Name: 高效率转导肝癌细胞的重组腺相关病毒血清型3载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: 了解利用重组腺相关病毒血清型3（AAV3）载体高效转导人肝癌细胞的方法。本方案详细演示了病毒制备、纯化及转导流程，为肝癌基因治疗研究提供可靠技术支持。

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我们感谢 R. Jude Samulski 博士和 Xiao Xiao 博士慷慨赠送的重组 AAV3 和 AAV-EGFP 质粒，以及 Gail Tomlinson 博士慷慨提供的 Hep293TT 细胞。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目包括公共卫生服务基金 R01 HL-076901、R01 HL-097088 和 P01 DK-058327（项目 1）（资助对象：AS）。

1. 重组腺相关病毒3型（rAAV3）载体的包装
<ol>
<li>访问网站：“<a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a>”，并计算DNA用量。</li>
<li>将质粒pHelper（腺病毒辅助质粒）、pACG2c3（AAV辅助质粒）和pdsAAV-CB-EGFP（rAAV载体）在不含FBS和抗生素的培养基中预先混合。总体积应为8,750 μL，用于十个15 cm2培养皿。</li>
<li>直接向第1.2步中的DNA溶液中加入1,250 μL PEI（0.1% m/v，Polysciences，货号#23966，pH 4.5）。涡旋DNA-PEI混合液数秒。</li>
<li>在室温（RT）下孵育DNA-PEI溶液5分钟，以形成复合物。</li>
<li>每15 cm2培养皿加入1 mL DNA-PEI溶液。</li>
<li>转染4小时后，吸除培养基，并更换为25 mL新鲜的含10% FBS的完全培养基（C-DMEM）。</li>
<li>转染后72小时，刮取细胞并倒入250 mL锥形离心管中。</li>
<li>在4°C下以3000 rpm离心10分钟，弃去上清液。</li>
<li>用5 mL RB TMS缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 8.0）重悬细胞沉淀，转移至新的15 mL锥形管中。</li>
<li>在干冰-乙醇浴中冷冻10分钟，然后在37°C水浴中解冻10分钟。重复此冻融过程三次。</li>
<li>加入1 μL 4.8 M MgCl2和2 μL Benzonase（25 U/μL，Novagen，货号#70664-3）。涡旋混匀后在37°C孵育40分钟。</li>
<li>在4°C下以4,000 rpm离心40分钟，收集上清液（澄清裂解物）。</li>
<li>在13 mL Quick-Seal离心管（Beckman，货号#342413）中，自上而下依次加入碘克沙醇梯度（OptiPrep，货号#1114542）：2 mL 15%、2 mL 25%、1.5 mL 40%和1.5 mL 60%碘克沙醇。将上清液（第1.12步）加至碘克沙醇梯度顶部，再用RB TMS缓冲液补满离心管。</li>
<li>使用Beckman 90Ti转子，在16°C下以75,000 rpm离心1小时。</li>
<li>用注射器插入40%-60%界面处，收集40%碘克沙醇组分。</li>
<li>将40%碘克沙醇组分转移至一个50 mL锥形管中，并用缓冲液A（20 mM Tris，15 mM NaCl，pH 8.5）定容至40 mL。</li>
<li>使用HiTrap Q HP柱（GE Healthcare，货号#17-1154-01）组装过滤装置。依次用以下缓冲液洗涤层析柱：25 mL缓冲液A（20 mM Tris，15 mM NaCl，pH 8.5）；25 mL缓冲液B（10 mM Tris，500 mM NaCl，pH 8.5）；50 mL缓冲液A；40 mL溶于缓冲液A的病毒样品；50 mL缓冲液A（20 mM Tris，15 mM NaCl，pH 8.5）；20 mL缓冲液C（20 mM Tris，175 mM NaCl，pH 8.5）；</li>
<li>将缓冲液C组分收集至20 mL Apollo浓缩管（Orbital Biosciences）中，在4°C下以3,000 rpm离心10分钟。</li>
<li>弃去滤过液，加入20 mL预冷的PBS，再次在4°C下以3,000 rpm离心10分钟。</li>
<li>弃去滤过液，加入500 μL预冷的PBS，将载体从膜上洗脱下来，转移至硅化处理的Eppendorf管中，分装后于-80°C冷冻保存。</li>
</ol>
2. rAAV3 载体滴度的测定
<ol>
<li>在冰上融化一个 Eppendorf 管中的 10 μL 纯化病毒，加入 40 μL ddH2O。</li>
<li>加入 0.2 μL 苯并核酸酶（Benzonase，25 U/μL，Novagen，货号# 70664），37°C 孵育 1 小时。</li>
<li>在另一个 Eppendorf 管中取 50 μL 质粒标准品（0.2 ng/μL）。</li>
<li>在每个管中加入 50 μL 100 mM NaOH，65°C 孵育 30 分钟。</li>
<li>立即在冰上冷却至少 5 分钟。</li>
<li>根据 Bio-Dot 滤纸（Bio-Rad，货号# 1620161）裁剪转移膜（Millipore，货号# INYC00010）。用三张滤纸在 10x SSC 中冲洗膜 20 分钟。</li>
<li>安装槽印迹 SF 装置（Bio-Dot，货号# 170-6542），连接至真空瓶，并向槽印迹装置中加入 100 μL 10x SSC。</li>
<li>向第 2.5 步中的每个样品中加入 100 μL 20x SSC 和 1 μL 6x 上样染料。</li>
