Name: MRI引导下的破坏血脑屏障在大鼠模型经颅聚焦超声 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习使用微泡介导的聚焦超声技术在大鼠模型中破坏血脑屏障。该方法通过MRI引导实现精准定位，为脑部靶向药物递送提供非侵入性解决方案，有助于神经系统疾病治疗研究。

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作者感谢Shawna Rideout-Gros和Alexandra Garces在动物护理方面的帮助，以及Ping Wu提供的技术支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（资助号：EB003268）和加拿大研究主席计划的资助。

1. 超声与MRI设置
本研究使用了一套与 MRI 兼容的三轴聚焦超声系统（FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Canada）。使用了两种不同的超声换能器：一种是自制的 551.5 kHz 球面聚焦换能器（曲率半径 = 60 mm，外径 = 75 mm，内径 = 20 mm）；另一种是 1.503 MHz 的 8 扇区阵列换能器，带有集成 PZT 水听器（Imasonic Inc., Voray-sur-L'Orgnon, France），该阵列作为单个元件的球面聚焦换能器驱动使用（FN = 0.8，孔径 = 10 cm）。当使用 551.5 kHz 换能器时，采用了一种与 MRI 兼容的 PVDF 接收器8来记录声学发射信号。若使用不同的设备，建议如下：
<ol>
	<li>选择一个合适且经过校准的超声换能器，其中心频率范围为 0.25 MHz -1.5 MHz，f 值（曲率半径/孔径）小于或等于 1。</li>
	<li>在 1.5 T 或 3 T 磁共振成像（MRI）设备的扫描床上放置一个装有温热、脱气、去离子水的水浴。水浴应配备一个可承载动物的顶板。将超声换能器安装在一个与 MRI 兼容的三轴定位平台或系统9上，并置于水箱内，使其朝向水面。</li>
	<li>将换能器电缆通过穿透面板连接至超声驱动设备。</li>
	<li>使用函数发生器和功率放大器生成换能器驱动信号。采用外部匹配电路以最小化反射的电功率。</li>
	<li>根据已知的换能器焦距，将换能器焦点置于水面处，并对水面进行超声辐照，以产生可见的水柱。步骤 1.6 和 1.7 描述了如何利用产生的水柱来标定焦点位置。一种更精确的定位方法涉及对吸热凝胶进行超声辐照，并利用 MRI 成像检测焦点处的温度升高，详见9。</li>
	<li>使用在 MR 图像上可见的标记物标定焦点位置。可通过一个带有中心孔的板实现，当该板放置在焦点上方时，中心孔会充满水。该充水孔在 MRI 上可见，可在两个平面上提供焦点坐标，而沿换能器轴向的坐标则可通过水面确定。</li>
	<li>使用三平面定位序列对焦点标记物成像，并记录焦点在 MRI 坐标系中的位置。</li>
	<li>为监测声学发射，可在水浴中安装一个与 MRI 兼容的水听器8，用作被动空化检测器（PCD），并将其指向换能器焦点；或使用集成水听器的换能器。</li>
	<li>将 PCD 电缆连接至足够高速的示波卡，以捕获持续时间最长为 10 ms、脉冲重复频率（PRF）最高达 2 Hz 的信号爆发（例如 ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canada）。电缆必须接地至穿透面板或射频屏蔽层，以最小化噪声。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>使用异氟烷气体麻醉动物。由于异氟烷会影响血脑屏障的通透性10，因此应在实验开始前10分钟停止供气。在麻醉开始时，向每只动物的眼睛涂抹眼用润滑软膏，以防止角膜干燥或其他损伤。</li>
	<li>使用电动剃刀剃除动物头部和颈部的毛发，然后使用脱毛膏（例如 Nair，Church &amp; Dwight Co.，普林斯顿，新泽西州，美国）去除残留毛发，并用温和的肥皂和水冲洗头皮。</li>
	<li>用聚维酮碘皮肤清洁剂处理尾部，随后用碘伏冲洗。最后用酒精擦拭，以便清晰观察尾静脉。</li>
	<li>将一根22号带三通阀的导管插入尾静脉，并用肝素/生理盐水混合液（33 U/mL）冲洗，以防止导管内形成血栓。</li>
	<li>通过肌肉注射给予可注射麻醉剂（40–50 mg/kg 氯胺酮，10 mg/kg 赛拉嗪），并撤除异氟烷麻醉。</li>
	<li>将麻醉后的动物仰卧置于超声定位系统上，使其头部顶部通过顶板上的孔接触水浴（图1）。可在动物头部顶部涂抹少量超声耦合凝胶，以尽量减少气泡滞留的可能性。</li>
	<li>用胶带将动物的四肢固定在定位系统上。头部可用咬合杆固定（如有），或用胶带牢固地固定在下颌处。</li>
	<li>用毛巾和循环水毯覆盖动物，以保持其体温。</li>
</ol>
3. 靶点选择
<ol>
	<li> 获取脑部基线轴向 T2-加权和 T1-加权磁共振图像。若使用 1.5 T 磁共振成像仪和专用头部尺寸射频接收表面线圈，合适的扫描参数可能为： 
	 
