离当天新鲜配制。</li>
	<li>如需制备全细胞裂解液用于 Western 印迹，可取一张盖玻片上的细胞，直接将 200 µl TES 缓冲液（1% SDS、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl，pH 7.4）轻柔地加至盖玻片上，在 22°C 下孵育 1 至 2 分钟。随后收集全细胞提取物，并通过加入 250 µl 1 M (NH4)2SO4 沉淀蛋白质，冰上孵育直至其他 Western 样品准备就绪。</li>
	<li>将剩余盖玻片用 1 ml 冰冷 PBS 在 22°C 下洗涤两次，每次倾斜 6 孔板两到三次。</li>
	<li>取出代表全细胞的盖玻片，转移至新的 6 孔板中，随后进行细胞固定及免疫荧光染色操作。</li>
	<li>轻柔地移除其余孔中的 PBS。</li>
	<li>通过将 200 µl CSK 缓冲液 + 0.1% (V/V) Triton X-100 直接轻柔地加至每张剩余盖玻片上，在冰上孵育 1 分钟，以提取细胞质及松散结合的核蛋白。</li>
	<li>收集细胞质及松散结合的核提取物，并按步骤 2 所述方法进行沉淀。</li>
	<li>将盖玻片用 1 ml 冰冷 PBS 在 22°C 下洗涤两次，每次倾斜 6 孔板。</li>
	<li>取出代表紧密结合核成分的盖玻片，随后进行细胞固定及免疫荧光染色操作。</li>
	<li>轻柔地移除其余孔中的 PBS，然后将 200 µl CSK 缓冲液 + 0.5% (V/V) Triton X-100 直接轻柔地加至每张剩余盖玻片上，在冰上孵育 20 分钟，以提取紧密结合的蛋白质。</li>
	<li>收集紧密结合的提取物，并按步骤 2 所述方法进行沉淀。</li>
	<li>将盖玻片用 1 ml 冰冷 PBS 在 22°C 下洗涤两次，每次倾斜 6 孔板。</li>
	<li>取出代表染色质组分的盖玻片，随后进行细胞固定及免疫荧光染色操作。</li>
	<li>轻柔地移除其余孔中的 PBS，然后将 200 µl CSK 缓冲液 + 100 µg/ml DNase I 加至剩余盖玻片上，在 37°C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>收集染色质提取物，并按步骤 2 所述方法进行沉淀。</li>
	<li>将盖玻片用冰冷 PBS 在 22°C 下洗涤两次，每次倾斜 6 孔板。</li>
	<li>取出代表核基质组分的盖玻片，随后进行细胞固定及免疫荧光染色操作。</li>
	<li>如需进行 Western 印迹分析，可使用 200 µl TES 缓冲液按步骤 2 所述方法，从额外的核基质盖玻片上提取基质蛋白。</li>
	<li>用于 Western 印迹的样品应在 4°C 下以 13000 rpm 的速度在台式微量离心机中离心，沉淀物重悬于 40 µl SDS 上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl，pH 6.8；2% (w/v) SDS；50 mM DTT；10% 甘油；0.01% (w/v) 溴酚蓝）中，随后进行 SDS-PAGE 分析。 <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig1.jpg" alt="Western 印迹示意图：使用 CSK 和 TES 缓冲液对细胞核组分进行原位细胞分级分离。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 原位 细胞器分级分离的示意图。 细胞骨架缓冲液（CSK）包含 10 mM PIPES、300 mM 蔗糖、100 mM NaCl、3 mM MgCl2、1 mM EGTA。TES 缓冲液包含 1% SDS、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl，pH 7.4。</li>
</ol>
三、细胞固定与免疫荧光
<ol>
 <li>向每个盖玻片中轻轻加入 1ml 4% 多聚甲醛/PBS，于 4°C 下孵育 30 分钟。</li>
 <li>在 22°C 下，用 1ml PBS 将每个盖玻片轻轻洗涤 2–3 次。</li>
 <li>向每个盖玻片中加入 400µl 0.1% Triton X-100/PBS，于 22°C 下孵育 10 分钟。</li>
 <li>在 22°C 下，用 1ml PBS 将每个盖玻片轻轻洗涤 2–3 次。</li>
 <li>向每个盖玻片中加入 400µl 3% 牛血清白蛋白（BSA）/PBS，于 22°C 下孵育 20 分钟，以降低潜在的背景染色。</li>
 <li>在 22°C 下，用 1ml PBS 将每个盖玻片轻轻洗涤 2–3 次。</li>
 <li>将 100µl 用 PBS 稀释的一抗直接加到盖玻片上，于 22°C 下孵育 1 小时。一抗和二抗应根据需要在 PBS 中稀释至适当浓度，该条件可能需针对每种抗体进行优化。</li>
 <li>在 22°C 下，用 1ml PBS 将每个盖玻片轻轻洗涤 2–3 次。</li>
 <li>加入 200µl 用 PBS 稀释的二抗，于 22°C 避光孵育 1 小时。</li>
 <li>在 22°C 下，用 1ml PBS 将每个盖玻片轻轻洗涤 2–3 次。</li>
 <li>使用含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐）的 Vectashield 封片液，将每个盖玻片（细胞面朝下）封固于玻璃显微镜载玻片上。</li>
 <li>用纸巾擦去盖玻片周围多余的封片液，将载玻片置于 22°C 避光环境中孵育至少 30 分钟。</li>
 <li>用透明丙烯酸指甲油将盖玻片固定在玻璃载玻片上。</li>
 <li>在荧光显微镜观察前，将载玻片避光保存。</li>
</ol>
四、代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig2.jpg" alt="免疫荧光显微镜图；使用DAPI、TRITC对细胞组分中的α-微管蛋白、α-组蛋白H1、α-核纤层蛋白A/C进行染色" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 未转染COS-7细胞的亚细胞组分分离。 分离后的COS-7细胞用甲醛固定，并使用与TRITC偶联的α-微管蛋白、α-组蛋白H1或α-核纤层蛋白A/C抗体进行免疫染色，随后用含DAPI的封片剂封片。图像采用Leica共聚焦显微镜，配备10倍目镜和63倍物镜采集。细胞核使用DAPI滤光片组观察，同一视野下用TRITC滤光片组观察标记抗体染色的细胞。
<img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig3.jpg" alt="DAPI 和 FITC-TRITC 染色的细胞显微图像，显示核组分及染色质分布。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. GFP-6E2 融合蛋白与核基质相关。 对表达绿色荧光蛋白（GFP）与人乳头瘤病毒（HPV）6 型 E2 蛋白融合蛋白（GFP-6E2）的 Cos-7 细胞进行亚细胞分级分离。通过 DAPI 染色观察细胞核，转染细胞中 GFP-6E2 的定位通过 GFP 荧光直接观察。使用与 TRITC 偶联的抗 Lamin A/C 抗体及 TRITC 滤光片观察 Lamin A/C。合并图像显示部分 GFP-6E2 蛋白与核基质相关联（右下面板）。图像获取方法如图 2 所述。

