Name: MG53介导的细胞膜使用维修的可视化在体内在体外系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 了解MG53介导的细胞膜修复机制，通过体内外系统可视化研究骨骼肌纤维损伤修复过程。本方法结合UV激光、荧光染料与显微技术，为再生医学和细胞生物学研究提供重要实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 跑台运动用于揭示小鼠模型肌肉损伤程度
<ol>
 <li>设定跑步机在跑步方案中使用的表面角度。通常采用水平平面，或7°至15°的下坡或上坡角度。一些跑步机自带调节坡度的装置，而其他跑步机则需要通过外部方式抬高以实现倾斜。</li>
 <li>在将动物放入跑步机之前，在跑步机下方放置托盘或蓝色实验垫，以收集跑步过程中动物产生的排泄物。</li>
 <li>在跑步前，应使小鼠适应跑步机的环境。这包括将动物放入跑步机中15分钟，此时电刺激网格关闭，传送带驱动电机开启但传送带不移动（即速度设定为0 m/s）。</li>
 <li>开启激励用的电刺激网格。脉冲的强度和频率通常可在跑步机上进行调节，但不同制造商的设备设置可能有所不同。通常无需使用最大强度即可激励小鼠奔跑，而较高的频率（至少每两秒一次）有助于提高小鼠的配合度。</li>
 <li>启动跑步机传送带以开始跑步方案。初始速度建议约为5米/分钟，作为小鼠的热身阶段。随后可逐步增加跑步机速度，通常每分钟递增1–2米/分钟。</li>
 <li>在正式实验性跑步开始前，连续3至10天每天进行数次短时间（5分钟）的热身速度跑步，有助于提高大多数方案中小鼠的配合度。</li>
 <li>急性力竭运动通常涉及随时间逐渐增加跑步机速度，直至达到并维持最大速度（通常&lt; 30 m/min），直到小鼠出现力竭迹象为止。判断力竭的标准有所不同，但通常包括小鼠在电刺激网格上停留时间超过一半，或连续5秒停留在电刺激网格上且未返回跑步带表面。当某只小鼠力竭后，可将其从跑步机上移除，并记录其总跑步时间。</li>
 <li>在急性跑步实验中，可通过改变跑步机角度来增加运动负荷（使用上坡角度）或诱导造成肌肉纤维肌膜撕裂的离心性收缩损伤（使用下坡角度）1。在进行此类操作前，可向动物注射伊文思蓝染料，作为组织学染色剂用于识别受损的肌纤维2,3。</li>
 <li>耐力训练跑步方案旨在长时间（可达数月）对动物施加运动负荷，以诱导肌肉或心血管系统的重塑。热身程序与上述相同（步骤1.5），但最大速度通常较低，跑步时间可较长（&gt;1小时）。</li>
 <li>跑步结束后，可将小鼠放回笼中。跑步机在使用过程中通常会变得非常脏，尤其是在长时间的实验后。每次使用后必须清洁跑步机，通常使用70%乙醇喷雾进行消毒。</li>
</ol>
2. 离体 分离肌纤维在紫外激光损伤后膜修复能力的检测
<ol>
 <li>从小鼠足部解剖出趾短屈肌（FDB）肌肉的浅层部分。首先，沿足底正中线切开皮肤，注意不要损伤下方的肌肉，然后进行横向剪切并移除皮肤。可见FDB肌的扁平白色肌腱（近端肌腱）附着于跟骨。用镊子钝性分离该肌腱，并在靠近附着点处将其切断；用镊子夹住游离的肌腱，轻轻上提以分离FDB肌与其周围组织，同时剪断仍相连的结缔组织。当观察到远端肌腱分支至各个脚趾时，可在这些肌腱连接至深层肌肉的位置进行切断，从而将FDB肌完整取出。</li>
 <li>将FDB肌束放入1 ml预热至 37°C 在1.5 ml Eppendorf离心管中，将离心管水平固定 37°C 置于摇床中，200 rpm 振荡 65 分钟。孵育时间可能需要调整，以确保充分消化，消化充分的标志为肌肉呈现毛絮状外观和浅色。</li>
 <li>小心地将消化后的 FDB 组织束转移至 1.5 μl 含有约 ~ 的离心管600 μl 2.5 Ca2+ 用剪去末端、直径足够使消化后的组织束顺利通过而不破损的1 ml移液器吸头，将Tyrode液加入。轻轻翻转离心管，使组织束中的松散纤维脱落。</li>
 <li>剪切 30 μL 移液管吸头，使其直径仅略小于肌束（介于15 - 20 μm （直径）。使用移液器轻轻地将纤维束吸入移液管中，然后将其推回溶液中。重复此过程，直至大部分纤维从纤维束中分离。</li>
 <li>轻轻翻转离心管充分混匀解离的纤维，取所需量滴加至玻璃底delta T培养皿中。上样体积取决于分离效率以及特定实验方案所需在培养皿中获得的可用纤维数量。剩余纤维可保存在离心管中，置于 4°C 约6小时，用于进一步的研究。</li>
 <li>将培养皿静置5分钟，以使纤维附着于培养皿的玻璃底部。</li>
 <li>将玻璃底培养皿置于配备紫外激光器的共聚焦显微镜上，于相差显微镜下观察纤维 &gt;100倍放大以检查是否存在正常的横纹模式以及直的杆状形态。</li>
 <li>加入FM1-43或FM4-64苯乙烯基吡啶𬭩染料4至终浓度 2.5 μM5.</li>
 <li>将光纤置于成像窗口中以诱导光纤位置的损伤，使光纤的方向呈 45° 从视野的左上角到右下角的角度（图1）。照射一个5x5像素的区域（约 0.9μmx0.9μm使用紫外激光（80 mW 或更高，351/364 nm）以最大功率照射细胞质膜5秒。照射区域应使质膜发生分裂，即5×5方框的一半位于纤维内部，另一半位于纤维外部（图1）。</li>
