Name: 代人类诱导多能干细胞从外周血中使用STEMCCA慢病毒载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞的方法。该方案通过单病毒载体简化重编程流程，提高iPSC技术的可及性，适用于再生医学研究。

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这些研究部分由 NIH UO1HL107443-01 奖项资助，授予 GJM 和 GM。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离与扩增
第0天
<ol>
 <li>采集4 ml外周血至含柠檬酸钠的BD Vacutainer CPT细胞分离管中，轻轻倒置混匀8到10次，室温下1,800 x g离心30分钟。此步骤最好在采血后2小时内完成。</li>
 <li>用移液管将位于凝胶屏障与血浆之间的单个核细胞层（即血沉棕黄层）转移至无菌的15 ml圆锥形离心管中，收集单个核细胞（MCs）。加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）使总体积达到10 ml，轻轻颠倒混匀数次，于300 × g离心15分钟。</li>
 <li>将细胞重悬于 10 ml 无菌 PBS 中并进行细胞计数。转移 1 至 2×106 将细胞转入无菌15 ml锥形离心管中，以300 × g离心10分钟。</li>
 <li>用 2 ml 扩增培养基（EM）（QBSF-60 干细胞培养基，含 50 μg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL-3、2 U/ml EPO、40 ng/ml IGF-1、1 μM 地塞米松和 100 μg/ml primocin 或 1% 青霉素/链霉素）重悬细胞，转移至 12 孔板中的一个孔。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。2 培养箱</li>
 <li>离心剩余细胞，300 x g 离心 10 分钟，冻存约 2×106 含10% DMSO的FBS中每小瓶细胞数。</li>
 <li>使用冻存的PBMCs开始实验方案时，将1管细胞解冻至10 ml QBSF培养基中，于300 × g离心10分钟。用2 ml EM重悬细胞，转移至12孔板中的1个孔内。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。2 培养箱</li>
</ol>
第3天和第6天
<ol start="17">
 <li>将细胞转移至无菌的15 ml圆锥形离心管中，用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔板一次，以收集贴壁细胞。</li>
 <li>在300 × g条件下离心细胞10分钟。</li>
 <li>将细胞重悬于2 ml EM中，并转移至12孔板的一个孔内。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
</ol>
2. 使用STEMCCA慢病毒转导PBMCs
第9天
<ol>
 <li>将细胞转移至无菌的15 ml锥形管中，并用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔壁一次，以收集贴壁细胞。</li>
 <li>以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>将细胞重悬于 1 ml 含 5 μg/ml 多聚素（polybrene）和 STEMCCA 慢病毒（MOI = 1 至 10）的新鲜 EM 中，并转移至 12 孔板的一个孔内。（慢病毒颗粒制备的方案可参见 <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a>)</li>
 <li>在25 °C下以2,250 rpm转速离心90分钟。</li>
 <li>离心后，加入额外的1 ml新鲜EM 含 5 μg/ml 多聚素的完全培养基，总体积为 2 ml，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 培养箱</li>
</ol>
第10天
<ol start="16">
 <li>将细胞转移至无菌的15 ml锥形管中，并用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔壁一次，以收集贴壁细胞。</li>
 <li>在300 × g条件下离心细胞10分钟。</li>
 <li>用2 ml EM重悬细胞，转移至12孔板中的1个孔内。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
</ol>
3. 将转导细胞接种至MEFs上
第11天
<ol>
 <li>用0.1%明胶包被6孔板的孔，每孔以2×105个细胞的密度接种失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），培养基为MEF培养基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 μM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml普乐霉素或1%青霉素-链霉素）。每种感染准备3个孔。</li>
</ol>
第12天
<ol start="2">
 <li>将细胞转移至无菌的15 ml锥形管中，并用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔板一次，以收集贴壁细胞。</li>
 <li>将细胞重悬于3 ml含有10 ng/ml bFGF、抗坏血酸以及与EM培养基中相同浓度生长因子的MEF培养基中（50 μg/ml抗坏血酸、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL-3、2 U/ml EPO、40 ng/ml IGF-1、1 μM地塞米松）。</li>
 <li>将1 ml细胞接种至含MEF饲养层的6孔板每孔中。每孔加入1.5 ml含有bFGF、抗坏血酸和生长因子的MEF培养基，使每孔培养基总体积为2.5 ml。</li>
 <li>在25 °C下以500 rpm离心30分钟。随后将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
</ol>
第14天
<ol start="6">
 <li>每隔一天使用含有 10 ng/ml bFGF 和 50 μg/ml 抗坏血酸（无生长因子）的 2.5 ml MEF 培养基喂养细胞。每次换液时吸除并弃去悬浮细胞。</li>
 <li>根据需要添加额外的 MEF 细胞（通常每周一次）。</li>
</ol>
~ 第20天
<ol start="8">
 <li>当出现小克隆后，每天使用 2 ml 人胚胎干细胞（hESC）培养基（含 20% Knockout 血清替代物、1% 非必需氨基酸、100 μM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml 原霉素或 1% 青霉素-链霉素以及 10 ng/ml bFGF 的 DMEM/F12 培养基）进行换液。</li>
</ol>
4. iPSC 克隆的挑选与扩增
~ 第 30 - 40 天
<ol>
 <li>将每个克隆分别挑取至已预先接种灭活MEF的12孔板中，每孔加入含10 μM Stemolecule Y27632（ROCK抑制剂）的hESC培养基1 ml。</li>
 <li>此后每天仅用1 ml hESC培养基更换培养液（不含ROCK抑制剂）。</li>
</ol>
5. 多能性标志物的免疫荧光染色
<ol>
 <li>使用 Millipore 公司的“ES Cell Marker Sample Kit”试剂盒，并按照制造商提供的方案进行染色。</li>
</ol>
6. 整合型STEMCCA载体的切除
<ol>
 <li>通过转染表达 Cre-IRES-Puro 的载体并进行短暂的嘌呤霉素筛选，即可实现重编程盒的切除，具体方法如文献6所述。</li>
</ol>