<li>将每个样品的 100 μL 加载到槽印迹装置中的膜上。</li>
<li>向每个样品中再加入 100 μL 10x SSC。</li>
<li>重复步骤 2.9 和 2.10，直至所有样品完全通过膜。</li>
<li>拆卸槽印迹装置并取出膜，将其放入 Inspector Linker SL-1000 紫外交联仪中。打开“Energy”和“Optimal Crosslink”（显示为 1200），然后按下“Start”。</li>
<li>将 1 mL 鲑鱼精（SS）DNA（Fisher，货号# NC9753983）煮沸 5 分钟，在冰上冷却至少 5 分钟。</li>
<li>通过混合以下组分配制预杂交液：27.5 mL ddH2O、15 mL 20x SSC、5 mL 50x Denhardt 溶液、1.25 mL 20% SDS、0.25 mL PolyA 和 1 mL 第 2.13 步中的 SS DNA。</li>
<li>将膜悬浮于 25 mL 预杂交液中，置于带盖玻璃缸内，在 65°C 杂交仪中过夜孵育。</li>
<li>将 50 ng DNA 模板稀释于 10 μL ddH2O 中，100°C 煮沸 5 分钟，立即在冰上冷却至少 5 分钟。</li>
<li>室温下以 3,000 rpm 离心 1 分钟，加入 2 μL 10 mM 3 dNTPs（不含 dCTP）、2 μL 六核苷酸混合物（Roche，货号# 11277081001）、1 μL Klenow 酶（Roche，货号# 11008404001）和 5 μL α-32P-dCTP，37°C 孵育 10 分钟。</li>
<li>将 G-50 柱（GE Healthcare，货号# 27-5330-01）以 3,000 rpm 离心 2 分钟，将第 2.17 步中的探针加入柱中，再以 3,000 rpm 离心 2 分钟，收集流出液。</li>
<li>测定放射活性。将探针在 100°C 煮沸 5 分钟，立即在冰上冷却至少 5 分钟。</li>
<li>将探针（6×105 cpm/mL）加入含有膜的预杂交液中。</li>
<li>在 65°C 杂交仪中过夜孵育。</li>
<li>弃去杂交液，在室温下用 2x SSC + 0.1% SDS 溶液冲洗膜 15 分钟。</li>
<li>弃去溶液，在 65°C 下用 0.1x SSC + 0.1% SDS 溶液冲洗膜 30 分钟。</li>
<li>弃去溶液，在室温下用 0.1x SSC 溶液短暂冲洗膜。</li>
<li>在 -80°C 曝光 6 小时并显影胶片。典型结果如图 1 所示。</li>
</ol>
3. 人肝癌细胞中rAAV3载体介导的转导与外源基因表达
<ol>
<li>在96孔板的每个孔中接种1×104个细胞（Huh7或Hep293TT细胞均可）。在加湿的CO2培养箱中孵育至少18小时。</li>
<li>从96孔板中移除培养基。</li>
<li>用不含FBS和抗生素的培养基各50 μL洗涤细胞两次，并移除洗涤液。</li>
<li>每孔加入50 μL不含FBS和抗生素的培养基，并加入rAAV载体，感染复数为5,000 vgs/细胞。</li>
<li>将培养板置于CO2培养箱中孵育4小时。</li>
<li>弃去培养基。用50 μL完全培养基洗涤细胞两次，并移除洗涤液。</li>
<li>每孔加入150 μL C-DMEM，将培养板置于CO2培养箱中继续孵育72小时，然后使用荧光显微镜（DMI 4000B；Leica Microsystems）观察EGFP表达情况。</li>
<li>通过ImageJ分析软件（NIH，Bethesda，MD，USA）对病毒感染细胞三个孔的图像进行定量分析。</li>
<li>转基因表达水平以每个视野中绿色荧光的总面积（像素2）来评估。典型结果如图2所示。</li>
<li>转基因表达也可通过流式细胞术进行测定。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
按照上述方案，可高效地制备腺相关病毒（AAV）血清型载体。典型产量约为 500 μL，包含约 1011 vgs/μL 的纯化载体原液。通过定量 DNA 点印迹法比较经与未经苯甲酸酶（Benzonase）消化的杂交信号，可确定载体原液的纯度。纯化的 rAAV3 载体可高效转导人肝癌——肝母细胞瘤（HB）和肝细胞癌（HCC）——细胞系。
<img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="rAAV3 定量；点印迹结果；10 μl 至 0.31 μl 稀释系列；病毒基因组分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1.	用于测定 rAAV3 载体滴度的定量 DNA 槽印迹分析。将经苯并核酸酶消化的纯化病毒储备液进行两倍系列稀释（上排），并通过32P 标记的 EGFP 特异性 DNA 探针进行定量 DNA 槽印迹分析。AAV3 载体的滴度通过与膜上加载的 1 ng（中排）或 10 ng（下排）AAV-EGFP 质粒标准品比较确定。数字对应 DNA 拷贝数。
<img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="荧光显微镜比较：对照组、表达scAAV2-EGFP和scAAV3-EGFP的细胞。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 重组腺相关病毒载体介导的外源基因在人肝癌细胞中的表达。Hep293TT细胞是一种 recently established human hepatoblastoma cell line4，分别进行空白感染（左图），或在37°C条件下用5,000 vgs/细胞的scAAV2-EGFP或scAAV3-EGFP载体转导2小时。转导后72小时，使用荧光显微镜观察外源基因的表达情况。

