Name: 在艾滋病毒感染者病毒载量低于检测限制标准的临床实验放大和量化HIV - 1 RNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 了解如何在低病毒载量样本中扩增和定量HIV-1 RNA，使用单拷贝检测和单基因组测序技术。该方法可检测低至0.3拷贝/毫升的病毒RNA，帮助研究HIV-1病毒群体动态和治疗反应。

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作者谨此感谢参与众多 HIV-1 研究的患者们。
J.M.C. 曾在美国癌症协会的支持下担任研究员教授，该职位由 F.M. 基尔比基金会资助。

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

接受联合抗逆转录病毒治疗（cART）或自然控制感染的 HIV-1 感染者病毒载量极低，通常约为每毫升血浆 1 个拷贝4, 11, 12, 17, 18。自然控制感染的患者其病毒载量通常在个体特定的设定点附近波动1, 2, 17。本文所述检测方法的灵敏度高度依赖于血浆的输入体积。通常我们使用 7 ml 血浆，但根据实际血浆病毒载量的不同，使用更少量的血浆也可获得阳性结果。本文描述的 RNA 提取方法是一种“自配”方法，较为耗时。我们发现该提取方法非常可靠，且比现有的商业化 RNA 提取试剂盒更有效。血浆质量对获得产物至关重要。血浆先前的冻融过程或在高于 -80 摄氏度的温度下储存会损伤 RNA，降低获得产物的可能性。在超速离心前，强烈建议对血浆进行“预离心”，以去除可能干扰检测的脂质、细胞及其他颗粒物。
该方案中的多个步骤已实现自动化。
SCA检测法相较于其他超敏检测方法具有更高的灵敏度优势。例如，Dornadula等人描述的实时检测法的最低检测限为每毫升血浆5.0拷贝5</e...

<table><tbody><tr><td>随机六聚体（500 µg/mL）</td><td>Promega Corp.</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Taqman 缓冲液 A</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304441</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶抑制剂 RNAsin（40 U/µL）</td><td>Promega Corp.</td><td>N211B</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶 RT enzyme（200 U/µL）</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>600107-51</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Gold DNA 聚合酶</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>6 瓶装</td></tr><tr><td>Amplitaq 10X Gold PCR 缓冲液 II</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>随酶提供</td></tr><tr><td>氯化镁 25 mM</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>随酶提供</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0，5 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶，200 U/µL</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 10X 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>随酶提供</td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>随酶提供</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶高保真酶，5 U/µL</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td></td></tr><tr><td>10X 高保真 PCR 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td>随酶提供</td></tr><tr><td>蛋白酶 K 20 mg/mL</td><td>Ambion</td><td>2546</td><td></td></tr><tr><td>硫氰酸胍溶液 6M</td><td>Fluka</td><td>50983</td><td></td></tr><tr><td>糖原 20 mg/mL</td><td>Roche Group</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19516</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E702-3</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs（各 25 mmol）</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Easy Seal 离心管（16×73 mm）</td><td>Seaton Scientific</td><td>6041</td><td></td></tr><tr><td>白色 Delrin 管盖</td><td>Seaton Scientific</td><td>4020</td><td>Easy Seal 管的盖子</td></tr><tr><td>Optiseal 钟形管用试管架，8.9 mL</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>361642</td><td></td></tr><tr><td>六角扳手 &amp;frac12; 英寸开口</td><td>Seaton Scientific</td><td>4013</td><td></td></tr><tr><td>管盖移除工具</td><td>Seaton Scientific</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 刻度移液管</td><td>Costar</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy 移液控制器</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 转移移液管</td><td>ISC Bioexpress</td><td>P-5005-7</td><td></td></tr><tr><td>5.8 mL 一次性转移移液管，细尖头</td><td>VWR international</td><td>14670-329</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 离心管</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐溶液片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机及转子</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>90SE 和 T-1270</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS-9601</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 试剂储液槽</td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Microamp 光学 96 孔反应板</td><td>Applied Biosystems</td><td>N801-0560</td><td></td></tr><tr><td>光学板盖</td><td>Applied Biosystems</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学压缩垫</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312639</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A 膜</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA-5001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 琼脂糖凝胶（E-gel，Invitrogen）</td><td>Invitrogen</td><td>G-7008-01</td><td></td></tr><tr><td>E-base（Invitrogen）</td><td>Invitrogen</td><td>EB-M03</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EDTA 采血管，任意品牌</td></tr></tbody></table>