<ol><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li>
<li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li>
<li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34%28-%29+cells%2C+outweighing+the+contribution+of+CD34%28%2B%29+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文描述了使用STEMCCA慢病毒载体，从少量新鲜采集的外周血中分离出的单个核细胞生成人诱导多能干细胞（iPSC）的方法。该方案也可用于重编程冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（直接来源于血沉棕黄层），这一点在使用来自远距离供体的细胞时具有重要的实际意义。在启动重编程之前，分离得到的PBMC必须经历一个关键的扩增步骤，以获得健康且具有增殖能力的细胞群体，从而更易于进行核重编程。在造血培养条件下扩增时，可通过观察到类似“葡萄串样”的细胞簇来轻松判断扩增效果。当转导细胞数少于5×105时，可将细胞接种至含有小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的6孔板中的一个或两个孔内。我们在实验中发现，观察到类似人胚胎干细胞（hESC）样克隆所需的时间存在一定变异，某些情况下可长达转导后25天。使用ROCK抑制剂对于提高 emerging iPSC克隆在挑取过程中的存活率和克隆效率至关重要。值得注意的是，与从重编程的成纤维细胞中挑取克隆的情况不同，从重编程的PBMC中挑取的克隆几乎100%能够建立稳定的iPSC克隆系，并可进一步扩增和冻存。最后，我们认为，样本采集的简便性结合本文所述高效且稳定的重编程方法，构成了一个真正可靠的平台，适用于需要...

<table><tbody><tr><td>含柠檬酸钠的 BD Vacutainer CPT 细胞制备管</td><td>BD Biosciences</td><td>362760</td><td></td></tr><tr><td>QBSF-60 干细胞培养基</td><td>Quality Biological</td><td>160-204-101</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>MP Biomedicals</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>286-EP</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>胚胎干细胞标志物样本试剂盒</td><td>Millipore</td><td>SCR002</td><td></td></tr></tbody></table>