 <li>每隔5秒拍摄一次染料进入纤维的图像，持续至多5分钟。</li>
 <li>每皿重复步骤2.8，但纤维数量不得超过3根，因为荧光染料最终会被纤维内吞，从而干扰数据分析。处理3根纤维后，应从步骤2.5开始制备新的培养皿。</li>
 <li>通过计算荧光强度的变化（ΔF/F）来分析数据0) 以测量染料进入量。这需要测量一个约 200 μm2 使用分析软件（如公开可用的 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/））进行分析。在比较不同纤维时，应对每一帧进行如下计算：ΔF/F0，其中 F0 是兴趣区域在首帧图像（t = 0；损伤前）的平均荧光强度，ΔF 为每一后续帧的荧光变化值（F-F0).</li>
</ol>
3. 活细胞共聚焦成像以监测细胞膜修复的动态过程
<ol>
 <li>微量移液器由PYREX毛细管制成。将毛细管置于微量移液器拉制仪上，使用预设程序进行拉制（加热温度=695；拉力=50；速度=55；时间=250）。</li>
 <li>将微量移液器固定在三维（xyz）显微操作器上。</li>
 <li>采用常规方法在玻璃底delta T培养皿中对细胞进行质粒DNA转染。实验开始前，应将培养基更换为含2.5 mM Ca2+的Tyrode缓冲液。</li>
 <li>将含有转染细胞的玻璃培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜上，使用40倍、1.3 NA的油浸物镜进行观察。</li>
 <li>通过将微量移液器插入细胞膜后迅速撤出，以实现急性活细胞损伤3,6。连续采集活细胞图像，时间间隔为1.54秒/帧。</li>
 <li>对于皂苷诱导的膜破裂实验，使用重力驱动的自行组装灌流系统，向体系中灌注含0.005%皂苷（Sigma）的2.5 mM Ca2+ Tyrode缓冲液7。灌流速率约为1 ml/min，灌流口应正对成像细胞的上方位置。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
在拍摄过程中可以制作小鼠跑台运动的代表性视频。该视频将展示由于骨骼肌损伤导致mg53-/-小鼠跑步能力下降的情况。
上述 UV 激光损伤方案所造成的损伤程度取决于所分析肌纤维的膜修复能力。这种能力受到肌纤维来源小鼠的基因型、细胞外环境以及蛋白质表达的任何改变（转染或感染）的影响。mg53-/- 小鼠来源的肌纤维由于膜修复能力受损，会表现出更显著的染料进入（图 2b），而正常野生型肌纤维仅表现出轻度至中度的染料进入（图 2a）。
微电极损伤的典型结果显示，含MG53的囊泡会转位至损伤部位。图3a和3b显示了通过将微移液管插入细胞膜造成损伤的GFP-MG53转染C2C12成肌细胞。在微移液管造成损伤前，GFP-MG53位于细胞质膜和细胞质中3。微移液管穿刺后，含GFP-MG53的囊泡向损伤部位移动（如箭头所示）。图3c显示经0.005%皂苷处理的GFP-MG53转染C2C12成肌细胞，皂苷是一种可使质膜通透化的去垢剂。经皂苷处理后，GFP-MG53从细胞质转位至细胞膜。
<img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="辐照肌肉纤维区域的显微镜图像；荧光研究显示5x5 µm区域。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
Weisleder, et al. 图1. 肌纤维排列与损伤区域定义。 展示了分离的肌纤维在视野中的正确取向以及损伤区域的界定。
<img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="细胞收缩荧光显微镜图像；延时序列；蛋白质动态可视化；μm 尺度。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
Weisleder 等，图 2。FDB 肌纤维的紫外激光损伤。 图像显示损伤前（0 秒，左侧）和损伤后 200 秒（右侧）的肌纤维。来自野生型小鼠的肌纤维（a）显示轻微损伤，而来自细胞膜修复功能受损小鼠的肌纤维（b）允许更多染料进入。
<img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="荧光显微镜示意图；利用蛋白质定位分析细胞结构；比例尺：20-10 μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
Weisleder, et al. 图3. 微电极与皂苷对培养细胞造成的损伤。 图像显示了C2C12成肌细胞（a, b）和一个C2C12成肌母细胞（c）在损伤前（上方）和损伤后（下方）的情况。使用微电极造成损伤的细胞（a, b）显示出MG53向损伤部位转位（箭头所示）。经皂苷处理的细胞（c）显示出MG53向细胞膜转位。