<ol><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li>
<li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Groucho%2FTLE%2FR-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+%28CBF%28alpha%29%2FAML%2FPEBP2%28alpha%29%29+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li>
<li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li>
<li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li>
<li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ%3A+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li>
<li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li>
<li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

常见问题及建议：
洗涤过程中会丢失全部或大部分细胞。洗涤步骤中，必须将液体缓慢加入6孔板侧壁，避免直接接触盖玻片。同样，移除液体时应小心倾斜培养板，缓慢用移液器吸除多余液体。可通过使用聚-L-赖氨酸包被的盖玻片来增强细胞贴壁。
基因组DNA未被完全消化。对于某些细胞类型，可能需要延长DNA酶I的消化时间 和/或 提高DNA酶I的浓度，以实现基因组DNA的完全去除。
固定和分级分离过程中的假象。需要注意的是，某些蛋白质在固定或分级分离过程中可能发生重新定位6。例如，当核膜被破坏后从细胞核中释放出的蛋白质，可能会结合到原本位于不同区室的位点上。通过比较不同固定方法所获得的结果，可在一定程度上减少此类影响，例如使用多聚甲醛替代甲醛。对于整个活细胞而言，活细胞成像也有助于避免此类问题3。
该技术适用于检测GFP融合蛋白。然而，重要的是要验证融合蛋白的行为与未标记蛋白相似。此外，必...

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-Lysine</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8920</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>化学试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>化学试剂</td><td>VWR</td><td>284216N</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>化学试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>化学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6876</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的封片剂</td><td>化学试剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6 转染试剂</td><td>化学试剂</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白 H1</td><td>抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-8030</td><td></td></tr><tr><td>核纤层蛋白 A/C</td><td>抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-20681</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白-&amp;alpha;</td><td>抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-32293</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ 黏附性与非黏附性哺乳动物细胞的亚细胞分级分离

