Name: 使用传统的空调和心率的方法刺激听觉声学和电刺激对歧视行为的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解经典恐惧条件反射行为范式在听觉假体研究中的应用，通过心率监测识别大鼠对不同声学和电刺激的检测与辨别能力。该方法有助于确定耳蜗核最佳刺激区域和模式，为改善听觉神经损伤患者的治疗策略提供重要依据。

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本研究的经费由加内特·帕斯和罗德尼·威廉姆斯纪念基金会以及拉筹伯大学提供。

<ol><li>Mauger, S. J., Shivdasani, M. N., Rathbone, G. D., Argent, R. E., Paolini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+investigation+of+first+spike+latencies+in+the+inferior+colliculus+in+response+to+multichannel+penetrating+auditory+brainstem+implant+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An in vivo investigation of first spike latencies in the inferior colliculus in response to multichannel penetrating auditory brainstem implant stimulation.</a> Journal of Neural Engineering. 7, 036004-036004 (2010).</li>
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<li>Lenarz, M., Lim, H. H., Patrick, J. F., Anderson, D. J., Lenarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Validation+of+a+Human+Prototype+Auditory+Midbrain+Implant+in+a+Guinea+Pig+Model%5BTitle%5D)+AND+%22JARO%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Validation of a Human Prototype Auditory Midbrain Implant in a Guinea Pig Model.</a> JARO. 7, 383-398 (2006).</li>
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<li>Beitel, R. E., Snyder, R. L., Schreiner, C. E., Raggio, M. W., Leake, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cochlear+stimulation+in+the+deaf+cat%3A+comparisons+between+psychophysical+and+central+auditory+neuronal+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrical cochlear stimulation in the deaf cat: comparisons between psychophysical and central auditory neuronal thresholds.</a> J. Neurophysiol. 83, 2145-2162 (2000).</li>
<li>Vollmer, M., Beitel, R. E., Snyder, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+detection+and+discrimination+in+deaf+cats%3A+Psychophysical+and+neural+thresholds+for+intracochlear+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Auditory detection and discrimination in deaf cats: Psychophysical and neural thresholds for intracochlear electrical signals.</a> Journal of Neurophysiology. 86, 2330-2343 (2001).</li>
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<li>McCreery, D. B., Yuen, T. G., Agnew, W. F., Bullara, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+characterization+of+the+effects+on+neuronal+excitability+due+to+prolonged+microstimulation+with+chronically+implanted+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A characterization of the effects on neuronal excitability due to prolonged microstimulation with chronically implanted microelectrodes.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44, 931-939 (1997).</li>
<li>Liu, X., McPhee, G., Seldon, H. L., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+physiological+effects+of+the+central+auditory+prosthesis%3A+surface+versus+penetrating+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Histological and physiological effects of the central auditory prosthesis: surface versus penetrating electrodes.</a> Hearing Research. 114, 264-274 (1997).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li>
</ol>

Antonio Paolini 博士是 Bioengenesis Technologies Pty Ltd 的董事，该公司是 Tucker Davis Technologies 的澳大利亚代表，同时也是 NeuroNexus 探针在澳大利亚的经销商。

本文所述技术可快速测试多种辨别任务，训练时间短，并允许大幅自动化，从而最大限度减少数据处理所需的研究人员时间。利用植入式心电图（ECG）获得的数据，可在刺激呈现时自动计算心率（HR）变化。心电图处理中的错误（例如遗漏单次心跳）会因在极短时间内导致表观心率出现虚假的大幅变化而易于识别，这种便捷的错误检测方式最大限度减少了耗时的手动数据审查需求。
文中所述心电遥测设备植入技术所获得的记录结果通常干扰极小或无干扰（见图1和图2）。然而，导联在纵隔区域位置的相对微小变化，可能导致邻近肌肉的干扰以及与呼吸相关的特定噪声。在植入过程中，尤其是在缝合固定导联后，验证导联位置是否正确，可对导联位置进行精细调整，从而最大限度地减少干扰。
将电极植入耳蜗核的过程较为困难。通过使用多个频率范围的带通滤波噪声进行连续刺激，而非以往研究所采用的宽带噪声3，可快速评估电极记录位点上细胞群的频率-响应特性，而非特异性较低的噪声响应。在测试电刺激分辨能力的研究中，快速判断是否已获得足够范围的频率调谐细胞群至关重要。若未能获得足够的频率分布，则不同频率区域刺激之间的比较将无法实现。然而，在固定电极位置之前，仍必须完成更为耗时的频率-强度响应图谱绘制，以详细表征细胞群调谐特性的宽窄程度。
在行为训练和测试中，每次试验开始前、刺激呈现之前设置一个无刺激（或静默）时段，有助于观察对初始刺激呈现的反应。当使用电刺激神经时，对刺激起始的反应表明受试者能够简单地察觉该刺激。因此，若在初始刺激呈现时未出现反应，而在引入第二次交替刺激时才出现反应，则可推断仅后者刺激能被察觉。若不设置此类静默时段，将无法判断初始刺激是否未被察觉。
该行为测试技术的一个局限性在于，在神经刺激呈现后未给予足底电击，可能导致条件性恐惧的特异性形成，即仅在呈现声学刺激时才表达恐惧反应。也就是说，动物可能学会将神经刺激特有的感觉效应与未受到足底电击联系起来。相反，在神经刺激呈现后给予足底电击，则可能导致动物对神经刺激本身产生条件性恐惧，这种恐惧独立于神经刺激可能具有的任何类似声音的特性。在神经刺激后不给予足底电击所获得的结果，相较于在神经刺激后给予足底电击的情况，能够为神经刺激具有类声学特性提供更有力的证据，因为在前者中，条件性恐惧已从声学刺激泛化至神经刺激。然而，仍存在动物对声学刺激而非神经刺激产生特异性的风险。使用带通滤波噪声作为声学刺激，而非纯音脉冲，可能有助于降低此类特异性发展的风险，因为前者可能更接近神经刺激的感知体验。然而，这种方法引入了滤波器带宽这一额外变量，会影响辨别任务的结果。
与任何慢性神经植入（如行为学测试所需）相关的另一个局限性是，电极或相关神经组织的功能会随着时间推移而发生变化。对神经组织的刺激可能导致神经活动的暂时性抑制13，以及细胞丢失14和脑组织对电极的直接反应等组织学改变15。
所述的植入和行为测试方法能够在短暂训练后检测对声学和电刺激的感知与辨别能力，并可控制试验频率。利用心率变化作为条件性恐惧指标的技术不仅适用于听觉测试，还可广泛应用于任何能够呈现离散时间段刺激并需要检测感觉感知或辨别能力的感觉功能测试中。

<table><tbody><tr><td>PowerLab</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/products/pl3508#overview" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>ML880</td><td>记录来自植入式 TR40 发射器接收的数据</td></tr><tr><td>SmartCtrl 控制器卡</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>DIG-716B</td><td>控制行为测试箱，包括足底电刺激</td></tr><tr><td>模块化行为测试箱</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>ENV-009</td><td>测试箱尺寸：30.5 cm × 39.4 cm</td></tr><tr><td>厌恶刺激发生器</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>ENV-410B</td><td>通过固态随机化单元向笼子的金属栅地板传递厌恶性足底电击</td></tr><tr><td>可编程衰减器</td><td>TDT</td><td>PA5</td><td>控制所传递声学信号的幅度，以确保在不同频率下幅度稳定</td></tr><tr><td>静电扬声器驱动器</td><td>TDT</td><td>ED1</td><td>驱动静电扬声器（EC1、ES1）</td></tr><tr><td>自由场静电扬声器</td><td>TDT</td><td>ES1</td><td>在行为测试箱中使用该扬声器呈现声音</td></tr><tr><td>耦合式静电扬声器</td><td>TDT</td><td>EC1</td><td>在神经植入手术期间使用该扬声器呈现声音</td></tr><tr><td>刺激器基站</td><td>TDT</td><td>RX7</td><td>控制电神经刺激的传递（与 MS16 配合使用）</td></tr><tr><td>微刺激器</td><td>TDT</td><td>MS16</td><td>传递多通道电神经刺激</td></tr><tr><td>处理基站</td><td>TDT</td><td>RZ2</td><td>在脑部植入期间记录神经活动（使用 PZ2 前置放大器）</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>TDT</td><td>PZ2-256</td><td>256 通道高阻抗前置放大器</td></tr><tr><td>遥测设备接收器</td><td>Telemetry Research</td><td>TR162</td><td>接收来自 TR40 的数字信号，并将其转换为放大的模拟输出</td></tr><tr><td>可植入心电图遥测设备</td><td>Telemetry Research</td><td>TR40</td><td>植入式发射器设备，采样频率为 2 kHz</td></tr><tr><td>多功能处理器</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RX6</td><td>用于生成声学刺激</td></tr><tr><td>Vertex Castavaria</td><td>Vertex Dental</td><td></td><td>用于固定电极的牙科丙烯酸材料</td></tr><tr><td>Kwik-Sil 粘合剂，低粘度</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>用于涂覆电极杆的硅酮弹性体</td></tr><tr><td>多通道电极</td><td>NeuroNexus Technologies</td><td>a2x16-10mm 100-500-413</td><td>用于植入的双杆 32 通道细胞外电极阵列。电极位点已激活，以形成氧化铱涂层，为刺激做准备。</td></tr></tbody></table>

利用经典条件反射与心率法测定听觉声学与电刺激信号对辨别行为的研究

Behavioral Determination of Stimulus Pair Discrimination of Auditory Acoustic and Electrical Stimuli Using a Classical Conditioning and Heart-rate Approach

急性动物实验已被用于前瞻性研究神经听觉假体（如听觉脑干植入物1-3和听觉中脑植入物4,5）中的电极设计与刺激技术。尽管急性实验可初步揭示植入装置的有效性，但对慢性植入且清醒动物进行测试的优势在于能够评估通过植入设备所诱发感觉的心理物理学特性6,7。
已有多种技术被用于提供对相关刺激属性检测的行为学验证，例如基于奖励的操作性条件反射6-8、条件性回避9-11或经典恐惧条件反射12。选择何种技术需权衡多个因素，包括时间效率（基于奖励的方法通常效率较低）、能否同时测试多种刺激属性（条件性回避在此方面受限），以及重复刺激的测量可靠性（当采用生理学测量时可能存在此限制）。
本文介绍了一种经典的恐惧条件反射行为学方法，可用于同时检测动物对刺激的感知能力以及对两种刺激之间的辨别能力。采用心率作为恐惧反应的指标，从而减少或无需耗时的视频编码来分析冻结行为或其他类似指标（尽管也可加入此类指标以提供 convergent evidence）。动物通过这些技术进行训练，共进行三次、每次2小时的条件反射训练 session，每次提供48次刺激试验。随后进行48次试验的测试 session，用于检测每对刺激中各个刺激的感知能力，并检验每对刺激中各成员刺激之间的辨别能力。
该行为学方法在听觉假体研究中的应用被予以介绍。展示了心电图遥测装置的植入过程。同时展示了在声学刺激诱发的神经反应监测引导下，将脑电极植入耳蜗核，并将其固定以实现长期使用的过程。