<ol><li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53%2C+caveolin-3%2C+and+dysferlin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioprotection+of+ischemia%2Freperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li>
<li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li>
<li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

跑台跑步是一种对实验动物施加运动负荷的有效方法。作为一种测量肌肉功能或耐力的方法，该技术的信噪比较低，难以以一致且可重复的方式实施8。通常，力竭时间可作为终点指标，用于检测实验组之间的显著差异，例如某些基因敲除小鼠品系与野生型小鼠之间的差异9。然而，对于产生较细微差异的实验干预（如某些药物试验），该技术的背景噪声可能掩盖组间差异。为了最大限度地提高该方法的可重复性和敏感性，必须严格保持每次实验条件的一致性。动物运动的时间以及热身阶段的条件均为重要影响因素，应在各次试验中保持恒定。
品系差异可能对跑步机实验方案的设计产生显著影响，因为某些小鼠品系在跑步机上的持续奔跑时间明显长于其他品系，并且对耐力运动的反应也不同10。一般而言，在力竭实验中，多数小鼠能够在跑步机速度持续增加的条件下（起始速度为5 m/min，之后每分钟增加1 m/min）累计奔跑200–300米。对于耐力运动训练，可让小鼠以9–12 m/min的速度每周进行2至3次、每次30分钟的跑步。然而，具体研究通常需要对实验方案进行一定优化，以满足特定的实验需求。
UV激光损伤方法已被证明是测量骨骼肌纤维膜修复能力的有效手段3,6,11。此类实验成功的关键要素之一是仅选用呈笔直杆状、横纹排列规则且肌膜表面光滑无皱褶的肌纤维。若选择其他类型的肌纤维，可能其本身已存在膜损伤，从而干扰实验结果的解读。此外，肌纤维的取向及照射区域的界定应如图1所示。这可确保产生大小可重复的损伤，从而实现不同肌纤维间的比较。若定义的损伤区域完全位于肌纤维内部，则将形成内部损伤，而非破坏肌膜。另外，所计算的ΔF/F0值对用于测量平均荧光强度的感兴趣区域（ROI）选择极为敏感。一个约200μm2、紧邻并包含损伤部位的区域是合适的。与定义的损伤区域不同，该区域应完全位于肌纤维内部。若将纤维外部空间纳入其中，则会导致在染料摄入较少的纤维中ΔF/F0升高，而在表型更严重的纤维中ΔF/F0降低。这会降低检测的灵敏度，从而使不同肌纤维之间的比较更加困难。
在微移液管损伤实验中，微移液管与玻璃底培养皿之间的角度应约为45度，以便有效损伤细胞膜。应选择牢固贴附在培养皿底部的细胞进行微移液管损伤，不应使用圆形细胞，因为它们在微移液管穿刺后很可能脱落。与微移液管穿刺实验相比，皂苷透化实验技术要求较低，操作相对更快。然而，皂苷损伤存在若干局限性，例如每个培养皿只能使用一个细胞，因为皂苷会扩散并对该培养皿中的其他细胞造成损伤。

