Name: 交付的治疗药物通过侧脑室（ICV）和静脉（IV）注射液在小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学习侧脑室注射和静脉注射技术，用于向新生小鼠中枢神经系统递送治疗药物。该方法帮助研究人员实现靶向脑部给药或全身性分布，突破血脑屏障限制。

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作者谨此感谢 John Marston 在动物饲养管理方面的专业支持，以及 Marco A. Passini 博士在本项目初期阶段提供的技术协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 C.L.L.（R01NS41584；R01HD054413）。

1. 脑室内注射
<ol>
<li>第一步是制备注射用储备溶液；这些溶液包括病毒载体、质粒 DNA 和药物，均应在无菌条件下进行注射。</li>
<li>将所需滴度的病毒载体（总体积 5–7 μL）与 PBS 中 0.05% w/v 的台盼蓝混合，以便可视化注射部位。</li>
<li>质粒 DNA 溶液（总体积 5 μL）包含 D-(+)-葡萄糖 20% (w/v)（1 μL）、0.05% 台盼蓝 PBS（1 μL）、质粒（约 5 μg/μL）（2 μL）以及 2.5 kDa 线性 PEI 均聚物（150 mM）（1 μL）。</li>
<li>通过低温麻醉将出生后第 2 天（PND 2）的新生小鼠固定 1–2 分钟。</li>
<li>本注射所用的针头为微升级刻度的无菌玻璃微量移液管，通过一根长管连接至 3 mL Hamilton 注射器。</li>
<li>用解剖刀片轻敲针尖使其断裂，以调节针头刺入颅骨深度为 2 mm。将针头斜向插入含有注射液的微量离心管中，缓慢拉动注射器活塞，将注射液吸入针头内。</li>
<li>吸液完成后，将注射器与导管分离；再向上拉动活塞一段距离，然后重新连接至针头。</li>
<li>右手拇指与食指夹持针头，将注射器置于中指与无名指之间，活塞末端接触右手掌心。</li>
<li>用左手牢固抓住固定后小鼠头部后方的皮肤，并将其置于光纤光源上，以照亮可用于定位的解剖结构。</li>
<li>将针头垂直插入颅骨表面下 2 mm，进针位置位于矢状缝外侧约 0.25 mm，冠状缝前部（吻侧）0.50–0.75 mm 处（图 1A）。随后用右手掌心非常缓慢而小心地推动活塞。密切观察是否出现血管破裂或面部肿胀。</li>
<li>停止推动活塞后 15 秒再拔出针头，以防止液体回流。</li>
<li>恢复阶段，将小鼠置于温热容器中 5–10 分钟，直至其活动能力与整体反应性恢复。</li>
</ol>
2. 经颞部/面部静脉静脉注射
<ol>
<li>应准备待注射的溶液，并加入过滤后的绿色食用染料，稀释比例为1:100，在无菌条件下进行注射。</li>
<li>将小型塑料鲁尔接头连接至100 μL玻璃哈密尔顿注射器末端，再将33号规格、0.25英寸长的皮下注射针头连接至鲁尔接头。确保所有部件连接牢固。</li>
<li>用待注射体积的溶液装填注射器，确保注射器内无空气，因为将空气注入血管是致命的。通常可将待注射液体移取到一片Parafilm上，有助于清晰观察溶液吸入注射器的过程。</li>
<li>使用Wee Sight透射照明器可方便地观察新生小鼠的浅表颞静脉或面部静脉（图2A）。注射前，使用手术胶带将新生小鼠固定在透射照明器上。应在小鼠与胶带之间放置纱布，以防止胶带损伤动物皮肤。将动物侧向固定于照明器上，确保胶带不妨碍呼吸。轻轻转动小鼠颈部，使面部静脉清晰可见，并用胶带固定鼻部以稳定头部。</li>