<ol><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).</li>
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<li>Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+6+capsid+tyrosine-to-phenylalanine+mutations+improve+gene+transfer+to+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle.</a> Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).</li>
<li>Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+and+correction+of+murine+hemophilia+B+using+AAV2+vectors+devoid+of+multiple+surface-exposed+tyrosines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.</a> Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).</li>
<li>Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+PDH+deficiency+using+AAV8-siRNA+vector-mediated+knockdown+of+pyruvate+dehydrogenase+E1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α.</a> Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+properties+of+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.</a> Mol Ther. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

基于一种非致病性人类细小病毒——腺相关病毒（AAV）的重组载体已被开发，并正用于多项基因治疗的临床试验5此前，在10种最常用的AAV血清型中，AAV3载体的转导效率总体上被报道为特别低，无论是在 体外 和 体内1然而，我们最近观察到，通过流式细胞术进行定量分析，AAV3 载体对人肝癌细胞系的转导效率非常高2，并且AAV3利用人肝细胞生长因子受体（hHGFR）作为这些细胞中的细胞共受体以介导结合与入侵3强烈提示 AAV3 对人肝细胞具有选择性嗜性，尤其对人肝癌细胞具有明显趋向性。然而，由于 AAV3 载体也能高效转导正常人肝细胞2在癌症基因治疗应用中的潜在用途 体内 将受到负面影响。一种可能的策略是通过鉴定肿瘤细胞特异性产生而正常肝细胞不产生的基因产物，实现对癌细胞的转录靶向。例如，先前的研究表明，甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）的血清水平可作为特异性标志物，用于监测某些类型肝癌的存在、进展和/或复发，因为正常肝细胞通常仅产生极少量的这种蛋白。事实上，我们已使用携带AFP启动子的AAV3载体，在肝癌细胞中靶向表达转基因，而在正常肝细胞中则不表达。2，目前正在进行研究以测试该方法在肝癌小鼠异种移植模型中的有效性。在我们的其他研究中，我们观察到通过定点突变病毒衣壳表面暴露的酪氨酸残基，可显著提高多种AAV血清型载体的转导效率6-14由于AAV3中7个表面暴露的酪氨酸残基中有6个也是保守的，我们对这些位点进行了定点突变，并观察到酪氨酸突变型AAV3载体在人肝癌细胞中的转导效率显著提高（未发表数据）。目前还正在进行相关研究，以评估酪氨酸突变型AAV3载体在人肝母细胞瘤和肝细胞癌小鼠异种移植模型中的安全性和有效性；若结果理想，最优的酪氨酸突变型AAV3血清型载体有望用于靶向人肝癌的潜在基因治疗。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子 DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>碘克沙醇梯度</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>G-50 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