	T2 加权：FSE，TE = 60 ms，TR = 2000 ms 
	T1 加权：FSE，TE = 10 ms，TR = 500 ms </li>
	<li>从 T2-加权扫描图像中选择靶点，避开脑室和脑中线，并选择中脑深度位置。</li>
	<li>将换能器焦点移至靶点位置。</li>
</ol>
4. 微泡制备
多个研究团队使用Definity微泡（Lantheus Medical Imaging，马萨诸塞州，美国）进行微泡介导的聚焦超声诱导血脑屏障开放2,5,7。其他类型微泡的合适剂量可在文献中找到11,12。
<ol>
	<li>激活 Definity 微泡，使用 18 号针头缓慢吸取少量至 1 mL 注射器中。</li>
	<li>通过轻柔地前后推动活塞排出注射器内的滞留空气。切勿敲击注射器，以免破坏微泡。</li>
	<li>将 Definity 与生理盐水按 10:1 的比例（生理盐水:Definity）稀释，方法是将所需体积的 Definity 缓慢注入盛有生理盐水的注射器中。若采用输注给药方式，可进一步稀释至 50:1 或 100:1。</li>
	<li>轻柔翻转注射器，充分混匀 Definity 与生理盐水，直至溶液外观均匀一致。若微泡已开始从悬浮液中上浮，注射前可再次轻柔翻转注射器以重新混匀。</li>
	<li>根据 Definity 剂量 0.02 mL/kg 或稀释后溶液（10:1 稀释度）剂量 0.2 mL/kg，计算所需给药体积。</li>
</ol>
5. 超声递送
<ol>
	<li>设置超声参数，采用低占空比脉冲模式，而非连续波超声。在0.5 MHz条件下，合适的超声参数为0.23 MPa 原位 压力，1 Hz PRF 下每次 10 ms 的脉冲，总超声时间 2 min。在 1.5 MHz 时合适 原位 压力降至约 0.45–0.5 MPa。</li>
</ol>
可使用0.46的机械指数来估算不同频率下的适当压力13。
<ol start="2">
	<li>检查动物头部是否仍与水耦合。</li>
	<li>将微泡缓慢注入尾静脉导管，并用 0.5 mL 生理盐水冲管。注射开始的同时启动超声辐照。</li>
</ol>
6. 治疗效果的 MRI 评估
<ol>
	<li>超声处理后，通过尾静脉导管注射磁共振成像对比剂（例如 0.2 ml/kg Omniscan，GE Healthcare），随后用 0.5 mL 生理盐水冲洗。</li>
	<li>进行 T1-加权成像，直至对比剂峰值通过。成功破坏的超声处理部位将比周围组织显示出更强的增强信号。</li>
	<li>进行 T2-加权成像以检测水肿情况。超声处理部位出现高信号提示存在水肿。</li>
</ol>
7. 典型结果
利用聚焦超声和循环微泡，可成功将磁共振成像（MRI）对比剂递送通过血脑屏障（BBB）。图2显示了聚焦超声（FUS）治疗前后典型的T1-加权图像。图2B显示了一幅对比增强（CE）T1-加权图像，其中在四个超声辐照位置出现明显的局灶性开放区域。超声辐照位置1和2显示出尤为显著的增强信号。在图3中，位置1和2同样表现为T2-加权高信号，提示存在水肿。
T2-加权水肿的范围有时在矢状面切片上更容易观察。图4显示了穿过声刺激位置1和3的对比增强T1-加权和T2-加权矢状面切片。在位置1可见水肿，而在位置3不可见。
捕获的声发射数据的频谱分析（图5）在稳定空化发生时可能显示出谐波发射和/或次谐波/超谐波发射。谐波也可能由组织的非线性引起，而次谐波和超谐波发射仅可能由气泡活动产生14。在较高压力下，可能检测到表明惯性空化的宽带发射。然而，这些现象与比无惯性空化的声照射更多的红细胞外渗和微损伤相关11。
使用较高的超声频率会因更小的焦斑尺寸而产生更局部的开孔。图6显示，较高的频率可用于创建更小的开孔区域。这使得能够在减少颅骨附近效应的情况下，研究大脑中段区域的影响。
<img alt="使用 MRI、小鼠、换能器、函数发生器和三轴定位器的超声聚焦示意图。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1."> 
图 1. 实验装置。
<img alt="大鼠脑部 MRI 扫描图像，T1 加权，聚焦超声治疗前和治疗后，显示对比度变化及图像强度图表。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2。 大鼠脑部治疗前（左）和治疗后（右）的 T1-加权图像，显示四个超声照射位置的信号增强。
<img alt="大鼠脑部治疗前（左）和治疗后（右）T2加权MRI图像对比，显示声照位置1和2处的T2加权水肿，医学影像分析。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3。"> 
图3。 同一只大鼠（与图2相同）在治疗前（左）和治疗后（右）的T2-w脑部图像，显示在声照位置1和2处出现T2-w水肿。
<img alt="FUS治疗后的MRI图像；CE-T1w和T2w序列显示组织反应，用于诊断评估。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4。"> 
图4。 同一只大鼠脑部在治疗后获得的矢状位T1-w（左）和T2-w（右）图像，该大鼠与图2和图3相同。位置1处的开窗（左）与T2-w上的水肿信号（右）相对应。位置3显示开窗（左），但无T2-w水肿。
<img alt="信号频率谱图，显示以 MHz 为单位的 0.5f₀、f₀、1.5f₀ 和 2f₀ 处的峰值。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5。"> 
图 5。 在单次 10 ms 脉冲期间于 551.5 kHz 采集数据所得的频率谱。可观察到基频（f0）、谐波（2f0）以及次谐波/超谐波（0.5 f0、1.5f0）。
<img alt="MRI图像，FUS后CE-T1w，1.503 MHz，脑部成像，显示定向血流，医学研究。" src="/files/ftp_upload/3555/3555fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6。"> 
图6。 大鼠脑组织在1.503 MHz频率下于四个位置进行超声辐照后获得的CE-T1-w轴向（左）和矢状面（右）增强MRI图像。在此频率下，血脑屏障开放区域更为局限。