<table><tbody><tr><td>啮齿类动物跑步机</td><td>Columbus Instruments Exer 3/6 或同类产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>ISC Bioexpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具，包括尖头镊子、弹簧剪刀</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mg/ml I型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Tyrode 缓冲液（140 mM NaCl，5 mM KCl，10 mM HEPES，2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，pH 7.2，290 mosm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Tyrode 缓冲液（140 mM NaCl，2.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5 mM KCl，10 mM HEPES，2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，pH 7.2，290 mosm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度可控轨道摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta TPG 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>1207133</td><td></td></tr><tr><td>配备 Enterprise 80 mW 紫外激光器的 LSM 510 共聚焦显微镜或同类共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FM1-43 或 FM4-64 染料</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管，规格 0.8-1.0 × 100 mm</td><td>PYREX</td><td>部件号 9530-2</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>型号 P-97</td><td></td></tr><tr><td>三轴显微操作器</td><td>Narishige International</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Radiance 2100 激光扫描共聚焦显微镜或同类显微镜</td><td>Bio-Rad</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr></tbody></table>

利用mg53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

细胞膜急性损伤的修复是正常细胞生理学中的基本过程，而细胞膜修复功能缺陷与多种退行性疾病相关。近期发现MG53是膜再封闭机制中的关键组分，这不仅有助于深入理解组织修复的基本生物学机制，也为再生医学中的转化应用提供了可能。本文详细描述了利用小鼠模型进行跑台运动实验以探究MG53在肌肉损伤修复中的in vivo功能、通过检测染料进入分离的肌纤维来评估ex vivo膜修复能力，以及利用活细胞共聚焦显微镜观察MG53介导的囊泡运输与细胞膜修复动态过程的实验方案。

