Name: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术:人体模型支架内再狭窄的研究开发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: 了解人乳内动脉支架置入及移植技术，用于研究支架内再狭窄和血管重塑。该人源化大鼠模型结合免疫荧光共聚焦显微镜，为心血管病理转化医学提供可靠研究平台。

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作者感谢Christiane Pahrmann的贡献。特别感谢位于德国汉堡诺德施泰特的Ethicon公司提供缝合材料。
资金
Sonja Schrepfer 已获得德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）的研究资助（项目编号：SCHR992/3-1 和 SCHR992/4-1）。本工作得到了国际心肺移植学会（ISHLT）Shumway 职业发展资助（2010 年）以及 Falk 研究基金（斯坦福大学）的支持。

1. 内乳动脉（IMA）准备
<ol>
	<li>通过推送一根 2 法式 Fogarty 动脉取栓导管（Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA）来去除动脉内皮。将导管在整个血管长度内拉动两次，以确保实现内皮损伤。</li>
	<li>使用长度为 8 mm、直径为 2.5 mm–3 mm 的任意一种人体支架（例如 Translumina, Yukon 支架）。注意：支架直径不应超过血管直径的 10%，以避免支架前后发生狭窄。注意：在同一项研究中不得更换支架长度。</li>
	<li>根据支架包装上标注的适当球囊压力进行支架置入，以达到目标直径。</li>
	<li>将置入支架的 IMA 储存在含肝素（500 IE/10 ml）的 4 °C RPMI 溶液中，并置于冰上，直至移植。</li>
</ol>
2. 动物准备
RNU裸鼠（Crl:NIH-Foxn1rnu大鼠（300–350 g）饲养于常规条件下的Scantainer通风柜中，给予标准大鼠饲料和高压灭菌水 随意供应.
<ol>
	<li>使用诱导室以异氟烷（2.5-3%）麻醉大鼠。</li>
	<li>剃除腹部毛发，将大鼠仰卧放置，并在其口鼻部覆盖面罩以维持麻醉状态。</li>
	<li>使用聚维酮碘广泛消毒腹部区域，随后使用80%乙醇，重复此步骤两次。通过夹捏后肢检查反射，确认大鼠已充分麻醉。</li>
	<li>在显微镜视野下，行上腹正中切口，暴露肾下腹主动脉。</li>
	<li>将肠管置于生理盐水湿润的手套中，并将手套包裹肠管以防止水分流失。</li>
	<li>从肾下区域开始解剖腹主动脉至分叉处，注意避免损伤血管分支。</li>
	<li>使用微型夹钳阻断主动脉血流，先放置近端夹钳，再放置远端夹钳。</li>
	<li>切除约0.5-0.7 mm的主动脉节段，并用肝素（200单位）冲洗剩余主动脉。</li>
	<li>取带支架的内乳动脉（IMA），将其剪裁至适当长度并置入缺损处。</li>
	<li>使用8-0 Prolene缝线（Ethicon, Norderstedt, Germany）连续缝合，将IMA与受体主动脉连接。</li>
	<li>小心打开第一个近端夹钳，随后打开远端夹钳。</li>
	<li>移植的IMA及主动脉远端应可见搏动。</li>
	<li>将肠管放回腹腔内。</li>
	<li>用预热的无菌生理盐水冲洗腹腔。</li>
	<li>使用6-0 Prolene缝线（Ethicon, Norderstedt, Germany）连续缝合腹壁肌层。</li>
	<li>在大鼠仍处于麻醉状态时，皮下注射4-5 mg/kg卡洛芬。</li>
	<li>术后根据需要给予镇痛治疗（如卡洛芬或美洛昔康），持续3天。</li>
</ol>
3. 代表性结果
进行组织学分析时，将样本用4%甲醛固定，经梯度酒精脱水后，于混合液（MMA I，含80%甲基丙烯酸甲酯和20%邻苯二甲酸二丁酯）中浸透1天，随后在含1%干燥过氧化苯甲酰的MMA I中浸透1天，再在含3%干燥过氧化苯甲酰的MMA I（MMA III）中于4 °C下浸透1–2天。之后，将样本置于玻璃小瓶中的新鲜MMA III内，在预聚合基底上的水浴中进行聚合。通过将小瓶在26 °C下过夜，次日早晨升温至28 °C，随后在12小时内每0.5小时升高0.5 °C，逐步升温以实现缓慢聚合。聚合后的组织块使用配备碳化钨刀片的MICROM HM 360切片机切片，厚度为5 μm。
为了确定增殖细胞的来源（图1），切片使用抗体进行染色，以识别绿色荧光蛋白（GFP）、大鼠MHC-I或人源平滑肌细胞。在这些研究中，人内乳动脉（IMA）使用慢病毒颗粒与报告基因GFP共孵育过夜，以实现IMA细胞的稳定转导。来源于人源的分裂子代细胞可通过表达GFP进行识别。脱蜡后，通过蒸锅在抗原修复液中加热切片，进行热诱导表位修复。Image-iT FX信号增强剂可用于封闭步骤。使用小鼠单克隆抗GFP抗体（1:100稀释于一抗稀释液（Dako）中）识别人源细胞，再用山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488（1:1000稀释于二抗稀释液中）进行标记。平滑肌细胞则使用兔多克隆抗平滑肌α-肌动蛋白抗体（1:100稀释于一抗稀释液中）标记，随后使用山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 555（1:1000稀释于二抗稀释液中）进行二抗孵育。每次抗体孵育步骤均在37 °C下进行1小时，期间用PBS洗涤三次。细胞核使用DAPI染色10分钟。使用Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂封片后，样本通过共聚焦显微镜进行分析。
<img alt="荧光显微镜，GFP/DAPI，SMA/DAPI，大鼠MHC-I，组织染色，细胞成像比较。" src="/files/ftp_upload/3663/3663fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 新生内膜细胞为人源平滑肌细胞。 A：绿色=抗GFP抗体，标记人源细胞；红色=抗人平滑肌细胞肌动蛋白抗体；蓝色=DAPI，用于标记细胞核。B：绿色=抗大鼠MHC-I抗体，标记大鼠源细胞；红色=抗人平滑肌细胞肌动蛋白抗体；蓝色=DAPI，用于标记细胞核。增殖的细胞表现为平滑肌细胞表型，GFP阳性，但大鼠MHC-I分子阴性，因此这些增殖细胞为人源细胞。

