Name: 同时脑电图，实时测量的啮齿动物的大脑皮质中的神经元活动的乳酸浓度与Optogenetic的操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习在自由行为小鼠中结合光遗传学操作与实时脑电图、肌电图及脑乳酸浓度监测的技术。该方法可在自然睡眠觉醒周期中精确操控神经元活动并同步记录多模态神经信号。

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本研究由美国国防部（国防高级研究计划局青年教员奖，资助号 N66001-09-1-2117）和美国国家神经疾病与卒中研究所（R15NS070734）资助。

1. 动物的手术准备
1. 实验对象
使用B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/eYFP)18Gfng/J转基因品系小鼠9（JAX品系#7612）或其他在大脑皮层神经元中表达对蓝光敏感的阳离子通道——光敏通道蛋白-2（Channelrhodopsin-2）的小鼠。对B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/eYFP)18Gfng/J转基因品系小鼠的大脑皮层施加蓝光，可导致表达光敏通道蛋白-2的锥体神经元去极化并产生动作电位9,10。由于锥体细胞被激活，局部中间神经元也随之激活，电位变化可传播至刺激部位以外的神经元10。手术应在无菌条件下进行，并遵守适用的监管指南：手术器械和软包装材料（手术巾、纱布垫）需经高压灭菌；所有耐热的植入金属器件（套管、螺钉和导线）需用高温灭菌珠处理30秒；对不耐热的可植入器件（光纤电缆、塑料连接器）用乙醇浸泡消毒10秒；使用罐装空气吹干经乙醇浸泡的物品。
2. 麻醉、立体定位放置与颅骨清除
使用 IMPAC6 集成式多动物麻醉系统（Vet Equip Inc）对小鼠进行麻醉。诱导时使用 5% 异氟烷/95% 氧气，术中维持使用 3% 异氟烷/97% 氧气。将动物置于设定为 37 °C 的循环水毯上。若水毯温度保持在此设定值，则无需额外监测体温。
3. 植入前颅骨的准备
通过剃除颅骨顶部的所有毛发来准备切口部位。剃毛区域应从耳至耳横向延伸，从前至后则从眼睛延伸至颅骨后端。用聚维酮碘连续擦拭三次，再用乙醇擦拭，对暴露的皮肤进行消毒。在颅骨顶部做一正中切口，从两眼之间延伸至颅骨后部。用过氧化氢和无菌生理盐水（0.9% NaCl）清洁颅骨。使用电灼工具控制出血。定位并标记前囟和后囟，以确定立体定位坐标。我们所使用的电极/光遗传刺激装置的立体定位坐标见表1，并以示意图形式展示于图1A中。
4. 颅骨植入位点的准备
使用高速牙科钻和0.5 mm球形钻头在颅骨上建立每个植入位点。使用0.7 mm球形钻头对每个孔的外缘进行倒角，以方便螺钉插入。
5. 插入并固定套管、肌电图导联和脑电图导联
将脑电图螺钉（长度为 0.8 mm，螺钉头部预先焊有 2 cm 未绝缘的 30 号镀锡铜总线）插入孔中，并使用带槽口的手动螺丝刀旋转约 4-5 圈，以达到所需深度。使用立体定位套管夹持器固定引导套管，然后用丙烯酸树脂水泥将其固定在颅骨和锚钉上。每个引导套管在手术时至实验前（10-14 天）均应插入假套管/芯棒（Plastics One，货号 # C312 DC\1），以保持通畅。
6. 关闭手术切口
将脑电图电极（EEG）和引导套管固定于颅骨上后，使用牙科丙烯酸树脂水泥（Lang Dental - Ortho-Jet 水泥）将它们粘合在一起。待水泥凝固后，将塑料连接器（Pinnacle Technology 部件号 #8402）置于已干燥的水泥堆上方。将来自脑电图导线的金属丝末端焊接到塑料连接器的触点上，并用水泥包裹导线引线。然后，将肌电图（EMG）导线穿过颈后肌肉，方法是将其滑入已刺穿肌肉的21号针头套管中。在导线刚离开肌肉的远端位置，用5-0尼龙缝线打双重外科结固定。使用反向切割P-3针头和5-0尼龙缝线，通过单个间断外科结缝合先前为暴露肌肉组织而牵开的皮肤。
7. 术后镇痛与恢复
手术后立即皮下注射布托啡诺作为镇痛剂（0.1 mg/kg）和美洛昔康作为抗炎药（0.1 mg/kg），并在术后第1至第2天每天给药一次。实验动物需在标准饲养条件下恢复至少七天后方可进行实验。在仅维持标准饲养条件而无额外护理的情况下，只要留置导丝保持原位，导管可保持通畅至少两周。脑电图（EEG）和肌电图（EMG）传感器在此期间内也可保持正常功能。
2. 产生定时光脉冲
1. MC 刺激单元的编程
通过 USB 连接将 MC-Stimulus 单元（Multi-Channel Systems）连接至台式计算机。使用类似电子表格的 MC-Stimulus 用户界面来编程 MC-Stimulus 单元。输入刺激开启时段所需的 TTL（晶体管-晶体管逻辑）电压、刺激开启和关闭时段的持续时间、每秒所需的循环次数，以及整个刺激过程的总重复循环次数。更多详细信息请参见 MC-Stimulus 技术手册：
