Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

需要订阅 JoVE 才能查看此 内容. 登录或开始免费试用。

DNA-ekstraksjon fra haleklipp

 
Click here for the English version

DNA-ekstraksjon fra haleklipp: En metode som brukes i sebrafiskgenotyping

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Start prosedyren med å plassere en bedøvet voksenfisk en stabel med absorberende papir. Bruk et sterilt barberblad til å kutte halefinnen og raskt overføre fisken til en tank som inneholder ferskvann for utvinning. Overfør haleklemmen til et rent rør som inneholder en lysisbuffer. Lysisbufferen inneholder ikke-ioniske vaskemidler, som løser plasmamembranen og atommembranen til en celle. Bufferen inneholder også et enzym kalt proteinase K som bryter ned proteiner og muliggjør frigjøring av DNA i lysatet. Det forringer også nukleaser, og beskytter DNA fra nuklease fordøyelsen.

La rørene med haleklemmer i en inkubator over natten bryte ned vevet helt ved 55 grader Celsius med kontinuerlig rotasjon. Deretter varmer du røret ved 95 grader Celsius i 15 minutter for å inaktivere proteinase K. Sentrifugerer røret til pellets ufordøyd materiale og overfør det supernatante som inneholder DNA til et annet rør. Legg til alkohol for å utfelle DNA og sentrifuge igjen for å samle DNA i en pellets. I følgende protokoll vil vi isolere DNA fra haleklippet til en voksen sebrafisk og fra et helt embryo.

- dagen for DNA-preparatet, tilsett fersk proteinase K til lysisbufferen i en konsentrasjon på 1 milligram per milliliter. Vev kan samles fra en voksen fisk ved hjelp av et finklipp eller fra en embryonal fisk.

Først bedøv fisken i trikainoppløsning. Vent til gjellebevegelsene går sakte. Legg deretter fisken en bunke vev og, med et sterilt barberblad, kutt av et lite stykke halefinne ca 2 til 3 millimeter lang. Legg fisken raskt i en merket tank med ferskvann for utvinning.

Plukk opp finklemmen med en steril pipettespiss og overfør den til et rør fylt med hundre mikroliter DNA-lysisbuffer. Pass å merke både dyrets tank og røret. Inkuber alle de oppsamlede vevene i minst fire timer og opp til natten ved 55 grader Celsius.

Etter inkubasjonen inaktiverer du proteinase K ved å varme opp rørene ved 95 grader Celsius i 15 minutter. Disse prøvene skal brukes til PCR umiddelbart, men kan også lagres ved minus 20 grader Celsius i opptil tre måneder.

Tags

Tom verdi Problem
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter