利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

本实验的总体目标是评估动物体内及分离细胞的膜修复能力。收集分离的骨骼肌纤维，并将其置于含有FM 1-43染料的培养基中。随后使用紫外激光照射细胞膜的特定区域，造成膜损伤，使染料进入细胞内。

将分离的细胞转染表达GFP MG 53的质粒DNA，该蛋白将定位于细胞的质膜和细胞质中。随后，将微电极尖端插入C2C12细胞膜以诱导损伤。最终可获得结果，显示GFP MG 53向损伤部位的转位。

该方法的可视化演示至关重要，因为掌握微电极穿刺和肌纤维分离技术需要经过实践训练。本次演示将由本实验室主管林博士、博士后研究员Wazu博士、研究生Matt Orange以及本系研究助理教授Shaza博士共同完成。开始前，先在跑步机下方放置一个托盘或蓝色实验垫，用于收集实验过程中动物产生的废弃物。

接下来，设置跑步机表面的倾斜角度。一些跑步机自带调节坡度的装置，而另一些则需要通过其他方式抬高跑步机来实现倾斜。通常使用水平平面或倾斜角为7至15度的上坡或下坡。

将小鼠放置于跑步机上进行适应，关闭电刺激网格，开启传送带驱动电机但不使其移动，适应15分钟后，打开用于激励的电刺激网格。以约每分钟5米的初始速度启动跑步机，随后每分钟递增1至2米的速度，使动物进行5分钟的热身运动。

每天重复此热身过程，持续 3 至 10 天，以提高测试期间的依从性。进行急性力竭运动时，随时间逐步增加跑步机速度，直至达到最高速度，并密切观察力竭迹象。

当动物在跑台上停留时间超过一半时间或在网格上连续停留五秒时，即视为力竭。移除力竭的小鼠并记录总跑步时间。耐力训练。

跑步实验方案均以相同的热身程序开始。然而，最高速度通常较低，且跑步时间可能较长。测试结束后将小鼠放回其饲养笼，并用70%乙醇清洁跑步机。

从足部分离趾短屈肌的浅层组织，用于进一步分析。首先，沿足底正中线切开皮肤，注意不要损伤下方的肌肉。接着，进行横向切口并去除皮肤。

辨认附着于跟骨的趾短屈肌（FDB）的扁平白色肌腱。用镊子分离肌腱，并在靠近附着点处将其切断。切割时轻轻向上牵拉肌腱，同时去除周围的结缔组织。

找到远端肌腱分支至各个脚趾的位置。在肌腱与深层肌肉连接处将其切断，并取出足底短屈肌（FDB）。将FDB肌束放入1毫升已预热至37摄氏度的胶原酶溶液中。

将试管水平固定于37摄氏度的摇床培养箱中，以200 RPM转速振荡65分钟。消化充分的标志是组织呈絮状外观且颜色变浅。剪去1毫升移液器吸头的末端，以便消化后的组织团块通过。

将束状物轻松转移至含有约 600 µL 2.5% 钙修饰的台氏液的离心管中。轻轻翻转试管，使束状物中的松散纤维脱落。

接下来，剪切一个 30 微升枪头的末端，使其直径略小于肌束即可。用此枪头将肌束吸入枪头内，然后将其推回溶液中。重复此操作，直至大部分肌纤维从肌束中分离出来。

轻柔翻转离心管以混匀解离的纤维。取适量纤维滴加至玻璃底共聚焦培养皿中。将剩余纤维于4摄氏度保存约六小时，用于后续实验及其他研究。

将培养皿静置五分钟，不要扰动。这一步可使纤维黏附到培养皿的玻璃底上。将玻璃底培养皿置于配备紫外激光器的共聚焦显微镜上。

在相差显微镜下以超过100倍的放大倍数观察纤维，检查是否存在正常的横纹模式以及直杆状形态。向溶液中加入FM 1-43或FM 4-64染料，终浓度为2.5 µM。将纤维从视野的左上角至右下角呈45度角排列，以诱导损伤。

照射细胞膜上一个5×5像素的区域。使用设定为最大功率的紫外激光照射五秒，照射区域应横跨细胞膜，使5×5方框的一半位于纤维内部，另一半位于纤维外部。每隔五秒拍摄一次染料进入纤维的图像，持续记录最长五分钟。每皿最多照射三条纤维，因为荧光染料最终会被纤维通过内吞作用摄入，从而干扰数据分析。

使用三根纤维后，应准备新的培养皿。利用分析软件，计算约 200 平方微米区域内荧光强度的变化，以便对纤维之间进行比较。应对每一帧进行如下计算：ΔF 除以 F₀，其中 F₀ 为第一帧中感兴趣区域的平均荧光强度，ΔF 为后续每一帧中荧光强度的变化值。

采用标准方法将表达GFP MG 53的质粒DNA转染细胞。然后制备显微注射毛细管。将一个Pyrex毛细管置于显微注射毛细管上。

按照预设程序进行抽吸操作。将微量移液器连接至三轴显微操作器培养装置。从Delta T培养皿中移除培养基，并替换为2.5 mmol/L钙离子台氏缓冲液。

将含有转染细胞的培养皿置于配备 40 x 1.3 NA 油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜上。通过将微量移液器插入细胞膜后迅速将其从细胞中抽出，以诱导急性活细胞损伤。对肌钙蛋白诱导的膜破裂过程，以每帧 1.54 秒的时间间隔连续采集活细胞图像。

以每分钟约一毫升的速度，直接在成像细胞上方灌注含0.005%曲张蛋白的PERFU。跑步机可用于测量运动能力的下降。此处所示的MG 53基因敲除小鼠由于骨骼肌受损，表现出运动能力降低。

UV激光造成的损伤程度取决于所观察肌纤维的膜修复能力。这是正常小鼠中损伤前的肌纤维。此图像拍摄于200秒后，显示轻微损伤。

来自膜修复能力受损的MG 53基因敲除小鼠的肌纤维在损伤后会表现出更显著的染料进入现象。这是一例未受损的转染了GFP-MG 53的C2C12成肌细胞管。本图中的箭头指向含有GFP-MG 53的囊泡，这些囊泡正向损伤部位移动。

在此示例中，使用皂苷破坏质膜。注意损伤后GFP MG 53从细胞质向细胞膜的转位。进行此操作时，需注意分离出具有光滑肌膜和清晰横纹结构的良好肌纤维。

观看本视频后，您应能够充分理解如何评估肌肉细胞的膜修复能力以及细胞的培养方法。