采用干涉反射成像传感器（IRIS）进行生物分子检测

以下实验的总体目标是利用一种名为Iris的高灵敏度、无标记传感平台，定量检测抗体与表面固定的抗原之间的结合。该方法首先在经过化学功能化的均匀二氧化硅表面上制备测试探针和对照探针阵列，以从溶液中捕获目标蛋白质。这些固定的探针可以是抗体或抗原、DNA或RNA，或其他任何与功能化、聚合物或硅烷表面化学相容的大分子。

制备好的微阵列随后与含有目标蛋白的样品孵育，使结合反应在研究人员指定的条件下进行。接着，在不同波长的光照下对整个传感器阵列进行成像。在IRIS系统中，每个像素的反射强度通过定制编码的算法进行处理。

为了量化每种测试或对照条件下结合的生物材料量，需获得孵育后的结果，这些结果基于该系统的干涉测量无标记检测技术，可实现对复杂混合物中抗体的有效检测和绝对定量。该方法建立在十余年光学干涉和树脂微腔器件研究与开发的基础之上，能够克服我们此前无标记生物传感器系统中遇到的诸多干扰问题。本方法的可视化演示至关重要，因为数据采集步骤必须遵循正确的归一化和质量控制流程，以确保数据获取的准确性和可重复性。

首先，将100毫克聚合物加入5毫升去离子水中，配制聚合物溶液。然后加入5毫升40%饱和硫酸铵溶液，使最终硫酸铵浓度为0.92摩尔。将芯片置于聚合物溶液中，在摇床中孵育30分钟。

用去离子水彻底冲洗芯片，用氩气或氮气吹干芯片，然后在 80 摄氏度下烘烤 15 分钟。将聚合物包被的基底芯片存放在干燥环境中，例如真空干燥器中，可保存两到三个月，直至进行探针点样以稀释各探针。首先，确定探针储备液和缓冲液的合适体积，以达到所需的最终浓度。

一个典型的实验是将抗原或IgG以0.5毫克/毫升的浓度溶于磷酸盐缓冲液中，并根据每种探针储备液的计算量加入到含有适量PBS缓冲液的微量离心管中，混匀溶液。然后将探针溶液用移液器加入96孔低蛋白结合板中，该板将作为点样仪的源板。接下来，通过确定每个条件下每网格的重复次数，设置打印阵列的点样参数。

网格布局设置芯片上重复网格的数量及所需的点样位置。将基底和源板放入点样仪中，然后检查废液瓶和试剂瓶。开始打印运行。

点样完成后，将基质置于高湿度环境中过夜，以使固定和失活过程在孵育后得以进行。通过振荡洗涤基质，首先将芯片浸入含0.1%吐温的PBS溶液中3分钟，重复3次；随后在PBS中孵育3次，每次3分钟，再在去离子水中同样孵育3次，每次3分钟。

若进行干测量，需用氩气将芯片彻底吹干。将芯片浸入pH值调至7.4的50毫摩尔乙醇胺溶液中，在摇床平台上反应30分钟，以封闭共聚物表面剩余的NHS基团。在开始孵育程序之前，先用PBS充分清洗乙醇胺，再用去离子水彻底冲洗。

为本演示准备适当浓度的目标蛋白 PBS 溶液。使用每毫升含 500 纳克抗人血清白蛋白的溶液，并为阴性对照孵育设置加入等体积不含目标蛋白的缓冲液。虹膜系统由几个基本元件组成，例如照明光源、用于适当照射传感器探针阵列的光学组件、用于记录反射光强度的相机，以及用于放置样品进行测量的载物台。

首先对洁净的裸硅芯片进行硅镜扫描，以在执行扫描前对所有后续采集的数据进行归一化处理。通过调整实验参数来准备光阑系统，包括测量相机记录的光强直方图，并设置最佳曝光时间以获得理想的光强。

归一化扫描完成后，将制备好的探针阵列载入虹膜系统，并按之前的方法进行设置，调整焦距以正确成像基底表面。通过检查记录的反射光强度直方图，确保样品台处于水平状态。最后，选择一个文件名以保存数据。

启动软件以扫描阵列，该过程会以不同波长多次照射表面并平均采集的图像。确定初始光学高亮点，以便在初次扫描后、孵育结束后，对表面质量变化进行准确分析。将芯片浸入预先准备好的孵育溶液中，在摇床平台上孵育一小时。孵育时间可根据植被程度、待检测目标物的浓度以及目标探针对的亲和力而有较大变化。

孵育结束后，重复之前进行的洗涤步骤。使用iris系统扫描同一张蛋白芯片，以获取孵育后的图像，用于与孵育前进行比较。如有需要，此过程可针对不同的孵育步骤重复进行。

例如，在使用二抗的夹心法检测中，可利用商业开发的软件对每次虹膜扫描采集的图像进行拟合，生成包含光学厚度信息的探针图像。通过减去孵育前后的图像，可快速进行结合情况的定性分析。在质量发生变化的位点，结合现象将表现为信号强度的改变。

进行定量分析时，通过计算每个斑点内各像素的光密度信息平均值以及斑点外环形区域的光密度信息平均值，来确定各斑点相对于背景的质量密度。然后对这两个区域进行直接比较，如图所示。例如，带有代表性抗体阵列的分层硅、二氧化硅光阑基底的示意图。

每种抗体集合均以重复点样，针对不同表位，靶向不同的蛋白质。以两种不同的完整病毒和一种病毒蛋白作为靶标的示例。阴性对照抗体取决于具体检测方法，可以是非特异性的和/或病毒特异性的。

以下是人血清白蛋白特异性抗体与点样在芯片上的HSA及兔IgG对照点结合的定性结果示例。在对孵育前和孵育后的图像进行拟合并确定光学厚度后，可生成结合阵列的差值图像，以快速评估结合情况。进一步的定量分析显示，在抗HSA抗体孵育浓度为500 纳克/毫升时，HSA点和兔IgG点的平均光学高度变化分别为2.05纳米和0.13纳米。

该柱状图展示了虹膜测量技术可提供的定量数据示例。本示例中呈现了毛蛋白结合对蛋白浓度及双链全配体长度的依赖性。该柱状图显示了初始固定化全配体支撑高度以及孵育后结合反应的绝对光学高度测量值。

将fur蛋白浓度增加至5、100和200纳摩尔时，其与DNA探针的结合能力增强。此处显示的是计算得到的fur蛋白二聚体与双链DNA片段的结合情况。当fur蛋白浓度为200纳摩尔时，二聚体结合显著增加，提示存在高水平的非特异性全片段相互作用，或fur蛋白结合可能通过其他机制进行，例如多个二聚体的聚集。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，应从具有合适氧化层厚度的洁净均一基底开始，并使用镊子小心操作以保持样品清洁。同时，必须使用正确储存且已知功能正常的试剂。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过在二氧化硅表面制备功能性探针阵列，利用干涉反射成像传感器（iris）以无标记方式检测生物分子相互作用，并掌握相应的数据采集与分析方法。