<ol><li>Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+In-Stent+Restenosis%3A+An+Inexpensive%2C+Reliable%2C+and+Rapid+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model.</a> J. Vis. Exp. (31), e1346(2009).</li>
<li>Oyamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-iliac+rat+aorta+stenting%3A+a+novel+high+throughput+preclinical+stent+model+for+restenosis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis.</a> J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).</li>
<li>Chamberlain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+research%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).</li>
<li>Deuse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+the+first+polymer-free+leflunomide+eluting+stent%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent.</a> Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).</li>
<li>Finn, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+healing+after+sirolimus%2C+paclitaxel%2C+and+bare+metal+stent+placement+in+combination+with+peroxisome+proliferator-activator+receptor+gamma+agonists%3A+requirement+for+mTOR%2FAkt2+in+PPARgamma+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation.</a> Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Tellez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+bare+metal+stent+implantation+in+homozygous+LDL+receptor+deficient+swine+induces+a+neointimal+formation+pattern+similar+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans.</a> Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).</li>
<li>Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-clinical+animal+model+in+the+translational+research+of+interventional+cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc.+Interv%22%5BJournal%5D)">The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology.</a> JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).</li>
<li>Holt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intimal+proliferation+in+an+organ+culture+of+human+internal+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+research%22%5BJournal%5D)">Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery.</a> Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).</li>
<li>Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+internal+mammary+artery+organ+culture+model+of+coronary+stenting%3A+a+novel+investigation+of+smooth+muscle+cell+response+to+drug-eluting+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents.</a> Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

尽管目前已存在多种用于研究支架植入后内膜增生发展的体内实验模型，但这些模型在转化应用方面仍面临诸多障碍。此外，大型动物模型成本高昂，且并非所有实验室都具备相应的特殊饲养条件和手术设备。
既往已采用人内乳动脉（IMA）在器官培养中体外（ex situ）研究人血管内膜增生及支架内再狭窄的发生机制8,9。本研究所建立的新的人源化IMA模型是一种可转化的研究方法，通过将人IMA移植至免疫缺陷型大鼠的腹主动脉部位，可在体内（in vivo）研究支架内再狭窄问题。人IMA的管径与大鼠腹主动脉极为匹配，因此本研究所提出的方法具有可重复性强、操作简便快速、无需特殊外科手术培训且成本低廉的优点。
将新生内膜细胞鉴定为人类平滑肌细胞，弥合了向临床应用转化的差距，并展示了研究人类病理生理过程的机会 体内.

<table><tbody><tr><td>2 号法国 Fogarty 导管</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>120602F</td><td></td></tr><tr><td>Yukon 支架</td><td>Translumina GmbH, Hechingen, Germany</td><td></td><td>根据您的研究方案选择合适的支架</td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Biochrom AG</td><td>Nr.F1275</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2B0953</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott Laboratories</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Provo-碘</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td>EAN:5995327165830</td><td></td></tr><tr><td>80% 乙醇</td><td>Geyer</td><td>ETV 80/0500</td><td></td></tr><tr><td>微型夹钳</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2-61-0186</td><td></td></tr><tr><td>8-0 缝合线</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>2808G</td><td></td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>1698 H</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Feizer Vet</td><td>PZN:0110208</td><td></td></tr><tr><td>安乃近</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 9 靶修复溶液</td><td>Dako</td><td>S2368</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT FX 信号增强剂</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 GFP 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>一抗稀释液</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>二抗稀释液</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗平滑肌 &amp;alpha;-肌动蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21430</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

