Name: 生物分子检测的干涉反射成像传感器（IRIS） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 了解干涉反射成像传感器（IRIS）技术，利用无标记光学传感方法在二氧化硅表面进行高通量生物分子检测。该技术通过LED照明和定制算法实现抗体与抗原结合的实时定量分析，为生物医学研究提供经济高效且可靠的检测平台。

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作者谨此感谢共同赞助及商业化合作伙伴 Zoiray Technologies Inc. 提供的支持。

1. 底物制备
<ol>
<li>涂层硅-二氧化硅层2 具有自吸附共聚物（DMA-NAS-MAPS）的底物：
 <ol>
 <li>共聚物的合成、化学结构及涂层制备方法发表于：G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, L.E. Depero. 《用于DNA微阵列玻片的聚合物吸附涂层的表征》. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58.</li>
 <li>简而言之，将100 mg聚合物加入5 mL去离子（DI）水中配制聚合物溶液，并加入5 mL 40%饱和硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）溶液。4)2SO4) 溶液，使其终浓度达到 0.92 M。</li>
 <li>将芯片置于溶液中，在摇床上浸泡30分钟，然后用去离子水彻底冲洗。用氩气/氮气彻底吹干。2 气体</li>
 <li>烘烤芯片于 80 °C 15分钟。</li> 
</ol>
</li>
<li>将聚合物包被的基底/芯片储存于干燥环境（真空干燥器）中，最长可保存3个月，直至进行探针点样操作。</li>
</ol>
2. 探针阵列的制备：抗体、抗原、单链/双链DNA、RNA等
<ol>
	<li>将探针稀释至所需缓冲液中的适当浓度。此步骤可能差异较大，但典型的实验通常在 pH≈7.4 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用浓度为 0.5 mg/mL（范围为 0.1–1 mg/mL）的抗原或 IgG。</li>
	<li>将溶液置于 96 孔或 384 孔板中（或根据所用点样仪的标准源板）。</li>
	<li>设置所需打印阵列的点样参数：确定适用于所用表面和溶液的点样参数（停留时间、接近速度等）。确定每个网格中每种条件的重复次数、网格布局、重复网格的数量以及芯片上的目标点样位置。将基底和源板放置在相应位置，检查废液瓶和试剂瓶是否准备就绪，然后开始打印运行。</li>
	<li>点样完成后，将基底置于高湿度环境中过夜（4–18 小时），以使固定化和失活过程充分进行。</li>
	<li>洗涤基底：依次在以下溶液中各洗涤三分钟，共洗涤三次：含 0.1% Tween 的 PBS（PBST）、PBS，最后为去离子水（DI water）。根据实验类型（湿法或干法），用氩气彻底干燥芯片后开始孵育，或将芯片放入流动池中组装。</li>
	<li>通过将芯片浸入 pH 调至 7.4 的 50 mM 乙醇胺溶液中 30 分钟（置于摇床上）以封闭共聚物表面剩余的 NHS 基团。也可使用含伯胺的化合物如羟胺或 Tris，只要所配制溶液对蛋白质安全即可。随后用 PBS 和去离子水彻底冲洗去除失活溶液。</li>
	<li>可选步骤（取决于所使用的表面化学）：使用 BSA、酪蛋白或复溶脱脂牛奶溶液封闭表面 30 分钟。对于我们当前使用的聚合物表面化学，此步骤无需进行，因为聚合物骨架本身可防止非特异性蛋白结合。</li>
</ol>
3. 数据采集与孵育程序：终点法格式
<ol>
<li>在所需的缓冲液中配制目标物溶液。此处为在 PBS 中配制适当浓度的抗-BSA 溶液（例如：配制 1–10 mL 浓度为 10 ng/mL 的抗-BSA PBS 溶液）。同时，确保准备等量不含目标物的缓冲液，用于阴性对照孵育。</li>
<li>采集硅镜扫描数据，用于归一化后续所有采集的数据。</li>
