生物分子检测的干涉反射成像传感器（IRIS）
May 3rd, 2011
免费的生物分子检测定量，高通量，实时，标签（DNA，蛋白质等）上的二氧化硅 2表面可以实现用一个简单的干涉技术，依靠LED照明，最小的光学元件，和一个摄像头。干涉反射成像传感器（IRIS）是价格低廉，使用简单，并适合芯片格式。
以下实验的总体目标是使用称为 Iris 的灵敏且无标记的传感平台量化抗体与表面固定抗原的结合。这是通过首先在化学功能化的均匀二氧化硅表面上制备一系列测试和控制探针以从溶液中捕获目标蛋白质来实现的。固定探针可以是抗体或抗原、DNA 或 RNA 或与功能化、聚合物或理智表面化学成分相容的任何其他类型的大分子。
然后将制备好的微阵列芯片与含有目标蛋白质的样品一起孵育，从而在研究人员指定的条件下进行结合。接下来，以不同波长的光对整个传感器阵列进行成像。使用 IRIS 系统，每个像素的反射强度都使用自定义编码算法进行处理。
为了量化与每个测试或对照条件结合的生物材料量，获得孵育后结果，基于该系统的干涉无标记测量，显示复杂混合物中抗体的有效检测和绝对定量基于十多年对光干涉和树脂腔设备的研究和开发， 我们开发了这种新方法，可以克服我们在以前的 label Free 生物传感器系统中遇到的许多混杂问题。这种方法的视觉演示至关重要，因为数据收集步骤需要正确的归一化并遵循质量控制程序。确保准确和可重复的数据采集。
为了将其二氧化硅衬底与自吸收 copo dmma NAS 图共同铺设，首先将 100 毫克聚合物添加到 5 毫升去离子水中来修复聚合物溶液。然后加入 5 毫升 40% 饱和硫酸铵，使硫酸铵的最终浓度为 0.92 摩尔。孵育后，将芯片浸入聚合物溶液中，在摇床上浸泡 30 分钟。
用去离子水彻底冲洗薯片，用氩气或氮气干燥薯片，然后在 80 摄氏度下烘烤 15 分钟。将聚合物涂层的基材芯片存放在干燥的环境中，例如真空干燥，最多两到三个月，直到探针点样程序稀释每个探针。首先，确定探针储备溶液和缓冲液的正确体积，以达到所需的最终浓度。
典型的实验是将抗原或 IgG 作为浓度为 0.5 毫克/毫升的磷酸盐缓冲盐水中，以计算量的每种探针储备溶液的量添加到含有所需量 PBS 缓冲液的小 eend orph 管中，混合溶液。然后将探针溶液移液到 96 孔低蛋白结合板中，该板将用作点样器的源板。接下来，通过确定每个网格中每个条件的重复次数来设置打印阵列的点样参数。
网格布局了复制网格的数量和芯片上所需的点样位置。将底物和源板放入去样器中，然后检查废液和供应瓶。开始打印运行。
点样完成后，将底物置于高湿度环境中过夜，以便在孵育后继续进行固定和去活过程。首先将芯片放入含 0.1% 吐温的 PBS 中 3 分钟，分 3 次，搅拌洗涤底物。随后在 PBS 中孵育 3 次，每次 3 分钟，然后在去离子水中孵育。
如果进行干式测量，请用氩气彻底干燥芯片。在摇床板上将芯片浸入 50 毫摩尔乙醇胺溶液中，将 pH 值调节至 7.4 30 分钟，以灭活共聚物表面剩余的 NHS 基团。在孵育程序开始之前，使用 PBS 彻底冲洗乙醇胺，然后用去离子水冲洗。
在 PBS 中制备适当浓度的靶蛋白溶液用于此演示。使用每毫升 500 纳克抗人血清白蛋白，包括等体积的无靶标缓冲液，用于阴性对照孵育。光圈系统由几个基本元件组成，例如照明源、用于正确照亮传感器探头阵列的光学元件、用于记录反射光强度的相机以及放置样品进行测量的载物台。
首先对裸露干净的硅芯片进行硅镜扫描，以便在执行扫描之前对所有随后收集的数据进行标准化。通过调整实验参数来准备光圈系统。这包括测量相机记录的光强度直方图，以及设置最佳强度的曝光时间。
归一化扫描后，将准备好的探针阵列加载到虹膜系统中，并像以前一样执行设置，设置焦点以正确成像基板表面。通过检查记录的直方图的反射光强度，确保样品台处于水平状态。最后，选择要在其下保存数据的文件名。
初始化软件以扫描阵列，它以不同波长多次照射表面并平均收集到的图像。确定初始光学高示教点，以便在初始扫描后孵育后正确分析表面质量的变化，将芯片浸入准备好的孵育溶液中，在摇床板上孵育一小时。孵育时间可能会有很大差异，具体取决于植被水平、被检测目标的浓度以及目标探针对的亲和力。
孵育后，重复之前执行的洗涤程序。使用 Iris 系统扫描相同的 pro 阵列，以获得孵育后图像，用于孵育前比较。如有必要，可以对不同的孵化步骤重复此过程。
例如，在使用二抗的夹心检测形式中，使用市售软件拟合每次虹膜扫描收集的图像，以生成包含光学厚度形成的 proby 图像。可以通过减去孵育后和孵育前的图像来对结合进行快速定性分析。结合将表现为在观察到质量变化的那些位置的强度变化。
对于定量分析，通过平均光斑内每个像素和光斑外环形的光学厚度信息，确定每个光斑与背景相比的质量密度。然后对此处显示的这两个区域进行直接比较。例如，用代表性抗体阵列点样的层状硅、二氧化硅虹膜底物的示意图。
每个抗体集合都以重复方式点样，针对不同的表位，靶向不同的蛋白质。以两种不同的全病毒和一种病毒蛋白为例。目标。阴性对照抗体取决于检测方法，可以是非特异性的和/或病毒特异性的。
以下是人血清白蛋白特异性抗体与一系列斑点 HSA 和兔 IgG 对照点结合的定性结果示例，如图所示。在拟合和确定孵育前后图像的光学厚度后，可以创建结合阵列的差异图像以快速评估结合。更多的 hor 定量分析表明，当抗 HSA 孵育浓度为 500 ng/ml 时，HSA 和兔 IgG 斑点的平均光学高度变化分别为 2.05 和 0.13 纳米。
此条形图表示 Iris 测量可以提供的定量数据的示例。在这个例子中，提出了 fur 蛋白结合对蛋白质浓度和双链所有韧带长度的依赖性。该条形图显示了初始固定的所有韧带支柱高度和孵育后结合的绝对光学高度测量值。
将 fur 蛋白的浓度增加到 5、100 和 200 纳摩尔导致与 DNA 探针的结合增加。这里显示了每个双链 DNAA 韧带计算的 fur 蛋白二聚体结合。在 200 纳摩尔的 fur 蛋白浓度下，二聚体结合显着增加，表明高水平的非特异性所有韧带相互作用或 fur 蛋白结合的不同机制，例如多个二聚体的聚集。
在尝试此程序时，重要的是要记住从具有适当氧化物厚度的干净均匀的基材开始，并用镊子小心处理样品以保持清洁。使用已正确储存且已知有效的试剂也很重要。观看本视频后，您应该对如何通过在二氧化硅表面制备功能性探针阵列，以及使用干涉反射成像传感器或光圈进行数据采集和分析，以无标记形式测量生物分子作用有了很好的了解。
概述
本研究提出了一种使用干涉反射成像传感器（IRIS）进行无标记生物分子检测的新方法。该技术利用简单的光学组件和LED照明，实现了对二氧化硅表面上生物分子的高通量定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物分子检测
- 光学传感技术
- 微阵列技术
背景
- IRIS旨在实时检测蛋白质和核酸等生物分子。
- 该方法解决了先前无标记生物传感器系统面临的挑战。
- 它采用了一个简单的设置，只需最少的光学组件。
- 该技术具有成本效益和用户友好性。
研究目的
- 量化抗体与固定抗原的结合。
- 展示IRIS系统在生物分子分析中的有效性。
- 提供该方法的视觉演示，用于准确的数据收集。
使用的方法
- 在二氧化硅表面准备微阵列。
- 用目标蛋白孵育阵列。
- 在不同波长下成像传感器阵列。
- 用自定义算法处理反射强度以进行定量。
主要结果
- 成功量化了复杂混合物中抗体的结合。
- 使用无标记测量有效检测生物材料。
- 展示了IRIS系统在实时分析中的能力。
- 通过严格的质量控制程序验证了该方法。
结论
- IRIS系统为生物分子检测提供了可靠的平台。
- 这种方法可以显著提高生物分子研究的效率。
- 未来应用可能会扩展到各种生物学研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Label-free biomolecular detection addresses critical bottlenecks in early discovery by eliminating confounding variables from labeling reagents, thereby improving target validation confidence and reducing mechanistic ambiguity. The Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS) enables quantitative, real-time analysis of biomolecular interactions on microarray platforms, supporting high-throughput screening and assay standardization. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports risk-adjusted portfolio decisions in therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct measurement of antibody-antigen binding kinetics without label-induced artifacts, improving target specificity assessment.