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</ol>

K. Hynynen 和 R. Chopra 是 FUS Instruments, Inc. 的联合创始人。R. Chopra、A. Waspe 和 K. Hynynen 持有 FUS Instruments, Inc. 的股份。K. Hynynen 收到 FUS Instruments, Inc. 提供的研究资助。

动物和微泡的准备是该操作过程中最关键的两个方面。必须完全去除动物头部的毛发，以避免超声束的衰减。血脑屏障可以在异氟烷麻醉下被破坏，但此时实现稳定且一致的开放会更加困难。
操作微泡时应始终小心谨慎，抽取时必须使用细针头、大直径的针具，以避免微泡破裂。同样，应选用可合理用于尾静脉的最小规格导管（建议使用22号导管）。如果需要更小规格的导管以实现静脉内正确置管，则在注射微泡时需格外小心。微泡注射应始终缓慢进行。
应始终采用脉冲模式进行超声处理。如果使用连续波超声，微泡将无法在换能器焦点处的血管中得到补充，从而无法实现血脑屏障破坏（BBBD）。若治疗后CE-T1-w图像未显示血脑屏障开放迹象，可重复治疗，并确保水位充足，使动物头部浸入水中，且皮肤表面无气泡残留。
较高频率可为小型动物模型提供更优的定位效果，但需要更高的频率输出 原位 压力以诱导开放。还需注意的是，颅骨造成的能量损失在较高压力下更为显著，因此在估算时必须予以考虑。 <e...