对标准临床检测方法无法检出病毒载量的hiv感染者进行hiv-1 rna的扩增与定量

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

对于自然控制感染或接受联合抗逆转录病毒治疗（cART）的患者，扩增病毒基因并定量检测病毒载量低于标准检测方法检出限（低于每毫升50-75拷贝）的HIV-1感染者体内的HIV-1 RNA，对于深入了解病毒动力学及病毒与宿主之间的相互作用至关重要。
本文介绍了如何通过单基因组测序（SGS方案）13, 19扩增病毒基因组，以及如何准确量化病毒载量较低患者的HIV-1 RNA（单拷贝检测（SCA）方案）12, 20。
单拷贝检测是一种实时 PCR 检测，其灵敏度取决于所检测血浆的体积。若在 7 ml 血浆中检测到一个病毒基因组，则报告的 RNA 拷贝数为 0.3 拷贝/ml。该检测包含一个内参对照，用于评估 RNA 提取效率，并设有检测 DNA 扩增或污染可能性的对照。患者样本均进行三复孔测定。
单基因组测序检测（SGS）目前已被广泛使用，且被认为操作不繁琐3, 7, 12, 14, 15，它是一种有限稀释法，将终点稀释后的cDNA产物分配至96孔板中。根据泊松分布，当少于1/3的孔产生扩增产物时，该PCR产物来源于单个cDNA分子扩增的概率可达80%。与克隆方法相比，SGS的优势在于不会发生重复取样，且不受PCR过程中引入的重组偏差影响19。然而，SCA和SGS的扩增成功率依赖于引物设计。这两种检测方法最初均针对HIV-1 B亚型开发，但通过更换引物、探针和标准品，可适用于其他亚型及基因组其他区域。

对病毒载量低于检测下限（50-75 拷贝/ml）的个体，其血浆中 HIV-1 RNA 水平的定量以及单个 HIV-1 基因组的测序均较为困难。本文介绍如何利用一种实时 PCR 检测方法提取并定量血浆病毒 RNA，该方法可稳定检测低至 0.3 拷贝/ml 的 HIV-1 RNA，并介绍如何对病毒载量极低的样本进行单基因组扩增测序。