人内乳动脉（ima）移植与支架植入：研究支架内再狭窄发生的人体模型

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

研究支架植入后血管内膜增生发生过程中病理生物学和病理生理学机制的临床前体内模型，对于转化研究至关重要1,2。
常用的动物模型包括小鼠、大鼠、兔子和猪3-5。然而，将这些模型转化为临床应用仍然存在困难，因为这些生物学过程已在动物血管中得到研究，但在人类研究模型中尚未开展过相关实验6,7。在本视频中，我们展示了一种新型的人源化模型，以克服这一转化障碍。该操作方法可重复、简便且快速，适用于研究内膜增生的发展过程以及不同类型支架的适用性。
本视频展示了如何在人体血管中实施支架技术，随后将其移植到免疫缺陷大鼠体内，并确定增殖细胞的来源为人源细胞。

本视频展示了一种利用免疫缺陷大鼠模型中的人体血管（IMA）研究支架植入后内膜增生发展的模型。

人内乳动脉（IMA）移植与支架植入：研究支架内再狭窄发生的人体模型

用于研究血管成形术后内膜增生发生过程中病理生物学与病理生理学机制的临床前体内研究模型

本实验的总体目标是在人源化模型中研究内膜增生的发育过程。首先使用2法式Fogarty导管剥离一段人体乳内动脉（IMA），随后将支架植入该乳内动脉中。然后将一段大鼠腹主动脉替换为支架植入的内乳动脉。最后缝合伤口，让动物恢复。由于球囊扩张和支架植入的侵入性操作导致内皮损伤，进而引发炎症反应并产生炎症性细胞因子。这会促使平滑肌细胞增殖，逐渐堵塞血管管腔，最终导致狭窄。最终，可以通过免疫荧光共聚焦显微镜获得人平滑肌细胞增殖的结果。今天我们将向您展示一种用于在红色宿主中评估人动脉腕部狭窄的模型。与现有的腹主动脉狭窄等技术相比，该模型的优势在于我们能够在人体组织中评估人源性支架。我们最初在寻找一种可用于血管重塑研究的转化性体内模型时，提出了该方法。制备内乳动脉（IMA）时，首先使用一根2法式Fogarty动脉取栓导管，将导管插入血管内并移动以剥离动脉内皮，确保造成内皮损伤。随后将一枚长度为8毫米、直径为2.5至3毫米的人工支架置入血管中。使用适当的球囊压力，释放支架以达到目标直径。将带有支架的内乳动脉（IMA）保存在含有肝素的RPMI培养基中，置于冰上，4摄氏度保存，直至移植。用异氟烷麻醉大鼠后，剃除腹部毛发，将面罩覆盖其口鼻以维持2%的麻醉状态，先用聚维碘酮广泛消毒腹部区域，随后使用80%乙醇进行二次消毒。重复上述步骤两次。捏住大鼠的后肢足部，以确认其已充分镇静。接着，行上腹正中切口开腹术，暴露肾下腹主动脉。然后将肠管置于生理盐水湿润的手套中，并将手套折叠包裹肠管以防止水分流失。在手术显微镜下，从肾下区域向分叉处解剖腹主动脉，注意避免损伤血管的分支。为阻断主动脉血流，先用微血管夹夹闭近端，再夹闭远端。切除一段长约0.5至0.7毫米的主动脉节段，并用200单位肝素冲洗剩余的主动脉。接下来，将带支架的内乳动脉修剪至适当长度，并将其置入主动脉缺损处。然后使用连续缝合线将内乳动脉与受体主动脉进行吻合。先小心打开尾侧夹，随后打开头侧夹。移植的乳内动脉及主动脉远端应可见搏动。将肠管放回腹腔，并用预热的无菌生理盐水冲洗腹腔。使用六根普罗啉连续缝合线缝合腹壁肌层，然后缝合皮肤层。在大鼠仍处于皮下麻醉状态时，注射每千克体重4至5毫克的卡洛芬。每日监测动物，直至移除IMA，以确定增殖的来源。人 IMA 经稳定转导后在血管中过表达 GFP。组织学切片使用针对 GFP 的抗体进行染色，GFP 显示为绿色，人平滑肌肌动蛋白（SMA）显示为红色。细胞核呈蓝色。此处显示的是共聚焦图像，展示了增殖细胞的来源。该三维视频显示了术后SMA（红色）与GFP（绿色）的共定位。还可采用其他方法，如组织病理学和共聚焦免疫荧光显微镜，以回答管腔闭塞、形态学特征及细胞数量等相关问题。该方法是转化研究中一种颇具前景的模型。感谢观看，祝您的实验顺利。I.

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