<li>在孵育步骤之前，使用 IRIS 系统扫描已制备的探针阵列，以确定每个点的初始光学高度（质量）。这将有助于在孵育后对表面质量变化（即结合水平）进行准确分析。在此过程中，需根据当前实验调整若干参数，例如曝光时间、视场、精确聚焦等。</li>
<li>将芯片浸入已配制的溶液中，在摇床平台上孵育 1 小时。孵育时间可根据振荡强度、待检测目标物的浓度、流动池的传质特性（若采用实时检测模式）、目标物与探针之间的亲和力等因素而有较大变化。</li>
<li>孵育结束后，重复步骤 2.5 中所述的洗涤程序。</li>
<li>使用 IRIS 系统再次扫描同一探针阵列，并获取孵育后的图像，以便与孵育前进行比较。</li>
<li>如有必要，可重复此过程进行不同的孵育步骤，例如在夹心法检测中使用二抗的情况。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
<li>使用实验室开发的软件对每次 IRIS 扫描（一系列强度图像）所采集的图像进行拟合，生成包含光学厚度信息的探针阵列图像。可通过减去（已配准的）孵育后与孵育前图像，快速进行结合情况的定性分析。结合现象将表现为在发生质量变化的位点处强度发生变化。对于定量分析，通过分别对每个位点内像素及其外围环形区域内的像素的光学厚度信息取平均值，并直接比较这两个区域，从而确定各点相对于背景的质量密度。</li>
</ol>
5. 典型结果：
图1显示了层状Si-SiO2 IRIS基底上点样代表性抗体阵列的示意图。每种抗体集合均以重复形式点样，分别特异性识别不同蛋白上的不同表位。图中以两种不同的完整病毒和一种病毒蛋白作为示例靶标。阴性对照抗体取决于具体检测方案，可为非特异性抗体和/或病毒特异性抗体。
图2显示了人血清白蛋白（HSA）特异性抗体与点样在芯片上的人血清白蛋白（HSA）及兔IgG（对照）位点的结合情况。如图所示，在对孵育前和孵育后的图像进行拟合并确定其光学厚度后，可生成结合阵列的差值图像，以定性评估结合情况。定量分析结果显示，在抗HSA抗体孵育浓度为500 ng/mL时，HSA位点和兔IgG位点的平均光学高度变化分别为2.05纳米和0.13纳米。
图3展示了Fur蛋白结合对蛋白浓度和双链DNA寡核苷酸长度的依赖性的IRIS测量结果。上方图表显示了初始固定的寡核苷酸探针高度以及孵育后Fur结合的绝对光学高度测量值。随着Fur浓度的增加（50、100、200 nM），其与DNA探针的结合量也随之增加。寡核苷酸的长度也影响Fur的结合，较长的序列导致更多的结合。此处误差线表示均值的一个标准差。下方图表显示了每条双链DNA链上计算得到的Fur蛋白二聚体结合量。在Fur蛋白浓度为200 nM时，二聚体结合显著增加，提示存在高水平的非特异性结合。
<img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="抗体芯片示意图；特异性检测；层状Si-SiO2基底；病毒鉴定。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. IRIS系统中用于多重检测特定病毒及病毒组分的典型探针芯片示意图。
<img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="显示使用抗HSA和兔IgG孵育进行蛋白质检测的微阵列实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 采用该无标记系统在500 ng/mL浓度下检测抗人血清白蛋白特异性抗体与点样HSA结合后的孵育后差异图像。每个点的生物材料面密度通过计算点内光学厚度信息的平均值，并与点周围代表背景的环形区域的平均值进行比较而确定。
<img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="光学生物传感器高度与探针条件的柱状图；Fur 蛋白-DNA 相互作用分析；浓度变化" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. Fur 蛋白与含有已知共识序列的点样双链寡核苷酸结合数据的曲线图，该图基于寡核苷酸长度、共识序列在寡核苷酸中的位置以及 Fur 蛋白浓度。上方图中各点样序列结合的 Fur 蛋白绝对量可用于估算结合到每种类型寡核苷酸上的 Fur 二聚体数量（下方图）。