- Operational Value: Provides absolute quantification of biomolecules in complex mixtures, supporting accurate affinity measurements for lead selection.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific from non-specific binding through interferometric thickness measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports multiplexed detection of multiple biomarkers on a single substrate, increasing screening efficiency for target panels.
- Operational Value: Delivers reproducible, label-free optical readouts that reduce reagent consumption and assay variability compared to fluorescent or enzymatic methods.
- Scalability: Compatible with standard microarray spotting equipment and silicon-based substrates, enabling integration into existing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables consistent measurement of biomarker expression from discovery through preclinical validation using the same label-free platform.
- Mechanistic De-risking: Allows real-time monitoring of binding events to assess complex formation and aggregation risks in therapeutic candidates.
- Predictive Confidence: Quantitative optical thickness outputs support go/no-go decisions by providing dose-response data for target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
IRIS fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative binding data informs hit-to-lead progression and assay readiness for downstream screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct, label-free quantification of biomolecular interactions in complex biological samples.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput optical measurements that improve assay reproducibility and reduce false positives from labeling artifacts.
- Analytics: Provides quantitative mass density and binding affinity data through interferometric signal processing, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Ensures measurement continuity across development stages by eliminating label-dependent variability in biomarker detection.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform capability applicable across multiple target classes and therapeutic areas due to its label-free, microarray-compatible design.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Eliminates label-induced perturbations, improving data fidelity for target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Reduces assay complexity and cost by removing labeling steps, enabling faster turnaround and higher throughput.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing direct, quantitative binding measurements that reduce false leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization through reproducible, label-free affinity data that informs advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and microarray preparation for consistent probe immobilization.
- Depends on stable optical instrumentation and controlled environmental conditions for reliable interferometric measurements.
- Necessitates standardized washing and blocking procedures to minimize non-specific binding across replicates.
- Involves calibration steps using reference substrates to normalize signal intensity across experimental runs.
- Limited by the need for clean, uniform silicon dioxide substrates with controlled oxide thickness for optimal sensitivity.