<a href="http://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/STG4002_Manual.pdf" target="_blank">http://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/STG4002_Manual.pdf</a>
3. 用于向大脑皮层递送光的光纤探针的制造/组装
<ol>
	<li>所需材料和设备请见：<a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a></li>
	<li>光纤电缆的切割与抛光。<a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a></li>
</ol>
4. 啮齿类动物光遗传刺激系统的组装
1. MC-刺激单元与激光器的接口
当MC-Stimulus单元编程完成后，将其作为独立的信号发生器运行，输出5伏特的二进制开关信号。使用BNC连接器将MC-Stimulus单元连接至激光器的TTL使能电源单元。
2. 通过光纤电缆产生激光输出
使用激光功率单元的数字显示屏和可变功率输出旋钮，手动调节激光的输出功率。通过带状电缆将激光功率单元连接至激光器。将激光器上的雌性FC（套管连接器）光纤适配器连接到光纤跳线的雄性FC连接器上（光纤跳线长度为3米，由反光丙烯酸酯聚合物包层包裹的直径为200 μm的玻璃导光纤维）。
3. 将激光传递至动物：旋转连接器
将起始端光纤线缆（长度为 3 m）和递送端光纤线缆（长度为 45 cm）连接至光学旋转接头相对两端，该接头内封装有两个准直透镜（Doric 透镜）。光纤旋转接头起到换向器的作用：当动物在饲养笼内活动时，旋转接头可随之转动，从而防止光纤线缆断裂。使用塑料扎带将换向器固定在位于动物饲养圆筒笼上方的金属支架上。
4. 将递送光纤电缆连接到头部
用一只手将小鼠固定在手掌下，以限制其活动。将小鼠头部置于实验者中指与食指之间。取下为光纤套管预留的引导套管中的假性套管。使用无菌的25号针头清除引导套管内的碎屑。用手插入光纤线缆，并使用从假性套管上取下的螺纹螺帽将其固定在光纤引导套管上。通过在光纤线缆上距离平切末端固定距离处打结的缝合线结来控制光纤线缆插入脑内的深度。整个实验装置如图1B所示。
5. 光遗传学刺激期间基于脑电图定义的睡眠与乳酸浓度的测量
1. 乳酸传感器的预校准
乳酸传感器的预校准通过以下步骤进行 体外 试剂盒（Pinnacle Technology 货号 # 7000-K1-T）。将传感器置于磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中平衡，然后根据制造商的操作规程，依次暴露于三种不同浓度的 L-乳酸中。
2. 插入乳酸传感器和脑电图电缆
将预校准的传感器以与插入光纤插件（第4.4节）相同的方式插入颅骨固定的乳酸引导套管中。使用双极插头连接器将乳酸传感器连接到Pinnacle 8,400生物传感器的前置放大器。将该前置放大器连接至手术植入的头帽上的8针连接器。
3. 建立光遗传学刺激强度
在采集数据之前，使用激光强度控制旋钮调节光遗传学刺激的强度。由于尚未系统研究的因素，不同动物的脑电图（EEG）反应幅度会有所差异，因此必须在刺激开始时通过视觉检查确认。实践中，通常将强度设置在80–120 μWatts范围内，可在刺激频率下使EEG幅度增加约50%。需要进行事后快速傅里叶变换分析（见第5.5节），以量化反应的绝对幅度。
4. 数据采集
使用 Pinnacle 8400 系统采集数据：<a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html</a>。
5. 使用 Neuroscore 进行数据处理
使用 Neuroscore 界面（DataSciences International：<a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a>）或 Sirenia 界面（Pinnacle Technology：<a href="http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target="_blank">http://www.pinnaclet.com/sirenia.html</a>）通过目视检查脑电图（EEG）和肌电图（EMG）数据来分类睡眠状态。根据 EEG 和 EMG 将数据以每10秒为一个时段划分为清醒、非快速眼动睡眠或快速眼动睡眠。将数据保存为 Microsoft Excel 电子表格，以便进行进一步分析和统计检验。