高效转导肝癌细胞的重组腺相关病毒3型载体

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

基于一种非致病性的人细小病毒——腺相关病毒2型（AAV2）开发的重组载体，目前已应用于多项基因治疗的临床试验中。近年来，又分离出多种其他AAV血清型，这些血清型在多种大小动物模型中表现出特定的组织嗜性。1在10种最常用的AAV血清型中，AAV3在转导细胞和组织方面的效率远低于其他类型 体外 以及 体内.
然而，在我们近期发表的研究中，我们已证实AAV3载体能够极其高效地转导人肝癌——肝母细胞瘤（HB）和肝细胞癌（HCC）——的细胞系，因为AAV3在这些细胞中利用人肝细胞生长因子受体作为细胞共受体以实现结合与进入2,3。
本文介绍了利用携带报告基因的重组AAV3载体实现高效转导人肝癌细胞所需的步骤。使用携带治疗基因的重组AAV3载体，最终可能为人类肝癌的潜在基因治疗提供途径。

本文中，我们发现腺相关病毒3型（AAV3）是靶向人肝癌细胞效率最高的载体。

基于一种非致病性人类细小病毒——腺相关病毒2型（AAV2）的重组载体已被开发，并正在用于……

本实验的总体目标是制备具有活性的腺相关病毒3型载体，该载体可高效转导人肝癌细胞。首先，将三种不同的质粒同时转染至293细胞中；实验的第二步是纯化在293细胞内组装形成的AAV3病毒颗粒。该实验步骤的第三步是测定纯化的AAV三质粒载体的滴度。实验的最后一步是利用纯化的AAV三质粒载体转导人肝癌细胞。最终，可通过荧光显微镜观察到人肝癌细胞中高表达的EGFP蛋白。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够实现高效的人肝癌细胞基因转导与表达。尽管该方法可为腺相关病毒（AAV）三载体系统的构建提供指导，也可应用于其他系统，例如更为广泛使用的腺病毒（AdV）双载体系统。通常，初学者由于需经历多个繁琐步骤，可能在操作上存在困难，本实验操作将由本实验室的一名生物科学研究人员进行示范。本方案的此部分实验操作需在开始该程序前 48 小时于组织培养罩内进行。在 10 个直径 15 厘米的组织培养皿中接种人胚胎肾细胞系 293，使其在转染当天达到 70% 至 80% 的融合度。使用网站 www.访问 ge shae. com/calc 以计算转染所需的质粒 DNA 用量。在计算出正确的质粒 DNA 体积后，继续进行转染操作：将不含胎牛血清（FBS）和抗生素的适量细胞培养基移入无菌的 15 毫升离心管中。然后将所需体积的P辅助质粒、PACG two、C3以及PDSA AAV C-B-E-G-F-P移液至培养基中。对于10个15厘米培养皿，总体积应为8,750微升；将1,250微升PEI加入含有质粒DNA的培养基中，涡旋混合DNA-PEI溶液数秒，随后在室温下孵育5分钟，使DNA-PEI复合物形成。从组织培养孵箱中取出10个15厘米培养皿的HEK 293细胞。然后将一微升的DNA-PEI溶液加入每孔板中。将板置于37摄氏度、5%二氧化碳的组织培养孵育箱中孵育4至6小时。4至6小时后，小心地从板中吸除培养基。然后将含有10%胎牛血清的25毫升完全培养基用移液器加入每块培养板中。将细胞置于37°C和5%二氧化碳条件下培养约72小时。72小时后，从培养箱中取出培养板，返回组织培养操作台。 然后，在不吸除培养板中培养基的情况下，使用细胞刮将细胞层从培养板底部刮下并混入细胞培养基中。将含有细胞的培养基倒入一个250毫升的圆锥形离心管中。对每一块转染后的培养板重复此操作，将每块板中的内容物均倒入同一个250毫升的圆锥形离心管中。将含有细胞和培养基的离心管放入预冷的离心机中离心。在 4°C 下以 3000 转/分钟离心 10 分钟。离心后弃去上清液，然后用移液器向沉淀中加入 5 mL RB TMS 缓冲液并重悬。将细胞悬液转移至一支洁净的 15 mL 圆锥形离心管中。将15毫升离心管放入干冰乙醇浴中冷冻10分钟。孵育时间结束后，取出离心管，置于37°C环境中10分钟。为实现解冻，重复此冻融循环共两次。将试管涡旋震荡数秒。