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

IRIS 平台是一种简单且快速的系统，可用于以微阵列形式收集高通量结合数据。通过将不同的功能蛋白或 DNA 探针共价固定在表面，可从溶液中捕获目标抗原、生物标志物等，类似于免疫测定。利用 IRIS 系统以终点或实时方式测量这些探针条件下的相互作用，可为每种相互作用收集高灵敏度和定量的信息。此处详述的代表性实验仅是该技术可研究的相互作用类型之一。此前已成功检测转录因子、病毒抗原及完整病毒，这些仅是 IRIS 能够轻松处理的分析类型的几个示例。

<table><tbody><tr><td>带有500 nm热生长二氧化硅的硅晶圆</td><td>Silicon Valley Microelectronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）10X即用型浓缩液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白抗体（Anti-HSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0433</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白（HSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>氩气或氮气（超高纯度）</td><td>Airgas</td><td>AR UHP300 或 NI UHP300</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，60 mm × 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Scienceware&amp;#174; 真空干燥器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>96孔板，低细胞结合</td><td>Nalge Nunc International</td><td>145399</td><td></td></tr><tr><td>BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>羟胺</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>多功能旋转仪，型号 #2314</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2314Q</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 2000R 相机</td><td>QImaging</td><td>01-RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>AcuLED 照明光源</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学元件（透镜、物镜、光阑、导轨、支架等）</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

采用干涉反射成像传感器（iris）进行生物分子检测

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

生物分子相互作用的灵敏检测在基础生物学和微生物学、环境/农业/生物防御监测、纳米生物技术等多个领域和行业中具有广泛应用。在诊断应用中，通过监测（检测）患者样本中靶向蛋白质组或基因组生物标志物的存在、缺失或异常表达，可用于确定治疗方案或评估治疗效果。在科研领域，分子亲和力和特异性信息有助于全面表征被研究的系统。
目前用于测定分子浓度或亲和力的许多系统依赖于标记物的使用。这些系统的例子包括酶联免疫吸附测定（ELISA）等免疫分析法、聚合酶链式反应（PCR）技术、凝胶电泳分析以及质谱法（MS）。通常，这些标记物具有荧光性、放射性或比色性质，并被直接或间接地连接到目标分子上。尽管标记物的使用已被广泛接受并具有一些优势，但其缺点正在推动新型无标记方法的发展，以用于测量这些相互作用。这些缺点包括一些实际方面的因素，如检测成本增加、试剂的保质期和可用性、储存与安全问题、标记过程所耗费的时间和精力，以及由于标记过程或标记物本身导致的不同试剂之间的变异性。从科学研究的角度来看，使用这些标记物还可能带来一些困难，例如标记物的存在可能影响蛋白质的功能或结构，以及无法实时直接测量分子间的相互作用。
本文介绍了一种新型无标记光学生物传感器的应用，该传感器适用于微阵列研究，称为干涉反射成像传感器（Interferometric Reflectance Imaging Sensor, IRIS），可用于检测蛋白质、DNA、抗原物质、完整病原体（病毒颗粒）及其他生物材料。IRIS系统已被证实对不同的生物分子相互作用具有高灵敏度、高精确度和良好的重复性[1-3]。其优势包括多重成像能力、实时和终点测量功能，以及其他高通量特性，如试剂消耗量少、检测时间缩短。此外，IRIS平台操作简便，所需设备成本低廉，并采用基于硅的固相检测组件，因此可与当前多种表面化学方法兼容。
本文介绍了IRIS系统从探针阵列制备到靶标结合孵育及检测，直至终点式结果分析的完整应用流程。模型系统为在HSA点样基底上捕获针对人血清白蛋白（HSA）的特异性靶向抗体。