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

蛋白质功能与其定位密切相关。尽管某些蛋白质局限于特定位置或亚细胞区室，但许多蛋白质以自由扩散的群体形式存在，并与紧密结合于特定亚细胞区域或结构的亚群处于动态交换状态。原位亚细胞分级分离技术可实现对蛋白质区室化分布的可视化观察，同时揭示定位于特定结构的蛋白质亚群。例如，去除可溶性胞质蛋白和松散结合的核蛋白后，可揭示部分转录因子与染色质之间的稳定结合；随后进行DNA消化，在某些情况下可进一步揭示蛋白质与RNA网络之间的关联，该网络 collectively 被称为核骨架或核基质。
在此，我们描述了实验过程中所需的各个步骤 原位 在显微镜盖玻片上对贴壁和非贴壁哺乳动物细胞进行分馏。可通过特异性抗体或荧光融合蛋白结合荧光显微镜技术实现蛋白质的可视化。利用作为特定区室或结构标记物的抗体和/或荧光染料，可对蛋白质的定位进行精细绘图。 原位 组分分离还可与蛋白质印迹法结合，用于比较各组分中蛋白质的含量。这种简单的生化方法能够揭示出其他方法难以检测到的关联。

原位 对载玻片上的哺乳动物细胞进行亚细胞分级分离，可实现蛋白质定位的可视化。

蛋白质功能与其定位密切相关。尽管某些蛋白质局限于特定位置或亚细胞区室，……

本实验的总体目标是原位分离贴壁和非贴壁哺乳动物细胞，以检测蛋白质的定位情况。该目标首先通过将细胞贴附于显微镜盖玻片上实现；实验的第二步是去除细胞质及松散结合的核蛋白。该实验步骤的第三步是去除紧密结合的核蛋白。最后一步是去除染色质组分，使核基质及解离的蛋白保留在盖玻片上。最终可通过免疫荧光显微镜获得结果，显示蛋白质的亚细胞定位及共定位情况。您好，我是安雅·何·海（Anya Ho Hai），来自布里斯托大学生物化学学院凯文·加斯顿（Kevin Gaston）实验室。今天我们将向您展示一种进行亚细胞分级分离的实验方法。我们使用该方法来研究转录因子的定位。那么，让我们开始吧。首先，我们将演示如何将非贴壁和贴壁的哺乳动物细胞附着到盖玻片上。此处的非贴壁细胞为K 5 6 2细胞，贴壁细胞为A549细胞。为了培养非贴壁细胞，将经多聚赖氨酸包被的盖玻片放入六孔板的一个孔中，包被面朝上。K562 细胞的接种密度为每孔 7 × 10⁵ 个细胞。培养基为添加了 10% 胎牛血清以及青霉素-链霉素的 KO 完全改良伊格尔培养基。与非贴壁细胞不同，贴壁细胞通常能很好地附着在普通显微镜的盖玻片上。在PBS中清洗两次后，将盖玻片置于含胰蛋白酶的PBS中，于37摄氏度消化2至5分钟，即可使贴壁细胞脱落。消化过程中需注意避免过度消化，一旦观察到主要为单个悬浮细胞时，应立即终止消化。通过将细胞以每孔3 × 10⁵个细胞的密度接种来终止消化。在DMEM中培养，DMEM中添加10% FBS和PSG，并置于未包被的普通盖玻片上。在六孔板中，将非贴壁细胞和贴壁细胞于37°C、5% CO₂条件下培养24小时。在进行亚细胞分级分离的当天，配制并过滤新鲜的细胞骨架缓冲液。从培养箱中取出昨天接种到盖玻片上的细胞。在本实验中，我们将对COS-7细胞进行分级分离。倒掉培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液清洗细胞两次。取一个盖玻片上的细胞制备全细胞裂解液用于 Western 印迹：将 200 µL TES 缓冲液直接轻柔地加入盖玻片上，孵育 1 至 2 分钟。在 22 摄氏度下，去除全细胞提取物，并通过加入 250 微升 1 摩尔硫酸铵并在冰上孵育使蛋白质沉淀。由于将与各组分平行制备额外的 Western 样品，因此在所有其他样品准备好之前，将该样品保持在冰上。在 22 摄氏度下，用 1 毫升预冷的 PBS 将剩余的盖玻片洗涤两次。为避免在洗涤步骤中丢失细胞，应将 PBS 缓慢加入到每个孔的侧壁，避免直接接触盖玻片。然后轻轻倾斜培养板两到三次。移除代表完整细胞的盖玻片，并转移至新的六孔板中。通过轻轻加入一毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞，在4°C下孵育30分钟。通过缓慢移液，从其余孔中轻柔地移除 PBS。通过将 200 微升含 0.1% Triton X-100 的 CSK 缓冲液直接轻柔地加至每个剩余的盖玻片上，提

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该分级分离方案可使研究人员从哺乳动物细胞中分离出细胞质、细胞核、线粒体和膜蛋白。后两种亚细胞组分通过等密度梯度离心进一步纯化。...

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