在最终解冻后的每次解冻后，向细胞溶液中加入1 µL 4.8 mol/L氯化镁和2 µL 25单位/µL的苯胺酶，然后涡旋震荡混匀。然后在37°C下孵育40分钟。孵育结束后，将离心管放入预冷至4°C的离心机中，以4,000转/分钟离心40分钟。在离心结束前，准备用于病毒纯化的IAL梯度。具体操作为：用移液器依次将2 mL 15% IAL、2 mL 25% IAL、1.5 mL 40% IAL和1.5 mL 60% IAL加入一支13 mL密封离心管中。离心后，用移液器小心吸取离心管中的上清液S，注意不要扰动细胞沉淀，将上清液S移至IAL梯度液上方，然后加入足量的RB TMS缓冲液至完全充满离心管。将离心管放入Beckman 90 TI转子中，注意确保转子平衡。在16 °C条件下以75,000 rpm离心1小时。离心后，将装有18号针头的5毫升注射器插入密度梯度40%至60%的界面处，缓慢抽吸并收集40% IAL组分。将40% IAL组分从注射器中排出，收集至一个50毫升锥形管中。然后用缓冲液a定容至终体积40毫升。根据制造商说明书，使用高截留Q HP柱组装过滤装置。然后用以下溶液洗涤层析柱：25 毫升缓冲液 A，25 毫升缓冲液 B，50 毫升缓冲液 A，40 毫升用缓冲液 A 配制的腺病毒样品，50 毫升缓冲液 A，最后 20 毫升缓冲液 C。将缓冲液 C 收集至 20 毫升 Apollo 浓缩管中。随后将样品置于预冷至 4°C 的离心机中，以 3000 转/分钟离心 10 分钟，离心结束后弃去滤过液。然后向 Apollo 浓缩管中加入 20 毫升预冷的 PBS，在 4°C 预冷的离心机中以 3000 转/分钟离心 10 分钟。离心结束后，弃去滤过液，用移液器将 500 微升预冷的 PBS 加到膜上，以重悬膜上的病毒。随后，将病毒载体以每份 10 微升分装至经硅化处理的微量离心管中，于 -80°C 保存直至使用。使用时，将一份 10 微升纯化的病毒在冰上解冻。用移液器将40微升双蒸水加入管中以稀释病毒。然后加入0.2微升浓度为每微升25单位的Ben Nase，并在37摄氏度下孵育混合物1小时。同时，用移液器将50微升浓度为每微升0.2纳克的质粒标准品加入一支干净的eend orph管中。孵育后，向含有病毒的试管中加入50微升100毫摩尔的氢氧化钠。同样将Bens aase混合物加入含有质粒标准品的试管中。将两个试管在65摄氏度下孵育30分钟。30 分钟结束后立即将两支试管置于冰上冷却至少五分钟。然后裁剪一块与生物点印迹滤纸大小相同的转印膜。将转印膜和三张生物滤纸放入一个浅盘中。在膜浸泡的同时，用10倍SSC填充托盘并浸泡20分钟。根据制造商的说明设置槽块SF装置。将装置连接至真空抽滤瓶，然后用移液器将100微升10倍SSC加入每个待加样槽中，用于加载病毒样本和质粒标准品的稀释液。从冰上离心管中取出样品，放入预冷至4°C的离心机中，以13,000转/分钟离心1分钟。然后向每个离心管中加入100微升20倍SSC溶液和1微升6倍上样染料。再用移液器向每个离心管中额外加入100微升10倍SSC溶液，并将每份样品各100微升分别上样至相邻的加样孔中。重复稀释和上样步骤，直至每个样品的总体积均已加入槽块装置中，并额外加入10倍SSC缓冲液，体积为100微升或更少。当所有样品均通过膜后，拆卸槽式印迹装置，并用镊子取出膜。注意仅在膜的边缘处操作，将膜放入Inspector Linker SL 1000紫外交联仪的腔室内。然后选择能量最优的交联，交联过程大约需要30秒。现在开始准备杂交：将一毫升鲑鱼精子DNA煮沸5分钟。煮沸5分钟后，应立即将鲑鱼精子DNA置于冰上冷却，至少持续5分钟。然后根据书面实验方案配制预杂交溶液。用移液器将含有鲑鱼精子DNA的25毫升预杂交溶液加入杂交管中。小心地将交联后的膜转移至杂交管内，盖上管盖，并确保预杂交溶液完全覆盖膜。 置于水平位置后，在65摄氏度的杂交箱中孵育过夜。次日，开始探针制备：将50纳克DNA模板用移液器加入eppendorf管中，加入10微升双蒸水稀释，将稀释后的DNA煮沸5分钟，随后立即在冰上冷却至少5分钟。