本文描述了一种在大鼠听觉假体研究中应用的经典恐惧条件反射行为范式。该范式通过心率作为评估指标，提供了一种识别动物对不同声学和电刺激进行检测及分辨的方法。

急性动物实验已被用于前瞻性研究电极设计和刺激技术，以期将其整合到神经……

本实验的总体目标是确定能够刺激耳蜗核并产生可被动物区分的频率感知的刺激区域及神经刺激模式。首先，植入心率监测装置，以测量动物的生理反应。随后，将一根神经电极植入耳蜗核，用于向听觉系统传递刺激。然后，训练动物检测所呈现音调的频率差异，并产生生理反应。最后，测试动物对听觉系统不同位置和神经刺激模式的识别能力。最终，可获得结果，显示耳蜗核的哪些区域最适合用于听觉假体刺激及刺激模式。该技术最适合用于此类设备，通过识别能够持续产生不同频率感觉的刺激位置和模式来实现。与现有的方法（如急性制备中的神经刺激与记录）相比，该技术的主要优势在于能够识别出动物实际能够区分和感知的刺激靶点和技术。该技术的应用前景可延伸至耳聋治疗领域，尤其适用于因耳蜗功能受损或听觉神经损伤而无法使用人工耳蜗植入的患者。该技术将有助于确定最能模拟正常声学处理的刺激策略。在植入心电图遥测设备后三到五天，开始进行脑电极植入，首先给予镇痛剂和麻醉剂。确认麻醉成功后，剃除动物头部毛发，先用聚维酮碘洗液酒精擦拭，再用聚维酮碘擦拭。将动物置于恒温板上。抬起并调整动物位置，使其位于耳杆之间，将第一根耳杆插入外耳道。固定第一根耳杆的位置。然后使用大鼠齿镊将第二个耳杆滑入到位。打开动物的下颌，将上切牙钩在门齿固定器上。固定就位后，将鼻罩套在鼻部以开始异氟烷的输送，异氟烷输送将持续整个手术过程。暴露顶骨后，使用20%过氧化氢溶液擦拭其表面。在纱布垫上，于顶间骨最外侧区域钻一个约2毫米见方的孔。用无菌生理盐水冲洗该孔，以清除可能损伤电极的骨屑、粉尘或骨碎片。在显微镜下操作，在左侧顶骨和右侧顶间骨分别钻一个小孔。接下来，将外科级不锈钢螺钉拧入每个孔中，使每颗螺钉的头部与颅骨之间保留约0.5毫米的间隙。将耦合扬声器连接至左侧中空耳杆。将电极操纵器移至开口上方，保持10度的Cato头侧角度。然后使用针尖在矢状面上对硬脑膜做一切口。手动将电极插入大脑表面约两毫米。将螺钉连接至高阻抗前置放大器的接地和参考电极点。确保放大器已开启。然后封闭记录室，开始循环递送低中频和高频带通滤波噪声，最大递送速率为每200毫秒一个脉冲。监测每个通道的神经活动，以检测对噪声的反应。呈现。继续插入电极，直至总插入距离接近8毫米，或直至观察到对噪声刺激的反应。如果已到达耳蜗核，电极尖端的记录位点应主要对高频刺激产生反应。继续插入电极，直至其尖端检测到反应。对低频刺激或听觉驱动活动的反应停止出现。如果活动停止，则电极可能已完全穿过耳蜗核，可能需要调整电极的位置。通过在目标频率范围内以纯音刺激，按频率步进、声强从1至70分贝进行刺激，每种刺激重复10次，构建电极位点处神经元的频率-幅度反应图谱。为保护脑组织和电极，应在暴露的电极臂上方涂抹一层薄薄的硅胶弹性体，使弹性体沿电极臂流下，覆盖电极臂及脑组织的暴露表面。为固定电极，需涂抹牙科水泥，将电极的地线连接至螺钉，并进一步涂抹牙科水泥以增强固定强度。待水泥硬化后，缝合电极周围的切口，然后将动物的饲养笼置于加热垫上持续24小时，以促进其恢复。激活遥测设备后，将动物放入测试舱内，并在开始条件化前使其适应环境五分钟。进行条件化操作时，在80至170秒内以250毫秒的声刺激对中的一个随机选定成员进行重复刺激，每次刺激持续250毫秒，间隔250毫秒的静音期。每次刺激呈现的上升和下降时间必须为10毫秒。为避免感知到点击声，开始交替呈现。将声学刺激对中的第二个刺激与第一个刺激配对，每个音调呈现250毫秒，随后间隔250毫秒的静音。在10秒交替音调呈现期的前9.5秒结束后，给予一次持续0.5毫秒的足底电击，然后停止音调呈现30秒，以使心率稳定。重复此过程，直至完成48个循环的实验程序。为确保每对音调有足够的重复次数用于分析，需保证每对音调至少呈现四次。在连接神经刺激电缆并在异氟烷麻醉下激活遥测设备后，让动物恢复并在测试前于测试舱内适应环境10分钟。为了维持前一天的条件刺激，按照先前所述方法给予交替的声学刺激对，随后给予一次持续0.5毫秒的足部电击。待心率稳定后，从电刺激对中随机选择其中一个刺激，以250毫秒为脉冲持续时间，间隔250毫秒的静音，重复给予，总时长为80至170秒。随后开始交替呈现电刺激对中的第二个刺激与第一个刺激，每次声音持续250毫秒，后接250毫秒的静音，交替共持续10秒。以随机选择的下一组电刺激配对重复该循环，直至每组配对至少在随机时间间隔内完成20次试验。插入声学刺激配对以维持条件反射。测试完成后，关闭遥测设备，断开刺激电缆，并将动物放回其饲养笼中。此处显示的是电极放置正确时的电生理反应。每个直方图展示一个电极位点在单一频率下的数据，每列代表电极阵列两个分支上 25 毫秒的时间段。仅在特定窄频带刺激下，各个独立电极位点才会产生反应，但这些窄频带在较宽的频率范围内分布。这种分布是最佳的，因为可以独立刺激大脑中许多不同频率相关的区域。理想情况下，电极的放置应使得在声学刺激下，多个通道能够检测到神经反应，且声音强度可低至10分贝，如第10通道的电生理反应所示。此处显示的是电极放置不当时的电生理反应：电极阵列每个分支的尖端均记录到电活动，但在各个电极位点引发电活动的声学刺激频率变化较小。这种植入方式无法实现对不同频率层的刺激以进行辨别测试。此处显示的是在交替电刺激呈现开始前八秒至开始后八秒期间，个体轨迹及与心率成比例的平均数据。这些数据采集于第七次测试会话期间，共包含12次电刺激呈现。在施加第二个神经刺激后，心率迅速显著下降，随后出现心率的显著上升，表明该动物已检测到第一次与第二次刺激之间的差异。反应的误差程度和变异情况显示在比例均值加标准误图中，可通过95%置信区间验证第二次刺激呈现后心率下降和上升的显著性。在进行该操作时，需注意动物能够感知的任何外界刺激均可能导致心率变化，从而增加实验结果的变异性；因此，测试和条件训练应在一致且良好隔离的环境中进行，以尽量减少这些影响。该技术的建立为仿生学领域的研究人员探索通过电刺激在多种感觉系统中引发行为相关反应的更优方法奠定了基础。

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