<li>佩戴2.25倍头戴式放大镜以增强视野，缓慢将针头插入静脉。静脉位置非常表浅，因此针头应始终在皮肤下可见。</li>
<li>缓慢将溶液注入静脉。绿色染料有助于清晰观察注射过程。</li>
<li>在拔出针头前等待15秒，由于针头内径极细，完全压下注射器推杆与剩余液体完全排出之间存在延迟。</li>
<li>拔出针头后，使用纱布对注射部位施加压力，直至出血停止。</li>
<li>监测新生小鼠是否有痛苦迹象。正确注射后不应出现明显痛苦表现。注射后应让新生小鼠恢复约5分钟，再将其放回笼中。</li>
<li>每次注射之间需用PBS冲洗针头/注射器组件，因为血液残留在细径针头中会迅速造成堵塞。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
脑室内注射：可在注射后的不同时间点取脑，并进行观察以验证注射技术的成功。如果注射溶液中未添加染料，则难以检测注射是否准确。正确地向其中一个脑室注射后，大约在注射后10-15分钟，可在注射侧的大脑观察到台盼蓝的分布（图1B）。大约在注射后60分钟，可在左右两侧大脑半球及嗅球中观察到台盼蓝的均匀分布（图1C）。这是由于脑室之间相互连通，使得蓝色染料能够扩散至相邻的脑室。准确的注射还可通过蓝色染料在注射后约12小时内扩散至脊髓前部中央管来确认（图1D）。若大脑半球中无蓝色显现，则提示注射不准确。此时，可能是针头插入深度不足，导致注射液分布在皮肤下方；另一种可能是针头刺入过深，穿过了脑室，使溶液排入脑室下方区域。
静脉注射：注射后可立即观察到准确且高效的颞部/面部静脉注射效果。当溶液被注入时，绿色染料可使溶液进入面部静脉并沿静脉流动的过程清晰可见（图2A）。此外，注射后可观察到小鼠皮肤颜色发生改变。由于注射液中含有绿色食用染料，新生小鼠原本正常的粉红色皮肤会转变为绿色（图2B）。皮肤变绿的程度取决于所用染料的浓度。在仅需观察注射过程或练习操作时，建议使用1:50的稀释比例。然而，皮肤颜色的显著改变常导致母鼠拒绝幼崽，因此在正式实验过程中应考虑去除染料或大幅降低其浓度。若注射位置不准确，绿色染料将在注射部位皮下积聚。不完全注射是指针头开口未完全进入静脉，此时部分溶液进入静脉而另一部分在皮下积聚，亦可观察到类似现象。若出现上述情况，应将针头进一步插入血管内。
<img src="/files/ftp_upload/2968/2968fig1.jpg" alt="小鼠脑内注射位点示意图；注射后15分钟、60分钟和12小时的实验图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. PDN2小鼠脑室内（I.C.V.）注射成功的演示。A) 脑室内注射所用注射位点的示意图。B) 左侧脑室注射含台盼蓝的PBS后的小鼠幼崽脑组织，注射后15分钟拍摄的照片。C) 左侧脑室注射含台盼蓝的PBS后的小鼠幼崽脑组织，注射后60分钟拍摄的照片。D) 左侧脑室注射含台盼蓝的PBS后的小鼠幼崽脑组织，显示前部中央脊髓管，注射后12小时拍摄的照片。
<img src="/files/ftp_upload/2968/2968fig2.jpg" alt="注射位点示意图及实验小鼠的实验室结果，详细展示面部静脉注射操作。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. PDN2小鼠成功进行静脉注射的演示。A) 用于静脉注射的面部静脉示意图。B) 通过PBS中的绿色染料进行静脉注射的仔鼠与未注射的同窝仔鼠对比，照片摄于注射后立即拍摄。