冷却后，在室温下以13,000转/分钟离心1分钟。然后根据机构的放射性安全指南进行操作。通过加入2微升10毫摩尔的DN TPS（不含DCTP）和2微升六核苷酸来制备放射性探针。混合1微升AU和5微升³²P-D-C-T-P，在37°C下孵育1小时。孵育结束后继续后续操作。通过在3000转/分钟下离心2分钟来制备G 50柱。然后将探针加载到柱上，并在3000转/分钟下离心所得物2分钟，收集流出液。此时，使用标准方法测量流出液的放射性，以确定探针每毫升的每分钟计数。接下来，将探针煮沸5分钟。之后立即在冰上冷却探针5分钟。此时探针已准备好用于杂交，无需取出膜。将探针以每分钟每毫升5×10⁵计数浓度直接移取到杂交管中的预杂交溶液中。将杂交管于65°C孵育过夜，次日进行后续操作。根据机构放射性物质处理规程弃去杂交溶液，用移液器加入25 mL 2×SSC + 0.1% SDS溶液至管中，在室温下洗涤膜15分钟。弃去溶液，用移液器将 25 毫升 0.1 倍 SSC 加 0.1% SDS 加入管中。在 65 摄氏度下洗涤膜 30 分钟。此次洗涤后，弃去溶液，并用 25 毫升 0.1 倍 SSC 在室温下快速冲洗膜。将膜用保鲜膜包裹，放入暗室中的曝光盒内。将一张胶片置于膜的上方，并合上曝光盒以避光。将曝光盒放入-80摄氏度冰箱中冷冻六小时。六小时后，显影胶片，并通过将病毒条带的密度与质粒标准品的条带进行比较，确定病毒储备液的滴度。滴度确定后，可用该病毒转导细胞，首先接种一乘以十的四次方个 Hep 293TT 细胞。在96孔板的每个孔中，将细胞于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育至少18小时。孵育结束后，吸去每孔中的培养基，小心地向每孔加入50微升不含抗生素和胎牛血清（FBS）的培养基。随后吸去该培养基，重复此步骤以洗涤细胞。将重组 a a v 载体用不含 FBS 和抗生素的培养基稀释至每细胞 5,000 VGS 的终浓度。每孔加入 50 微升该溶液，或每孔加入 50 微升不含 FBS 的培养基作为阴性对照，置于 37°C、5% 二氧化碳培养箱中孵育 2 小时。孵育结束后，吸除含病毒的培养基，用完全培养基每孔 50 微升，按之前方法洗涤细胞两次。弃去最后一次洗涤液后，向每孔加入 150 微升完全培养基，将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中孵育 72 小时。最后，使用荧光显微镜观察 EGFP 表达。可使用 Image J 软件对荧光强度进行定量分析，转基因表达水平以每视野绿色荧光的总面积进行评估。用于测定RAV-3载体滴度的定量DNA点印迹示例结果如图所示。该膜使用P32标记的EGFP特异性DNA探针进行杂交。点印迹上排为经Ben Nase消化的纯化病毒储备液的两倍系列稀释样本。中间和底部两行分别为由一纳克或十纳克质粒稀释而成的 A-A-V-E-G-F-P 标准品。病毒储备液的滴度通过与质粒标准品比较来确定。印迹上显示的数字对应于质粒 DNA 拷贝数。这是重组腺相关病毒载体介导的外源基因表达的一个示例。在人肝母细胞瘤细胞系中，于转导后72小时使用荧光显微镜观察细胞。第一幅图像展示了空白感染对照的结果。第二张图像显示了在37摄氏度条件下，用每细胞5,000 VGS的所有AAV2-EGFP载体转导的HEP 293TT细胞。最后一张图像显示了在相同条件下，用每细胞5,000 VGS的RAAV3-EGFP进行转导的结果。可以看出，与RAAV2相比，RAAV3在转导此类细胞方面效率显著更高。该方法有助于回答基因治疗领域中的关键问题，例如如何靶向人肝癌细胞。由于V三能够在人肝癌中高水平特异性表达治疗基因，该技术的应用前景可拓展至人肝癌的治疗。

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高效率转导肝癌细胞的重组腺相关病毒血清型3载体

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