使用stemcca慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

通过异位表达四种转录因子Oct4、Klf4、Sox2和cMyc，可将人类体细胞重编程为多能状态，从而生成所谓的诱导性多能干细胞（iPSCs）1-4。患者特异性的iPSCs避免了围绕胚胎干细胞（ESCs）存在的伦理问题，并可规避潜在的免疫排斥反应。因此，iPSCs在疾病模型研究、药物化合物筛选以及再生治疗等领域受到了广泛关注5。
我们已利用一种可切除的单个多顺反子慢病毒干细胞盒（STEMCCA），生成了不含转基因的人类诱导多能干细胞（iPSC），该载体编码山中因子6。这些iPSC系来源于皮肤成纤维细胞，这是重编程中最常用的细胞类型。通常，获取成纤维细胞需要进行皮肤钻孔活检，随后在体外培养中扩增数代。重要的是，已有多个研究团队报道了将人类外周血细胞重编程为iPSC的方法7-9。其中一项研究采用了STEMCCA载体的四环素诱导型版本9，该方法需要同时用一种持续表达编码反向四环素转录激活因子的慢病毒感染血细胞。与成纤维细胞相比，外周血细胞可通过微创方式采集，显著减轻患者的不适与痛苦。采用一种组成型、单次可切除载体对血细胞进行重编程的简单高效方案，可能通过使更多研究者能够使用该技术，从而加速iPSC技术的应用。此外，对外周血细胞的重编程使得可以从那些应避免皮肤活检（例如：异常瘢痕形成）或因已有疾病状况而无法进行钻孔活检的个体中获得iPSC。
本文展示了一种利用单个带有loxP位点、可切除的慢病毒载体持续表达4种因子，从外周血单个核细胞（PBMCs）生成人诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。新鲜采集或解冻后的PBMCs在含有抗坏血酸、SCF、IGF-1、IL-3和EPO的培养基中扩增培养9天10,11，随后用STEMCCA慢病毒感染。感染后将细胞接种至小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，约两周后可观察到类似胚胎干细胞（ESC）的克隆。最后，挑选出的克隆进一步扩增，并检测其多能性标志物SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达情况。该方案操作简便、稳定且重复性高，仅需4 ml易获取的血液样本即可可靠地生成人iPSCs。

我们展示了一种利用单个慢病毒载体从外周血单个核细胞（PBMCs）高效生成人诱导多能干细胞（iPSCs）的简单且有效的实验方案。图1A展示了该方案的示意图。血液被采集至含柠檬酸钠的BD Vacutainer CPT细胞分离管中，经离心后，单个核细胞可从聚酯凝胶与血浆之间的界面（即血沉棕黄层，buffy coat）收集（图1B）。分离得到的PBMCs随后在体外培养中扩增9天。图2比较了第0天与第9天的PBMCs，显示细胞已明显进入分裂状态。在使用STEMCCA慢病毒感染约10–15天后，可见少量明亮的小克隆出现，此时克隆形态尚不明确。加入人胚胎干细胞（hESC）培养基后，具有hESC样形态的克隆可被清晰识别（图2D）。部分此类克隆通过机械法挑选、扩增，并检测多能性标志物如SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达情况（图3）。通过采用短时间嘌呤霉素筛选策略6，我们能够稳定获得无外源基因整合的iPSC克隆，如图4</stron...

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4 ml外周血中生成人诱导多能干细胞（iPSC）。对易于获取的血细胞进行重编程，有望通过使iPSC技术惠及更广泛的研究群体，从而加速该技术的应用。