在SiO2表面，利用一种简单的干涉测量技术，可实现对生物分子（如DNA、蛋白质等）的定量、高通量、实时且无需标记的检测。该技术依赖LED照明、极少的光学元件和一台相机。干涉反射成像传感器（IRIS）成本低廉、操作简便，并适用于微阵列格式。

采用干涉反射成像传感器（IRIS）进行生物分子检测

生物分子相互作用的灵敏检测在基础生物学、微生物学等多个领域和行业中具有广泛应用，……

以下实验的总体目标是利用一种名为Iris的高灵敏度、无标记传感平台，定量检测抗体与表面固定的抗原之间的结合。该方法首先在经过化学功能化的均匀二氧化硅表面上制备测试探针和对照探针阵列，以从溶液中捕获目标蛋白质。这些固定的探针可以是抗体或抗原、DNA或RNA，或其他任何与功能化、聚合物或硅烷表面化学相容的大分子。制备好的微阵列随后与含有目标蛋白的样品孵育，使结合反应在研究人员指定的条件下进行。接着，在不同波长的光照下对整个传感器阵列进行成像。在IRIS系统中，每个像素的反射强度通过定制编码的算法进行处理。为了量化每种测试或对照条件下结合的生物材料量，需获得孵育后的结果，这些结果基于该系统的干涉测量无标记检测技术，可实现对复杂混合物中抗体的有效检测和绝对定量。该方法建立在十余年光学干涉和树脂微腔器件研究与开发的基础之上，能够克服我们此前无标记生物传感器系统中遇到的诸多干扰问题。本方法的可视化演示至关重要，因为数据采集步骤必须遵循正确的归一化和质量控制流程，以确保数据获取的准确性和可重复性。首先，将100毫克聚合物加入5毫升去离子水中，配制聚合物溶液。然后加入5毫升40%饱和硫酸铵溶液，使最终硫酸铵浓度为0.92摩尔。将芯片置于聚合物溶液中，在摇床中孵育30分钟。用去离子水彻底冲洗芯片，用氩气或氮气吹干芯片，然后在 80 摄氏度下烘烤 15 分钟。将聚合物包被的基底芯片存放在干燥环境中，例如真空干燥器中，可保存两到三个月，直至进行探针点样以稀释各探针。首先，确定探针储备液和缓冲液的合适体积，以达到所需的最终浓度。一个典型的实验是将抗原或IgG以0.5毫克/毫升的浓度溶于磷酸盐缓冲液中，并根据每种探针储备液的计算量加入到含有适量PBS缓冲液的微量离心管中，混匀溶液。然后将探针溶液用移液器加入96孔低蛋白结合板中，该板将作为点样仪的源板。接下来，通过确定每个条件下每网格的重复次数，设置打印阵列的点样参数。网格布局设置芯片上重复网格的数量及所需的点样位置。将基底和源板放入点样仪中，然后检查废液瓶和试剂瓶。开始打印运行。点样完成后，将基质置于高湿度环境中过夜，以使固定和失活过程在孵育后得以进行。通过振荡洗涤基质，首先将芯片浸入含0.1%吐温的PBS溶液中3分钟，重复3次；随后在PBS中孵育3次，每次3分钟，再在去离子水中同样孵育3次，每次3分钟。若进行干测量，需用氩气将芯片彻底吹干。将芯片浸入pH值调至7.4的50毫摩尔乙醇胺溶液中，在摇床平台上反应30分钟，以封闭共聚物表面剩余的NHS基团。在开始孵育程序之前，先用PBS充分清洗乙醇胺，再用去离子水彻底冲洗。 为本演示准备适当浓度的目标蛋白 PBS 溶液。使用每毫升含 500 纳克抗人血清白蛋白的溶液，并为阴性对照孵育设置加入等体积不含目标蛋白的缓冲液。虹膜系统由几个基本元件组成，例如照明光源、用于适当照射传感器探针阵列的光学组件、用于记录反射光强度的相机，以及用于放置样品进行测量的载物台。首先对洁净的裸硅芯片进行硅镜扫描，以在执行扫描前对所有后续采集的数据进行归一化处理。通过调整实验参数来准备光阑系统，包括测量相机记录的光强直方图，并设置最佳曝光时间以获得理想的光强。归一化扫描完成后，将制备好的探针阵列载入虹膜系统，并按之前的方法进行设置，调整焦距以正确成像基底表面。通过检查记录的反射光强度直方图，确保样品台处于水平状态。最后，选择一个文件名以保存数据。启动软件以扫描阵列，该过程会以不同波长多次照射表面并平均采集的图像。确定初始光学高亮点，以便在初次扫描后、孵育结束后，对表面质量变化进行准确分析。