<ol><li>Magistretti, P. Brain Energy Metabolism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+P+%22Fundamental+Neuroscience%22">Fundamental Neuroscience</a>. Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. , Academic Press. New York. 389-413 (1999).</li>
<li>Maquet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+glucose+utilization+during+sleep-wake+cycle+in+man+determined+by+positron+emission+tomography+and+%5B18F%5D2-fluoro-2-deoxy-D-glucose+method%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method.</a> Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).</li>
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<li>Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortically-induced+coherence+of+a+thalamic-generated+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation.</a> Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).</li>
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<li>Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+head-mountable+LED+device+for+chronic+stimulation+of+optogenetic+molecules+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice.</a> Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的方法使得人们能够在前所未有的时间尺度上测量睡眠与脑内糖酵解中间产物乳酸浓度变化之间的关系。动物会自发地在清醒、非快速眼动睡眠（NREMS）和快速眼动睡眠（REMS）之间转换。此外，我们能够在动物发生这些状态转换时施加光遗传学刺激。迄今为止收集的数据表明，无论是自发的还是诱导产生的脑状态波动，均会影响基于乳酸氧化酶的生物传感器的检测信号。
可以使用其他来源的设备和软件构建类似于本文所述的实验系统。适用于啮齿类动物的多导睡眠图系统的其他来源包括 Data Sciences International11 和 Embla12。用于睡眠状态分类的软件可从 Somnologica12、Sleep Sign13 和 Icelus14 获得。用于乳酸检测的安培型生物传感器可从 Quanteon15 获得。据我们所知，Pinnacle Technology 是唯一提供可通过单一软件界面同时测量生物传感器、脑电图（EEG）和肌电图（EMG）系统的厂商。</p...