本文描述了用于在整体动物和细胞水平上可视化MG53介导的细胞膜修复动态过程的实验方案。这些方法可用于研究质膜再封闭的细胞生物学及再生医学。

利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

细胞膜急性损伤的修复是正常细胞生理学的基本过程，而膜修复功能缺陷已与多种疾病相关联……

本实验的总体目标是评估动物体内及分离细胞的膜修复能力。收集分离的骨骼肌纤维，并将其置于含有FM 1-43染料的培养基中。随后使用紫外激光照射细胞膜的一部分，造成膜损伤，从而使染料进入细胞内。将分离的细胞转染表达GFP MG 53的质粒DNA，该蛋白将定位于细胞的质膜和细胞质中。随后，将微电极的尖端插入C2C12细胞膜以诱导损伤。最终可获得结果显示GFP MG 53向损伤部位的转位。该方法的可视化演示至关重要，因为掌握微电极穿刺和肌纤维分离技术需要经过实践训练。本次演示将由本实验室的实验室主管林博士、博士后研究员Wazu博士、研究生Matt Orange以及本系研究助理教授Shaza博士共同完成。实验开始时，先在跑步机下方放置一个托盘或蓝色实验垫，用于收集实验过程中动物产生的废弃物。接下来，设置跑步机表面的倾斜角度。一些跑步机自带调节坡度的装置，而另一些则需要通过其他方式抬高跑步机来实现倾斜。通常使用水平平面，或7至15度的上坡或下坡角度。将小鼠放置于跑台上进行适应，此时关闭电击网格，开启传送带驱动电机但不使其移动，适应15分钟后，打开用于激励的电击网格。以约5米/分钟的初始速度启动跑台，随后每分钟递增1至2米/分钟的速度，使动物进行5分钟的热身运动。每天重复此热身过程 3 到 10 天，以提高测试期间的依从性。进行急性力竭运动时，随时间逐渐增加跑步机速度，直至达到最高速度，并密切观察力竭迹象。当动物在跑台上停留时间少于一半，或在网格上连续停留五秒时，视为力竭。立即将力竭小鼠移除，并记录其总跑步时间。耐力训练。跑步实验方案均以相同的热身程序开始。然而，最大速度通常较低，且跑步时间可能较长。测试结束后将小鼠放回其饲养笼，并用70%乙醇清洁跑步机。从足部分离趾短屈肌的浅层组织以进行后续分析。首先，沿足底正中线切开皮肤，注意不要损伤下方的肌肉。接着，进行横向切口并去除皮肤。辨认附着于跟骨的趾短屈肌（FDB）的扁平白色肌腱。用镊子分离肌腱，并在靠近附着处将其切断。切割时轻轻向上牵拉肌腱，同时去除任何结缔组织。找到远端肌腱分支至各个脚趾的位置。在肌腱与深层肌肉连接处将其切断，并取出足底短屈肌（FDB）。将FDB肌束放入1毫升胶原酶溶液中，预先加热至37摄氏度。将试管水平固定于37摄氏度的摇床培养箱中，以200 RPM转速振荡65分钟。消化充分的标志是组织呈现絮状外观和浅色。剪去1毫升移液器吸头的末端，以便消化后的组织团块通过。将纤维束轻松转移至含有约 600 µL 2.5% 钙修饰台氏液的离心管中。轻轻翻转离心管，使纤维束中的松散纤维脱落。接下来，剪切一个30微升移液器吸头的末端，使其直径仅略小于肌束。用此吸头将肌束吸入移液器，然后将其推回溶液中。重复此过程，直至大部分肌纤维从肌束中分离。轻轻翻转离心管以混匀解离的纤维。取适量纤维滴加至玻璃底共焦培养皿中。将剩余纤维于4摄氏度保存约六小时，用于后续实验及其他研究。将培养皿静置五分钟，不要扰动。这一步骤可使纤维黏附到培养皿的玻璃底部。将玻璃底培养皿置于配备紫外激光器的共聚焦显微镜上。在相差显微镜下以超过100倍的放大倍数观察纤维，检查是否存在正常的横纹模式以及直杆状形态。向溶液中加入FM 1-43或FM 4-64染料，终浓度为2.5 µM。将纤维从视野的左上角至右下角呈45度角排列，以诱导损伤。照射细胞膜上一个5×5像素的区域。使用设定为最大功率的紫外激光照射五秒，照射区域应横跨细胞膜，使5×5方框的一半位于纤维内部，另一半位于纤维外部。每隔五秒拍摄一次染料进入纤维的图像，持续记录最长五分钟。每皿最多照射三条纤维，因为荧光染料最终会被纤维通过内吞作用摄入，从而干扰数据分析。使用三根纤维后，应准备一个新的培养皿。利用分析软件，计算约200平方微米区域内荧光强度的变化，以便在不同纤维之间进行比较。应对每一帧进行如下计算：ΔF除以F₀，其中F₀为第一帧中感兴趣区域的平均荧光强度，ΔF为后续每一帧中荧光强度的变化值。采用标准方法将表达GFP MG 53的质粒DNA转染细胞。然后制备显微注射针。将一个派热克斯玻璃毛细管置于显微注射针上。按照预设程序进行牵拉操作。将微量移液器连接至三轴显微操作器培养装置。从Delta T培养皿中移除培养基，并替换为2.5毫摩尔钙台氏缓冲液。将含有转染细胞的培养皿置于配备40倍、1.3数值孔径油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜上。通过将微移液管插入细胞膜后迅速将其抽出，以诱导急性活细胞损伤。对肌钙蛋白诱导的膜破裂过程，以每帧1.54秒的时间间隔连续采集活细胞图像。以每分钟约一毫升的速度，在成像细胞的上方直接灌注含0.005%肌钙蛋白的PERFU。跑步机可用于测量运动能力的下降。此处所示的MG53基因敲除小鼠由于骨骼肌损伤，其运动能力降低。UV激光造成的损伤程度取决于所观察肌纤维的膜修复能力。这是一只正常小鼠在损伤前的肌纤维图像。此图像拍摄于200秒后，显示有轻微损伤。来自膜修复能力受损的MG 53基因敲除小鼠的肌纤维在损伤后会表现出更显著的染料摄入。以下是一个未受损的转染了GFP-MG 53的C2C12成肌管的示例。此图像中的箭头指向含有GFP-MG 53的囊泡，这些囊泡正向损伤部位移动。在此示例中，使用皂苷破坏质膜。注意损伤后GFP MG 53从细胞质向细胞膜的转位。进行此操作时，务必记住要分离出具有光滑肌膜和清晰横纹模式的良好肌纤维。观看本视频后，您应充分了解如何评估肌肉细胞的膜修复能力以及细胞的培养方法。