将芯片浸入预先准备好的孵育溶液中，在摇床平台上孵育一小时。孵育时间可根据植被程度、待检测目标物的浓度以及目标探针对的亲和力而有较大变化。孵育结束后，重复之前进行的洗涤步骤。使用iris系统扫描同一张蛋白芯片，以获取孵育后的图像，用于与孵育前进行比较。如有需要，此过程可针对不同的孵育步骤重复进行。例如，在使用二抗的夹心法检测中，可利用商业开发的软件对每次虹膜扫描采集的图像进行拟合，生成包含光学厚度信息的探针图像。通过减去孵育前后的图像，可快速进行结合情况的定性分析。在质量发生变化的位点，结合现象将表现为信号强度的改变。进行定量分析时，通过计算每个斑点内各像素的光密度信息平均值以及斑点外环形区域的光密度信息平均值，来确定各斑点相对于背景的质量密度。然后对这两个区域进行直接比较，如图所示。例如，带有代表性抗体阵列的分层硅、二氧化硅光阑基底的示意图。每种抗体集合均以重复点样，针对不同表位，靶向不同的蛋白质。以两种不同的完整病毒和一种病毒蛋白作为靶标的示例。阴性对照抗体取决于具体检测方法，可以是非特异性的和/或病毒特异性的。以下是人血清白蛋白特异性抗体与点样在芯片上的HSA及兔IgG对照点结合的定性结果示例。在对孵育前和孵育后的图像进行拟合并确定光学厚度后，可生成结合阵列的差值图像，以快速评估结合情况。进一步的定量分析显示，在抗HSA抗体孵育浓度为500 纳克/毫升时，HSA点和兔IgG点的平均光学高度变化分别为2.05纳米和0.13纳米。该柱状图展示了虹膜测量技术可提供的定量数据示例。本示例中呈现了毛蛋白结合对蛋白浓度及双链全配体长度的依赖性。该柱状图显示了初始固定化全配体支撑高度以及孵育后结合反应的绝对光学高度测量值。将fur蛋白浓度增加至5、100和200纳摩尔时，其与DNA探针的结合能力增强。此处显示的是计算得到的fur蛋白二聚体与双链DNA片段的结合情况。当fur蛋白浓度为200纳摩尔时，二聚体结合显著增加，提示存在高水平的非特异性全片段相互作用，或fur蛋白结合可能通过其他机制进行，例如多个二聚体的聚集。在进行该实验操作时，重要的是要记住，应从具有合适氧化层厚度的洁净均一基底开始，并使用镊子小心操作以保持样品清洁。同时，必须使用正确储存且已知功能正常的试剂。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过在二氧化硅表面制备功能性探针阵列，利用干涉反射成像传感器（iris）以无标记方式检测生物分子相互作用，并掌握相应的数据采集与分析方法。

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科研

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生物工程

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利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

本方案旨在指导如何在标准荧光显微镜上实施干涉反射显微技术，用于体外表面实验中对微管进行无标记、高对比度、高速成像。...

无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜技术实现

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

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利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。...

光学光热红外-荧光原位杂交（OPTIR-FISH）

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