<table><tbody><tr><td>小型动物聚焦超声系统</td><td>FUS Instruments, Inc.</td><td>RK-100</td><td></td></tr><tr><td>Definity</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omniscan</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

磁共振成像引导下利用经颅聚焦超声在大鼠模型中破坏血脑屏障

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

聚焦超声（FUS）破坏血脑屏障（BBB）是一种日益受到关注的克服血脑屏障的技术1-5。血脑屏障是脑部疾病药物治疗的重要障碍，因为它仅允许分子量小于约500 Da的分子从血管系统进入脑组织6。FUS诱导的血脑屏障破坏（BBBD）具有暂时性和可逆性4，相较于化学方法诱导BBBD，其优势在于高度局部化。FUS诱导的BBBD为研究多种治疗剂对脑组织的影响提供了手段，这些治疗剂在常规情况下无法以足够浓度递送至脑组织。尽管已有多种超声参数被证实可有效破坏血脑屏障2,5,7，但实验过程中仍存在若干关键步骤，以确保破坏效果的成功实现并实现精确定位。本方案概述了如何在大鼠模型中实现磁共振成像（MRI）引导下的FUS诱导BBBD，重点介绍实验中关键的动物准备和微泡处理步骤。

微泡介导的聚焦超声破坏血脑屏障（BBB）是一种有前景的脑部靶向药物递送无创技术1-3。本方案概述了在大鼠模型中进行磁共振成像引导下经颅BBB破坏的实验操作流程。

聚焦超声（FUS）破坏血脑屏障（BBB）是一种日益受到关注的用于绕过血脑屏障的技术1-5。血脑屏障是一种……

本实验的总体目标是局部破坏血脑屏障，使通常局限于脑血管系统的分子能够进入脑组织。首先需准备实验动物，并将其仰卧置于聚焦超声换能器上方的水浴中，该装置配备有三轴换能器定位系统。实验的第二步是获取磁共振成像（MRI）图像，以为定位系统提供靶向信息。该操作流程的第三步是制备并注射微泡溶液。最后一步是设定超声参数并实施超声照射。最终可通过增强T1加权MRI获得结果，显示超声照射部位血脑屏障的通透性变化。该技术的应用前景涉及脑部和中枢神经系统疾病的治疗，因为这种对血脑屏障的局部且可重复的破坏，使得研究人员能够探索以往对药物治疗反应较差的疾病类型的药理学干预手段。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在操作和注射微泡时需要极大的耐心和谨慎，以避免微泡在到达靶部位之前破裂。动物准备过程的演示将随后展示。我们实验室的一名技术人员选择一个经过适当校准的超声换能器。接下来，将装有已脱气去离子水的水浴放置在1.5特斯拉或3特斯拉磁共振成像（MRI）设备的床面上，将超声换能器安装在水箱内一个与MRI兼容的三轴定位平台或系统上，使其朝向水面。水浴应配备一个顶板，用于在使用异氟烷气体麻醉后固定实验动物，并剃除头部和颈部上方的毛发。然后使用脱毛膏去除残留的毛发。将带有三通阀的22号导管插入尾静脉，并用肝素生理盐水混合液冲洗，以防止导管内形成血凝块。通过肌肉注射给予可注射麻醉剂，并将动物从异氟烷中移出。实验开始前10分钟，在动物头部顶端涂抹少量超声耦合剂，以尽量减少气泡滞留的可能性。然后将麻醉后的动物仰卧放置于超声定位系统上，使其头部顶端通过顶板上的孔与水浴接触。可以使用咬合杆（如有）或将胶带牢固地贴在下巴上来固定头部。然后用胶带将动物的腿部固定在定位系统上。用毛巾或毯子覆盖动物以保持其体温。在实验过程中，使用适当的扫描参数获取脑部的基线轴向T2加权和T1加权磁共振图像。从T2加权扫描图像中选择靶点，避开脑室和脑中线，并选择中脑深度。将换能器焦点移动至目标位置。根据制造商的说明书激活确定的微泡，并缓慢吸取少量液体至1毫升注射器中。使用18号针头，通过轻轻前后推动活塞而非敲击的方式排出注射器中的困留空气。由于此操作可能导致微泡破裂，需将微泡缓慢注入生理盐水注射器中，按10:1的生理盐水与微泡比例进行稀释。轻轻翻转注射器，充分混匀微泡与生理盐水，直至混合液外观均匀一致。根据每公斤体重0.02毫升微泡或每公斤体重0.2毫升溶液计算所需剂量体积。以10比1的比例稀释。使用低占空比脉冲模式设置超声参数，而非连续波超声。检查动物头部是否仍与水耦合。在开始超声处理的同时，缓慢将微泡通过尾静脉导管注入。超声处理结束后，用0.5毫升生理盐水冲洗。通过尾静脉导管注射磁共振成像（MRI）对比剂，随后用0.5毫升生理盐水冲洗。在对比剂峰值过后进行T1加权成像。超声处理。成功破坏的部位将显示出比周围组织更强的增强信号。进行T2加权成像以检查超声处理部位是否存在高信号，后者提示此处存在水肿。此处展示了典型的聚焦超声治疗（FUST）前后的T1加权MR图像。一幅经对比增强的T1加权图像显示出清晰的局部开窗。四个超声辐照位置中，位置一和位置二显示出尤为明显的对比增强。位置一和位置二在FUS术后采用T2加权成像也显示出高信号强度，提示存在水肿。T2加权水肿的范围有时在矢状面切片上更易于观察，此处为经Sunation的CE T1加权和T2加权矢状面切片。FUS术后显示位置一和位置三，水肿可见于位置一，但位置三未见水肿。捕获的声发射数据的频谱分析可能在稳定空化发生时显示出谐波发射以及次谐波和超谐波发射。在551.5千赫下单次10毫秒脉冲期间捕获的数据显示了基频以及谐波、次谐波和超谐波。使用较高的声处理频率会因焦斑尺寸更小而产生更局部化的开孔，如图所示。更高的频率可用于产生更小的开放区域，从而在减少颅骨附近效应的情况下实现对中脑的探究。在实施该操作时，必须牢记仔细处理微泡对于获得良好结果至关重要。一旦该技术得到优化，研究人员便可着手解答其他问题，例如，将治疗剂递送至脑内特定靶点的疗效如何？

