使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本方案展示了如何从四毫升外周血中高效地生成人诱导性多能干细胞。在第0天，从外周血样本中分离并扩增单个核细胞。使用重编程干细胞共载体转导原代细胞。

第九天，将转导后的细胞接种到失活的小鼠胚胎成纤维细胞上，并培养约三周。挑选类似人类胚胎干细胞（HESC）的克隆集落进行扩增和鉴定。对多能性标志物如SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表达进行免疫荧光染色的结果如图所示。

展示高效生成人诱导性多能干细胞的方法。利用干细胞抗病毒载体生成人诱导性多能干细胞相较于其他现有方法具有多项优势。其中最显著的优点在于该方法整体操作简便，仅需获取供体组织，具体而言，即容易获得的外周血样本。

该方法最重要的属性是重编程的效率以及所获得的诱导多能干细胞克隆的质量。演示该实验操作的将是Andrea January Summer，我实验室的博士后研究员，以及Sarah Rozelle，George Murphy实验室的研究生。所有操作均在第0天进行。

采集外周血4 mL，注入含柠檬酸钠的真空采血管中。在采血后2小时内轻轻倒置混匀8至10次。在室温下以1,800 G离心30分钟，收集单个核细胞。

吸去血浆，用移液器取出位于凝胶屏障与血浆之间的血沉棕黄层（buffy coat）。将血沉棕黄层转移至一个无菌的15毫升锥形离心管中，并用无菌PBS调整总体积至10毫升。轻轻颠倒混匀数次，以300 ×g离心15分钟。

将细胞沉淀重悬于10毫升无菌PBS中，进行细胞计数，然后将1×10⁶至2×10⁶个细胞转移至无菌的15毫升离心管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于2毫升扩增培养基中。随后将分离的单个核细胞接种至12孔板的一个孔中，在37°C和5%二氧化碳条件下培养。

通过离心收集剩余细胞，并在第3天和第6天将每管约2×10⁶个细胞的冻存管置于含10% DMSO的FBS中冻存。将细胞转移至无菌的15毫升锥形管中，用1毫升QBSF 60干细胞培养基洗涤培养孔一次，以收集贴壁细胞。

通过离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于2 mL em中。然后将细胞悬液转移至12孔板的一个孔中，并于第9天将培养物放回培养箱。将细胞转移至无菌的15 mL锥形管中，用1 mL QB SF 60干细胞培养基洗涤孔板一次，以收集贴壁细胞，随后在300 ×g下离心10分钟。

接着，用 1 毫升新鲜 EM 培养基重悬细胞沉淀，其中加入终浓度为每毫升 5 微克的 polybrene 和 STEM 慢病毒，感染复数（MOI）为 1 至 10。然后将细胞悬液转移至 12 孔板中的一个孔内，在 25 摄氏度下以 2,250 转/分钟离心 90 分钟。再加入额外的 1 毫升含每毫升 5 微克 polybrene 的新鲜 EM 培养基，使终体积达到 2 毫升，并于第 10 天将培养板放入细胞培养孵箱中。

在收获细胞后（如前所示），将细胞沉淀重悬于 2 毫升 EM 培养基中。将第 11 天时一个 12 孔板孔中的转导细胞接种至经 0.1% 明胶包被的 6 孔板中，每孔接种经灭活的小鼠胚胎成纤维细胞，密度为每孔 2 × 10⁵ 个细胞，使用甲基纤维素培养基。每种感染准备三个孔。

第二天，收获转导的单个核细胞，方法如前所述。离心后，将细胞沉淀重悬于3 mL含有bFGF、抗坏血酸和生长因子的甲基纤维素培养基中。

现在从MES板中吸弃培养基，每孔保留一毫升MCs的OFMs。然后每孔加入1.5毫升完全甲基纤维素培养基，将板在25摄氏度、500转/分钟条件下离心30分钟。随后从第14天开始，在37摄氏度、5%二氧化碳环境中培养两天。

每隔一天补充一次培养基，加入 2.5 毫升含 10 纳克/毫升 bFGF 和 50 微克/毫升抗坏血酸的甲基纤维素培养基，但不含生长因子。大约第 20 天，当出现小克隆集落时，在第 30 至 40 天期间每天以 2 毫升人类胚胎干细胞培养基喂养细胞。挑取每个克隆集落，并转移至含有灭活小鼠胚胎成纤维细胞的 12 孔板中的单个孔，每孔加入 1 毫升人类胚胎干细胞培养基及 ROCK 抑制剂，每天喂养细胞。

此后，使用一毫升不含ROCK抑制剂的HESC培养基，人单核细胞来源的多能干细胞即可用于多能性标志物的免疫荧光染色，以及整合型重编程载体的切除。在本实验流程中，细胞会经历从外周血单个核细胞（P BMCs）到人诱导多能干细胞（I PSCs）生成过程中的多种形态学变化。在第0天，从外周血分离的单个核细胞在扩增培养基中开始培养，培养9天后。

观察到成簇的葡萄状细胞群，表明细胞在转导前状态良好且正在增殖。细胞接种到基质上约21天后，开始形成克隆。第30天时，诱导多能干细胞（iPSC）克隆呈现出典型的人胚胎干细胞样形态。

该对从外周血单个核细胞（pbmc）生成的诱导性多能细胞（IPCs）进行的免疫荧光分析显示，这些细胞表达多能性标志物SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。这些诱导性多能干细胞（I PSCs）对碱性磷酸酶染色也呈阳性。这些图像展示了通过转染共表达CRE重组酶和嘌呤霉素抗性基因的质粒来生成无外源基因整合的IPCs的步骤（如Summers等，2010年所述）。与转染前的IPCs相比，可观察到细胞死亡现象。

经过两天的嘌呤霉素筛选后，转染约10天后，抗性细胞中开始出现新的克隆。对所选克隆进行Southern印迹分析，可确认转基因的切除情况。第1、3、5和7泳道显示在切除前iPSC克隆中存在转基因，而在切除转基因后，第2、4、6和8泳道中这些条带消失。观看本视频后，您应能够从小量外周血样本中稳定且高效地生成高质量的正常人iPS细胞或疾病特异性人iPS细胞，适用于任何个体。

该方法简化了重编程操作流程，使其可被干细胞研究领域广泛采用；同时为生成更均一的干细胞系群体提供了基础标准。