<table><tbody><tr><td>BASi 小鼠导向套管</td><td>Pinnacle Technology/BASi 公司</td><td>7032</td><td></td></tr><tr><td>乳酸生物传感器</td><td>Pinnacle Technology</td><td>7004</td><td></td></tr><tr><td>头部固定装置</td><td>Pinnacle Technology</td><td>8402</td><td></td></tr><tr><td>睡眠/生物传感器记录系统</td><td>Pinnacle Technology</td><td>8400-K1-SL</td><td>2个脑电图通道，1个肌电图通道 &amp;和 1 个生物传感器</td></tr><tr><td>小鼠离体固定校准试剂盒</td><td>Pinnacle Technology</td><td>7000-K1-T</td><td></td></tr><tr><td>光纤导管套管</td><td>Plastics One</td><td>C312G</td><td>21 号导引套管针</td></tr><tr><td>假导管</td><td>Plastics One</td><td>C312DC</td><td>21 号假针</td></tr><tr><td>金刚石光纤刻划笔</td><td>Thorlabs</td><td>S90W</td><td></td></tr><tr><td>光纤连接器压接工具</td><td>Thorlabs</td><td>CT042</td><td></td></tr><tr><td>分叉导管</td><td>Thorlabs</td><td>FT030</td><td>03.0 mm</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td>最大直径 0.012</td></tr><tr><td>分叉管剥离器</td><td>Thorlabs</td><td>FTS3</td><td></td></tr><tr><td>裸露硬包层多模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &amp;mu;m 核心，0.37 数值孔径</td></tr><tr><td>剪线钳/凯夫拉剪</td><td>Thorlabs</td><td>T865</td><td></td></tr><tr><td>光纤环氧树脂</td><td>Thorlabs</td><td>F112</td><td></td></tr><tr><td>光纤剥线工具</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃抛光板</td><td>Thorlabs</td><td>CTG913</td><td></td></tr><tr><td>橡胶抛光垫</td><td>Thorlabs</td><td>NRS913</td><td></td></tr><tr><td>眼用放大镜</td><td>Thorlabs</td><td>JEL10</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Thorlabs</td><td>KW32</td><td></td></tr><tr><td>压缩空气</td><td>Thorlabs</td><td>CA3</td><td></td></tr><tr><td>抛光夹具</td><td>Thorlabs</td><td>D50-xx</td><td></td></tr><tr><td>光纤检测显微镜</td><td>Thorlabs</td><td>CL-200</td><td></td></tr><tr><td>抛光薄膜</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC连接器端面</td><td>Thorlabs</td><td>30126G2-240</td><td>240 &amp;mu;m Bore，不锈钢卡套</td></tr><tr><td>MC 刺激单元</td><td>多通道系统</td><td>STG-4002</td><td></td></tr><tr><td>MC 刺激软件</td><td>多通道系统</td><td>MC-Stimulus V 2.1.5</td><td></td></tr><tr><td>蓝光激光器</td><td>CrystaLaser</td><td>CL473-050-0</td><td></td></tr><tr><td>激光电源</td><td>CrystaLaser</td><td>CL2005</td><td></td></tr><tr><td>光纤旋转接头</td><td>Doric Lenses</td><td>FRJ-v4</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表2. &lt;/strong&gt; 耗材与设备。</td></tr></tbody></table>