对标准临床检测方法无法检出病毒载量的HIV感染者进行HIV-1 RNA的扩增与定量

扩增病毒基因并定量检测标准检测方法无法检出病毒载量的HIV-1感染者（病毒载量低于……）中的HIV-1 RNA

本视频展示了从血浆病毒载量低于每毫升50拷贝的个体中定量和测序单个HIV基因组的方法。首先，将含有七毫升血浆的试管进行离心以形成沉淀。随后提取病毒RNA，以定量HIV-1的水平。进行单拷贝检测，其中RNA被逆转录后，与标准品和对照一起加入96孔板，并进行定量实时PCR。病毒血症水平根据血浆输入体积计算得出。该方法可检测低至每毫升0.3个拷贝，用于表征病毒种群。进行一次基因组测序检测，将由病毒RNA反转录得到的cDNA分配至96孔板中，以达到终点稀释。随后进行巢式PCR以扩增病毒基因组。若某一特定样本的PCR反应阳性率等于或低于30%，则表明已实现单拷贝cDNA的扩增。随后对这些样本进行测序，以揭示各个病毒基因组的核苷酸序列。这些技术的高灵敏度使我们能够监测在标准检测方法中HIV RNA水平不可检出的患者体内的病毒载量，并深入了解病毒自然控制的机制。尽管我们使用不同的引物和内标离子标准品来研究HIV，但该方法同样可用于研究其他病毒。通常，该方法具有挑战性，因为从大量血浆中分离病毒较为困难，且需要无 DNA 的环境以避免假阳性结果。首先从患者血浆样本中提取 RNA，将七毫升血浆转移至洁净的 15 毫升离心管中。如果需要为单拷贝检测提取 RNA，此时应加入 200 微升含有 30,000 个可检测拷贝的 RCA 病毒的内部病毒颗粒对照。接下来，为避免脂质和细胞碎片干扰 RNA 定量，将血浆在 2,600 × g 条件下离心 15 分钟以去除游离碎片。离心后，使用防水标记笔在 settin easy seal 离心管的一侧做标记，避开任何细胞碎片或脂质区域。用移液器将血浆转移至标记好的 settin eae 管中。然后记录血浆的输入体积。用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（Tris缓冲盐水）将试管填充至螺纹颈部的底部，确保无气泡产生。盖上管盖。将样品放入预冷的超速离心机转子中，标记朝外。在4°C条件下，以170,000 ×g离心30分钟。离心后，沉淀将不可见。去除上清液，然后向病毒沉淀中加入90微升分子生物学级水和10微升蛋白ACE K。接下来，确保离心管倾斜，使沉淀浸入蛋白ACE K与水的混合液中。将离心管置于55摄氏度水浴中，孵育30分钟。孵育结束后，短暂离心离心管，使样品沉降至管底。随后加入10 µL浓度为20 mg/mL的糖原，以及315 µL 6 mol/L硫氰酸胍溶液，充分涡旋混匀。将管中的内容物轻轻转移至一个新的含有495 µL分子级异丙醇的1.5 mL微量离心管中，涡旋振荡10秒。然后在室温下以21,000 × g离心30分钟，弃去上清液，向管中加入500 µL 70%乙醇，涡旋振荡10秒，再以21,000 × g离心15分钟。室温下使用大口径移液枪吸除乙醇，再次短暂离心，去除残留乙醇，随后将沉淀在空气中干燥10分钟。如果进行单拷贝检测，将沉淀溶解于55 µL RNA缓冲液中，并将试管置于冰上。如果进行单基因组测序，则将RNA溶解于40 µL pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液中，并将试管置于室温下以进行单拷贝检测。通过将HIV-1和RCAs的RNA转录本在RNA缓冲液中进行半对数倍比稀释，制备HIV-1和RCAs的标准曲线。标记1.5毫升离心管后，向每管中加入54微升RNA缓冲液。随后将HIV-1稀释至每10微升含0.3个RNA拷贝，将RCAs稀释至每10微升含100个RNA拷贝。每次稀释之间通过涡旋振荡混合。在每支试管中加入54微升RNA缓冲液后，首先向第一支试管中加入25微升转录产物，涡旋振荡片刻，离心，然后依次转移至下一支试管，继续此操作直至最后一支标记的试管。稀释液制备完成后，配制用于cDNA合成的逆转录酶（RT）反应混合液。需配制足够进行96次逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的用量，其中包括8个无逆转录酶（NRT）对照反应，用于检测是否存在DNA扩增。接下来，准备一个光学96孔板，用于放置8个患者样本，包括标准品和对照样本。向8个指定的NRT孔中各加入20微升NRT反应混合液，向其余88个孔中各加入20微升RT反应混合液。将RT和NRT混合液加入板孔后，向标记为阴性对照的孔中各加入10微升水。然后，按照随附书面方案中所示浓度，向标记为HIV的孔以及两个标记为RCAs的孔中各加入10微升HIV转录本。将所需浓度的 10 微升 RCAs 转录本加入到平板上标记为“样品”的八组相邻三个孔中，加入 10 微升上述样品。