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

MG53介导的细胞膜使用维修的可视化在体内在体外系统

本文详细描述了一种对枯草芽孢杆菌（Bacillus...

成像DNA损伤修复及细胞对DNA损伤的应答 枯草芽孢杆菌

本视频展示了一种用于研究哺乳动物细胞质膜修复效率的实验方法。将细胞暴露于一种细菌性成孔毒素中，该毒素可在细胞膜上形成孔道。在细胞外钙离子存在的情况下，孔道导致钙离子内流，从而诱导细胞膜修复事件的发生。通过使用DNA结合性染料碘化丙啶来评估膜修复效率，该染料仅能进入未完成膜修复的细胞。...

一种基于荧光的体外检测方法用于测量细胞质膜修复效率

对暴露于亲脂性染料FM1-43的细胞进行活体成像，可精确测定孔形成毒素从质膜上被清除的动力学过程。该方法是一种灵敏的检测手段，可用于评估Ca2+、鞘磷脂酶及其他因素在质膜修复过程中的作用需求。...

活体成像实验用于评估Ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

修复受损细胞的过程涉及特定蛋白质和亚细胞区室向细胞膜损伤部位的转运。本方案描述了监测这些过程的实验方法。...

成像细胞膜损伤及参与修复的亚细胞过程

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

通过双光子激光对细胞膜造成损伤是评估细胞膜修复能力的常用方法，可应用于多种细胞类型。本文介绍了一种实验方案 体外...

使用双光子激光显微镜的细胞膜修复检测方法

本文介绍一种基于荧光的高通量检测方法，通过活细胞的荧光定量和成像分析来测定质膜修复效率。该方法可用于筛选调控哺乳动物细胞质膜修复的药物或靶基因。...

哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

热等离子体穿孔法结合了共聚焦显微镜、光镊技术和金纳米颗粒，用于研究细胞和巨大单层囊泡中细胞质膜修复过程中的蛋白质响应。该技术可实现快速且局部的膜穿孔，有助于鉴定关键蛋白质及其在复杂的细胞质膜修复机制中的功能作用。...

一种用于研究活细胞和模型膜中质膜修复的热等离子体方法

本方案描述了一种利用相关联的光学显微镜与电子显微镜技术，分别对经mEosEM和APEX2标记的线粒体与溶酶体进行成像，以可视化其相互作用的方法。...

双色相关光镜与电镜技术用于线粒体与溶酶体相互作用的可视化研究

了解MG53介导的细胞膜修复机制，通过体内外系统可视化研究骨骼肌纤维损伤修复过程。本方法结合UV激光、荧光染料与显微技术，为再生医学和细胞生物学研究提供重要实验方案。

利用MG53介导的细胞膜修复可视化体内和体外系统

探索更多视频

利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

探索更多视频

利用MG53介导的细胞膜修复可视化体内和体外系统