<ol><li>Blanchette, M., Fortin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in the treatment of brain tumors.</a> Methods Mol. Biol. 686, 447-463 (2011).</li>
<li>Foust, K. D., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+the+barrier+and+through+the+blood%3A+to+CNS+delivery+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go.</a> Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).</li>
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<li>Dickson, A., Osman, E., Lorson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively-Acting+Bifunctional+RNA+Increases+Survival+Motor+Neuron+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Negatively-Acting Bifunctional RNA Increases Survival Motor Neuron in vitro and in vivo.</a> Hum. Gene. Ther. 19, 1307-1315 Forthcoming.</li>
<li>Mattis, V. B., Ebert, A. D., Fosso, M. Y., Chang, C. W., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+a+read-through+inducing+compound%2C+TC007%2C+lessens+the+severity+of+a+spinal+muscular+atrophy+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Delivery of a read-through inducing compound, TC007, lessens the severity of a spinal muscular atrophy animal model.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3906-3913 (2009).</li>
<li>Williams, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-mediated+survival+of+motor+neuron+protein+expression+in+CNS+improves+phenotype+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-mediated survival of motor neuron protein expression in CNS improves phenotype in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> J. Neurosci. 29, 7633-7638 (2009).</li>
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<li>Shababi, M., Glascock, J., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SMN+Trans-Splicing+and+a+Neurotrophic+Factor+Increases+the+Life+Span+and+Body+Mass+in+a+Severe+Model+of+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combination of SMN Trans-Splicing and a Neurotrophic Factor Increases the Life Span and Body Mass in a Severe Model of Spinal Muscular Atrophy.</a> Hum. Gene. Ther. 22, 1-10 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

利用小鼠疾病模型的研究通常需要向新生小鼠注射药物或其他物质。在本视频中，我们演示了两种可用于靶向中枢神经系统的注射策略的逐步操作流程：1）通过脑室内（ICV）注射直接向中枢神经系统给药；或 2）通过颞部/面部静脉进行静脉（IV）注射。注射时机至关重要。由于ICV注射为徒手操作，因此颅骨必须具有相对可塑性。此类注射仅在出生后第一周内可行，随着动物日龄增加，操作将变得愈发困难，并对动物造成更大伤害。然而，其主要优势在于能够直接将药物递送至中枢神经系统，从而有效绕过血脑屏障。因此，若研究者正在开发针对中枢神经系统的治疗药物，则有可能分析那些尚未完全优化药物特性（如血脑屏障通透性）的化合物，但仍可在与疾病相关的组织中检测其活性。在出生后的最初几天内使用颞静脉已被证明具有重要价值，因为这是一种相对非侵入性的常规静脉给药技术。在此发育阶段，其他静脉（例如尾静脉）尚不易触及，而尾静脉通常在出生后第二周才更易于操作5。这两种注射技术均安全可靠，均可徒手完成，小鼠在注射后可迅速恢复，且无任何不良副作用。两种方法均适用于在短时间内快速对一批动物进行注射。它们均需要清晰观察目标区域，以确保注射成功。静脉注射中使用透射照明仪和放大头带（<...

<table><tbody><tr><td>绿色食用色素</td><td>McCormick &amp; Co.</td><td>n/a</td><td>必须过滤</td></tr><tr><td>Hamilton 玻璃注射器 (100 &amp;mu;L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20702</td><td></td></tr><tr><td>LuerMxF 螺纹式白色尼龙接头</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>VPLF-LC78-1-25</td><td></td></tr><tr><td>细径皮下注射针头</td><td>Popper &amp; Sons, Inc.</td><td>7111</td><td>规格：33(SWG) × &amp;#188;&quot; (6.35 mm)</td></tr><tr><td>Wee Sight 透射照明器</td><td>Respironics</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>2.25倍头戴式放大镜</td><td>MagEyes</td><td>型号 5</td><td>根据个人偏好选择合适的放大倍数</td></tr></tbody></table>