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

通过异位表达四种转录因子 Oct4、Klf4、Sox2 和 cMyc，可将人类体细胞重编程为多能状态，……

本方案展示了如何从四毫升外周血中高效地生成人诱导性多能干细胞。在第0天，从外周血样本中分离并扩增单个核细胞。使用重编程干细胞共载体转导原代细胞。第九天，将转导后的细胞接种到失活的小鼠胚胎成纤维细胞上，并培养约三周。挑选类似人类胚胎干细胞（HESC）的克隆集落进行扩增和鉴定。对多能性标志物如SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表达进行免疫荧光染色的结果如图所示。展示高效生成人诱导性多能干细胞的方法。利用干细胞抗病毒载体生成人诱导性多能干细胞相较于其他现有方法具有多项优势。其中最显著的优点在于该方法整体操作简便，仅需获取供体组织，具体而言，即容易获得的外周血样本。该方法最重要的属性是重编程的效率以及所获得的诱导多能干细胞克隆的质量。演示该实验操作的将是Andrea January Summer，我实验室的博士后研究员，以及Sarah Rozelle，George Murphy实验室的研究生。所有操作均在第0天进行。采集外周血4 mL，注入含柠檬酸钠的真空采血管中。在采血后2小时内轻轻倒置混匀8至10次。在室温下以1,800 G离心30分钟，收集单个核细胞。吸去血浆，用移液器取出位于凝胶屏障与血浆之间的血沉棕黄层（buffy coat）。将血沉棕黄层转移至一个无菌的15毫升锥形离心管中，并用无菌PBS调整总体积至10毫升。轻轻颠倒混匀数次，以300 ×g离心15分钟。将细胞沉淀重悬于10毫升无菌PBS中，进行细胞计数，然后将1×10⁶至2×10⁶个细胞转移至无菌的15毫升离心管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于2毫升扩增培养基中。随后将分离的单个核细胞接种至12孔板的一个孔中，在37°C和5%二氧化碳条件下培养。通过离心收集剩余细胞，并在第3天和第6天将每管约2×10⁶个细胞的冻存管置于含10% DMSO的FBS中冻存。将细胞转移至无菌的15毫升锥形管中，用1毫升QBSF 60干细胞培养基洗涤培养孔一次，以收集贴壁细胞。通过离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于2 mL em中。然后将细胞悬液转移至12孔板的一个孔中，并于第9天将培养物放回培养箱。将细胞转移至无菌的15 mL锥形管中，用1 mL QB SF 60干细胞培养基洗涤孔板一次，以收集贴壁细胞，随后在300 ×g下离心10分钟。接着，用 1 毫升新鲜 EM 培养基重悬细胞沉淀，其中加入终浓度为每毫升 5 微克的 polybrene 和 STEM 慢病毒，感染复数（MOI）为 1 至 10。然后将细胞悬液转移至 12 孔板中的一个孔内，在 25 摄氏度下以 2,250 转/分钟离心 90 分钟。再加入额外的 1 毫升含每毫升 5 微克 polybrene 的新鲜 EM 培养基，使终体积达到 2 毫升，并于第 10 天将培养板放入细胞培养孵箱中。在收获细胞后（如前所示），将细胞沉淀重悬于 2 毫升 EM 培养基中。将第 11 天时一个 12 孔板孔中的转导细胞接种至经 0.1% 明胶包被的 6 孔板中，每孔接种经灭活的小鼠胚胎成纤维细胞，密度为每孔 2 × 10⁵ 个细胞，使用甲基纤维素培养基。每种感染准备三个孔。第二天，收获转导的单个核细胞，方法如前所述。离心后，将细胞沉淀重悬于3 mL含有bFGF、抗坏血酸和生长因子的甲基纤维素培养基中。现在从MES板中吸弃培养基，每孔保留一毫升MCs的OFMs。然后每孔加入1.5毫升完全甲基纤维素培养基，将板在25摄氏度、500转/分钟条件下离心30分钟。随后从第14天开始，在37摄氏度、5%二氧化碳环境中培养两天。每隔一天补充一次培养基，加入 2.5 毫升含 10 纳克/毫升 bFGF 和 50 微克/毫升抗坏血酸的甲基纤维素培养基，但不含生长因子。大约第 20 天，当出现小克隆集落时，在第 30 至 40 天期间每天以 2 毫升人类胚胎干细胞培养基喂养细胞。挑取每个克隆集落，并转移至含有灭活小鼠胚胎成纤维细胞的 12 孔板中的单个孔，每孔加入 1 毫升人类胚胎干细胞培养基及 ROCK 抑制剂，每天喂养细胞。此后，使用一毫升不含ROCK抑制剂的HESC培养基，人单核细胞来源的多能干细胞即可用于多能性标志物的免疫荧光染色，以及整合型重编程载体的切除。在本实验流程中，细胞会经历从外周血单个核细胞（P BMCs）到人诱导多能干细胞（I PSCs）生成过程中的多种形态学变化。在第0天，从外周血分离的单个核细胞在扩增培养基中开始培养，培养9天后。观察到成簇的葡萄状细胞群，表明细胞在转导前状态良好且正在增殖。细胞接种到基质上约21天后，开始形成克隆。第30天时，诱导多能干细胞（iPSC）克隆呈现出典型的人胚胎干细胞样形态。该对从外周血单个核细胞（pbmc）生成的诱导性多能细胞（IPCs）进行的免疫荧光分析显示，这些细胞表达多能性标志物SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。这些诱导性多能干细胞（I PSCs）对碱性磷酸酶染色也呈阳性。这些图像展示了通过转染共表达CRE重组酶和嘌呤霉素抗性基因的质粒来生成无外源基因整合的IPCs的步骤（如Summers等，2010年所述）。与转染前的IPCs相比，可观察到细胞死亡现象。经过两天的嘌呤霉素筛选后，转染约10天后，抗性细胞中开始出现新的克隆。对所选克隆进行Southern印迹分析，可确认转基因的切除情况。第1、3、5和7泳道显示在切除前iPSC克隆中存在转基因，而在切除转基因后，第2、4、6和8泳道中这些条带消失。观看本视频后，您应能够从小量外周血样本中稳定且高效地生成高质量的正常人iPS细胞或疾病特异性人iPS细胞，适用于任何个体。该方法简化了重编程操作流程，使其可被干细胞研究领域广泛采用；同时为生成更均一的干细胞系群体提供了基础标准。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

代人类诱导多能干细胞从外周血中使用STEMCCA慢病毒载体

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。...

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。...

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。...

使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

学习使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞的方法。该方案通过单病毒载体简化重编程流程，提高iPSC技术的可及性，适用于再生医学研究。

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

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