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MRI引导下的破坏血脑屏障在大鼠模型经颅聚焦超声

本视频介绍了一种通过微泡介导的聚焦超声（FUS）产生短暂开放来暂时性破坏血脑屏障（BBB）的方法。这些短暂的局部血脑屏障开放最终可用于将较大分子量的药物直接递送至脑实质。...

基于聚焦超声的微泡介导血脑屏障开放：一种通过声孔效应在小鼠血脑屏障中创建局部瞬时开放的技术

聚焦超声结合微泡造影剂可实现血脑屏障的局部和短暂开放。该技术已被用于递送多种物质通过血脑屏障。本文提供了一种在有或无磁共振成像（MRI）引导下，向啮齿类动物脑部进行局部递送的详细实验方案。...

利用聚焦超声在大鼠模型中实现特定部位血脑屏障开放的台式实验方法

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一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

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靶向神经元损伤实现脑环路的非侵入性断开

本方案详细阐述了通过聚焦超声开放血脑屏障（BBB）进行基因递送的必要步骤，以及通过组织学检测评估基因表达水平和化学遗传受体神经调控活性的方法。...

聚焦超声诱导血脑屏障开放以靶向脑结构并评估化学遗传学神经调控

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内...

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通过静脉注射微泡并应用低强度聚焦超声（LIFU），可成功破坏血-脊髓屏障（BSCB）。本方案详细描述了在啮齿类动物模型中使用LIFU开放血-脊髓屏障的操作步骤，包括设备设置、微泡注射、靶点定位以及血-脊髓屏障破坏效果的可视化。...

利用低强度聚焦超声在大鼠模型中破坏血-脊髓屏障

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使用临床前聚焦超声系统监测大鼠血脑屏障开放

在骨转移的发病机制中，血管生成是一个关键过程，因此成为成像与治疗的重要靶点。本文介绍一种部位特异性的乳腺癌骨转移大鼠模型，并描述了用于无创成像血管生成的策略 体内...

利用磁共振成像、容积计算机断层扫描和超声在乳腺癌骨转移裸鼠模型中进行血管生成的多模态成像

血脑屏障的破坏有助于某些药物向脑部的递送。通过动脉内给予甘露醇可使血管周围细胞收缩，从而在物理上破坏该屏障。...

血脑屏障破坏的大鼠模型以实现靶向性神经血管治疗

学习使用微泡介导的聚焦超声技术在大鼠模型中破坏血脑屏障。该方法通过MRI引导实现精准定位，为脑部靶向药物递送提供非侵入性解决方案，有助于神经系统疾病治疗研究。

磁共振成像引导下利用经颅聚焦超声在大鼠模型中破坏血脑屏障

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