通过脑室内（icv）和静脉内（iv）注射在小鼠中递送治疗剂

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

尽管血脑屏障在保护大脑方面发挥着重要作用，但它限制了治疗药物进入中枢神经系统（CNS），这往往导致针对神经退行性疾病的潜在疗法失败1,2。对于脊髓性肌萎缩症（SMA）等影响下运动神经元的神经退行性疾病，将治疗剂递送至中枢神经系统可带来显著益处。本视频的目的是展示两种不同的注射方法，用于在新生小鼠出生后不久将其治疗物质递送至体内。其中一种方法是直接注射至侧脑室（脑室内注射），通过脑脊液将物质递送至中枢神经系统3,4。第二种方法是颞静脉注射（静脉内注射），可将不同治疗剂引入循环系统，实现包括中枢神经系统在内的全身性递送5。若使用合适的病毒载体和病毒血清型，可实现中枢神经系统的广泛转导。在出生后第6天之前，均可清晰观察并利用颞静脉进行注射。然而，若递送的物质需进入中枢神经系统，则应在血脑屏障尚未发育完全、通透性较高的时期进行注射，最好在出生后第2天之前完成。成熟的血脑屏障会极大限制静脉注射的递送效率。一旦掌握手术技巧，这两种递送方法均简单且有效。它们无需复杂的外科设备，可由单人独立完成。但这些技术也存在挑战。出生后第2天的幼鼠体型微小，靶区范围极小，使得注射操作困难，初期难以重复实现。

本文展示了两种截然不同的注射方法：1）脑内注射（脑室内注射）和 2）全身性注射（静脉注射），用于将治疗剂导入新生小鼠的中枢神经系统。

通过脑室内（ICV）和静脉内（IV）注射在小鼠中递送治疗剂

尽管血脑屏障在保护大脑方面发挥着重要作用，但它限制了大多数物质进入中枢神经系统（CNS）的通路，这使得向中枢神经系统递送治疗药物变得极具挑战性。

本视频将演示在新生小鼠中进行脑室内注射和静脉注射的方法。进行脑室内注射时，先将麻醉后的小鼠置于光纤光源上方，以透照矢状窦和横窦。然后在矢状缝外侧、冠状缝头侧的位置小心注入接种物。若操作正确，接种物将首先分布于被注射的脑室，最终通过静脉注射到达另一侧脑室。将小鼠固定于透射光源上，使面部静脉暴露。随后将接种物缓慢直接注入静脉，进而实现全身性分布。这些技术的应用意义广泛，可延伸至多种疾病和障碍的治疗，因为它们能够实现治疗剂的最佳定位。脑室内注射（ICV）技术提供了一种穿越血脑屏障的方法，而静脉注射（IV）技术则可用于全身性治疗递送。首先，在微量离心管中配制注射溶液。在此示例中，接种物含有三苯甲烷蓝，以便更清楚地观察注射部位。注射小鼠时，使用已灭菌并校准的玻璃微量移液针，该针通过一系列直径逐渐增大的塑料管连接至一个3 mL塑料注射器。使用平头镊子将玻璃针尖端折断，使其长度为3毫米。这将使溶液至少穿透大脑两毫米。将玻璃微量移液针斜插入微型离心管中，轻轻拉动注射器活塞，吸取待注射溶液。一旦针头充满溶液，立即停止拉动活塞。为避免污染导管，需将注射器从连接玻璃微移液管的导管系统上取下。将推杆完全推出后，重新牢固地安装针头。用拇指和食指握住玻璃微移液管针头。将注射器置于环指与小指之间，推动活塞使其接触注射手的手掌，对出生两天的小鼠进行冷冻麻醉。然后，牢固地抓住经冷冻麻醉的小鼠头部基部的皮肤，并将其放置在光纤光源上，以照亮上矢状窦和横窦。注射部位位于上述两窦汇合处两侧约0.25毫米的侧方，持注射器垂直于颅骨表面。将针头插入约两毫米深。用注射手的掌心缓慢推动推杆以注入溶液。拔出针头前等待15秒，以防止回流，并观察小鼠是否出现颅部肿胀或血管破裂的迹象。小鼠注射后，将其放入预热的容器中5到10分钟，以使其恢复。将注射过的小鼠与未注射的小鼠进行比较。在接种含有台盼蓝的接种物进行脑室内注射后10至15分钟。60 分钟后，由于脑室系统的连通性，液体应分布于注射侧的大脑区域，此时应可观察到双侧大脑半球和嗅球内三联蓝色素分布均匀。最后，在 12 小时后，接种物将可见于脊髓中央管的头端。配制注射溶液，并按 1:100 的比例加入绿色食用染料。为了观察注射过程，将一个小型塑料引诱物连接到100微升玻璃Hamilton注射器的末端。为注射器安装一根33号规格、0.25英寸的皮下注射针头，并确保所有部件连接牢固。用待注射的液体充满注射器。务必从接种物中排除所有气泡，因为将空气注入静脉是致命的。使用手术胶带和纱布将新生儿固定在透光仪上。先将前臂和身体固定在透光仪上，再固定头部，使面部静脉清晰可见。确保胶带松紧适度，以免影响动物呼吸。使用2.25倍头戴式放大镜以获得更好的视野，缓慢将针头插入静脉。由于静脉位置较浅，针头在皮下仍可见。缓慢将接种物注入静脉。拔出针头前等待15秒，以确保所有液体完全排出。针头拔出后，使用一块纱布按压注射部位，直至出血停止。将新生幼崽放回温暖处，静置五分钟使其恢复，并观察其是否有痛苦迹象。若注射操作正确，动物不应表现出不适症状。小鼠苏醒后，将其放回笼中。如果静脉注射操作正确，仔鼠会变为绿色。观看本视频后，您应已充分掌握如何对新生小鼠进行颅内注射（ICV）和静脉注射（IV）。这些技术可作为注射您所选择的治疗剂的方法。