同时将 10 微升该样品加入标记为 NRT 的八个孔中，然后加入标记为内参对照的孔中。完成后，每孔含有 5 微升样品和 5 微升水。96孔板的设置如本图所示。密封反应板后，在PCR仪中按以下程序运行：25 °C孵育15分钟，42 °C孵育40分钟，85 °C孵育10分钟，25 °C孵育30分钟，最后在5 °C保存。在合成 cDNA 的同时，配制 HIV 和 RCA 的 PCR 预混液。当 cDNA 合成完成后，将反应板转移至洁净室外指定用于处理 cDNA 的区域。向本图中绿色所示的每个孔中加入 20 微升用于 QPCR 的 HIV-PCR 预混液。然后向本图中灰色所示的孔中加入 20 微升 RCAs PCR 预混液。离心后，在 2,600 ×g 条件下离心反应板。将反应板放入实时荧光定量PCR仪中，并按照以下条件运行qPCR：95°C预变性10分钟；随后进行45个循环，每个循环为95°C变性15秒，60°C退火延伸1分钟。获得结果后，需分别对RCAs和HIV进行独立分析，以开展单基因组测序。首先以悬浮于 pH 8.0 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中的 RNA 作为模板，合成 CD NA。在 96 孔 PCR 板中，加入 5 µL 10 mM dNTPs、5 µL 2 mM 基因特异性引物（pole 或 en）以及 40 µL 提取的 RNA，然后使用 BioRad 的 Microseal 膜密封反应板。然后在 65 摄氏度下孵育反应 10 分钟，使 RNA 变性。在 RNA 变性的同时，配制反转录（RT）反应体系。请注意，此反转录反应体系与单拷贝检测所用的体系不同。在变性步骤后，将PCR板置于冰上，以保持RNA的变性状态。随后，向每个样本中加入50 µL新配制的反转录反应体系，并在PCR仪上按照以下程序运行：45 °C 反应50分钟，85 °C 反应10分钟，4 °C 保存。在此步骤中，RNA 在合成 cDNA 的同时被逆转录为 cDNA。使用 P6 至 RT 或包膜 PCR 引物配制 PCR 反应体系。注意，该 PCR 反应体系与单拷贝检测所用的不同，需将 8.0 µL 新鲜配制的 PCR 反应体系分别加入新的 96 孔 PCR 板中的 73 个孔内，包括 70 个样本和 3 个阴性对照。当CD NA合成完成后，将反应板转移至洁净室外指定用于处理CD NA的区域。接着，向CD NA样品中加入40微升pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液，使终体积达到140微升。然后，向每个70个反应孔中加入2.0微升样品，向每个阴性对照孔中加入2.0微升水。密封PCR板，并按照此处所示程序运行PCR扩增。接下来，根据随附书面说明进行巢式PCR。PCR扩增后，将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳。观察结果。如果少于30%的孔呈阳性，则大多数PCR产物来源于单个cDNA分子。本视频所述方法进行了单拷贝检测。该图显示了部分精英控制者的qPCR结果。如图所示，样品和稀释后的 HIV 标准品的扩增曲线看起来是正确的。除第七个被圈出的样品外，大多数样品的内源性病毒颗粒标准品回收率均高于 1500 拷贝。为确保高效的 RNA 提取，样品三的结果以红色标出。三个孔中的拷贝数分别为零、一和零拷贝。用橙色标出的NRT对照和用黄色标出的阴性对照均为阴性，证实扩增未受到其他样本或DNA污染的影响。由于阳性和阴性对照均通过，现在可以计算拷贝数。0.3的平均拷贝数需乘以5.5的校正因子，得到RNA洗脱液中的总拷贝数（0.3 × 5.5 = 1.65），再除以所分析血浆的总体积（7.3 mL），得出每毫升血浆中HIV-1 RNA为0.2拷贝。单基因组测序实验的实施方法如视频中所述。该图显示了本研究中一名HIV非控制者的一次AROS凝胶结果。H1和H2孔中的阴性对照均为阴性。少于三分之一的孔发生了扩增，确保了这是终点稀释，且大多数扩增均来自单个cDNA拷贝。此处展示了来自SGS的序列比对结果。序列中无模糊位点，表明扩增确实来源于单个cDNA拷贝。在尝试从大量血浆中提取RNA时。需要注意的是，在检测方法开发后，应进行预离心步骤，以去除可能干扰检测效率的细胞和脂质。该技术已被用于研究多种患者群体中的病毒动力学，这些患者的病毒载量低于标准检测方法的检测限。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在艾滋病毒感染者病毒载量低于检测限制标准的临床实验放大和量化HIV - 1 RNA

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp.

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