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Estrazione del DNA dalla clip di coda

 
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Estrazione del DNA dalla clip di coda: un metodo utilizzato nel genotipizzazione del pesce zebra

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- Avviare la procedura posizionando un pesce adulto anestetizzato su una pila di carta assorbente. Ora utilizzare una lama di rasoio sterile per tagliare l'aletta di coda e trasferire rapidamente il pesce in un serbatoio contenente acqua dolce per il recupero. Trasferire la clip di coda in un tubo pulito contenente un tampone di lisi. Il tampone di lisi contiene detergenti non ionici, che solubilizzano la membrana plasmatica e la membrana nucleare di una cellula. Il tampone contiene anche un enzima chiamato proteinasi K che scompone le proteine e consente il rilascio di DNA nel lisato. Degrada anche le nucleasi, proteggendo il DNA dalla nucleasi digestione.

Ora, lascia i tubi con clip di coda in un'incubatrice durante la notte per abbattere completamente il tessuto a 55 gradi Celsius con rotazione continua. Quindi, riscaldare il tubo a 95 gradi Celsius per 15 minuti per inattivare la proteinasi K. Centrifugare il tubo per pelletare materiale non digerito e trasferire il supernatante contenente DNA in un altro tubo. Aggiungere alcol per far precipitare di nuovo il DNA e centrifugare per raccogliere il DNA in un pellet. Nel protocollo seguente, isoliamo il DNA dalla clip di coda di un pesce zebra adulto e da un intero embrione.

- Il giorno della preparazione del DNA, aggiungere proteinasi K fresca al tampone di lisi a una concentrazione di 1 milligrammo per millilitro. Il tessuto può essere raccolto da un pesce adulto utilizzando una clip per pinne o da un pesce embrionale.

In primo luogo, anestetizzare il pesce in soluzione di tricaina. Attendere che i movimenti branchiali rallentino. Quindi, mettere il pesce su una pila di tessuti e, con una lama sterile, tagliare un piccolo pezzo di pinna posteriore lungo circa 2-3 millimetri. Posizionare rapidamente il pesce in una vasca etichettata con acqua fresca per il recupero.

Raccogliere la clip della pinna con una punta di pipetta sterile e trasferirla in un tubo pieno di cento microlitri di tampone di lisi del DNA. Assicurarsi di etichettare sia il serbatoio dell'animale che il tubo. Incubare tutti i tessuti raccolti per almeno quattro ore e fino a durante la notte a 55 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, inattivare la proteinasi K riscaldando i tubi a 95 gradi Celsius per 15 minuti. Questi campioni devono essere utilizzati immediatamente per la PCR, ma possono anche essere conservati a meno 20 gradi Celsius per un massimo di tre mesi.

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