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交付的治疗药物通过侧脑室（ICV）和静脉（IV）注射液在小鼠

本视频展示了在小鼠模型中通过奥马耶（Ommaya）介导的脑室内注射技术。该方法可实现潜在药物候选物的局部递送，并避开血脑屏障。...

小鼠脑室内注射：一种经Ommaya导管向小鼠脑室直接给药的药物递送方法

在本视频中，我们介绍一种将导管植入小鼠颈静脉的方法，通过该方法可将药物和示踪染料等实验试剂经静脉在活体动物体内递送。当该装置与其他系统连接时，还可用于监测血流动力学参数和采集血液样本。...

通过颈静脉导管进行小鼠模型实验性药物的静脉注射：一种在小鼠模型中经颈静脉静脉递送实验性药物的技术

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

儿科疾病的动物模型可能出现早期发病和快速进展的病情。对幼年小鼠模型进行具有临床相关性的治疗给药在技术上可能较为困难。本方案描述了一种针对出生后前两天内的新生小鼠进行的无创静脉注射方法。...

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在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。...

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本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。...

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本方案详细介绍了在新生小鼠中进行鞘内注射以实现基因编辑和药物递送的逐步操作步骤。...

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通过一种新型注射位点修复技术实现小鼠模型颈动脉重复注射

腰椎鞘内注射是一种具有转化相关性的给药途径，可用于将基因治疗递送至中枢神经系统。本标准化操作方案全面涵盖了新生期、幼年期及成年小鼠和大鼠的腰椎鞘内注射技术，旨在指导研究人员在临床前基因治疗研究中采用该技术。...

小鼠和大鼠中枢神经系统靶向基因治疗载体的腰椎鞘内注射

学习侧脑室注射和静脉注射技术，用于向新生小鼠中枢神经系统递送治疗药物。该方法帮助研究人员实现靶向脑部给药或全身性分布，突破血脑屏障限制。

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