同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

尽管大脑的质量不足人体总质量的5%，但在静息状态下，其消耗的葡萄糖约占全身消耗总量的四分之一1。非快速眼动睡眠（NREMS）是睡眠中所占时间最长的阶段，其功能尚不明确。然而，NREMS的一个显著特征是大脑葡萄糖利用率相较于清醒状态显著降低2-4。这一现象及其他研究结果促使人们普遍认为，睡眠具有与大脑代谢相关的重要功能。然而，NREMS期间大脑葡萄糖代谢率下降的潜在机制仍有待阐明。
	与非快速眼动睡眠（NREMS）相关的一个可能影响脑代谢率的现象是慢波的出现，即脑电图中频率低于4 Hz的振荡5,6。在颅骨或大脑皮层表面检测到的这些慢波反映了底层神经元在去极化/上状态与超极化/下状态之间的振荡7。在下状态期间，细胞在长达数百毫秒的时间内不产生动作电位。动作电位之后离子浓度梯度的恢复对细胞构成了显著的代谢负担8；与NREMS相关的下状态期间动作电位的缺失可能有助于相对于清醒状态降低代谢水平。
	为了验证这一假设关系，必须解决两个技术难题。首先，需要以能够反映脑电图（EEG）动态变化的时间分辨率（即以秒为单位，而非分钟）来测量大脑糖酵解代谢。为此，我们检测了乳酸浓度，乳酸是需氧糖酵解的产物，因此可作为小鼠脑组织中葡萄糖代谢速率的指标。乳酸的测量采用基于乳酸氧化酶的实时传感器，该传感器嵌入于前额叶皮层。传感器的检测机制由一根铂-铱电极构成，其周围包裹着一层乳酸氧化酶分子。乳酸在乳酸氧化酶的作用下代谢生成过氧化氢，后者在铂-铱电极上产生电流。因此，当脑部糖酵解增强时，乳酸氧化酶的底物浓度随之升高，从而导致检测电极上的电流增加。此外，还需要在调控大脑皮层兴奋性的条件下同步测量这些变量，以便将该变量从非快速眼动睡眠（NREMS）的其他方面中分离出来。
	我们设计了一种实验系统，可同时通过脑电图测量神经元活动，通过乳酸生物传感器测量糖酵解通量，并通过光遗传学激活锥体神经元来调控大脑皮层神经元活动。我们已利用该系统记录了与睡眠相关的脑电图波形与大脑皮层乳酸浓度瞬时动态之间的关系。该方案可能对任何希望在自由活动的啮齿类动物中研究脑电图水平测得的神经元活动与脑内细胞能量代谢之间关系的研究人员具有参考价值。

如图所示 图2, 一只配备光遗传学刺激及乳酸/脑电图（EEG）/肌电图（EMG）数据采集装置的小鼠在持续监测脑电图、肌电图和脑内乳酸浓度的同时，经历了自发的睡眠-觉醒状态转换。乳酸传感器电流在低幅脑电图期间升高，在高幅脑电图期间下降。如图所示 图3脑电图的两个通道均对前额叶皮层施加的光遗传学刺激有反应。
<img alt="神经科学中光遗传学刺激的手术准备布局及实验系统示意图。" src="/files/ftp_upload/4328/4328fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图1. A) 脑电图（EEG）电极、乳酸传感器及用于光遗传学刺激的套管在手术植入后的示意图。B) 整个实验系统的示意图。1，脑电图导联1；2，脑电图导联2；Gnd，脑电图接地螺钉；Ref，脑电图参考螺钉。<a...

本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially available（商业可获取）。

尽管大脑的质量不足体重的5%，但在静息状态下，其消耗的葡萄糖约占全身葡萄糖消耗量的四分之一¹。

本实验的总体目标是在精确的立体定位坐标处进行光遗传学刺激的同时，测量脑电图定义的睡眠状态和乳酸浓度。手术植入必要的脑电图电极以及用于乳酸传感器和光纤的套管，然后将光纤和预先校准的乳酸传感器插入动物颅骨中的引导套管内。接下来，调整蓝光刺激强度以获得所需的电生理反应。然后在动物自由活动或睡眠时，采集脑电图、肌电图和乳酸浓度数据。与其他方法（如脑电图的药理学研究）相比，该实验方法的优势在于能够在亚秒级时间尺度上实时操控神经元活动的同时，监测大脑的生物化学和电生理活动。因此，该研究在睡眠领域产生新见解的潜力很高。例如，可以识别慢波睡眠的代谢和电生理伴随现象。此类实验还可应用于神经科学的其他领域，如学习与记忆、突触可塑性或癫痫类疾病。该手术技术在操作上具有较高难度，需要具备良好的灵巧性，而这种能力可以通过练习来获得。在本视频演示中，我将逐步展示一些复杂手术操作的关键步骤，以补充文字描述。动物从手术中恢复后，挑战在于如何正确插入乳酸传感器和光纤电缆。Jonathan 和我将演示在固定动物时如何用力得当，以插入这两种精密设备。最后，我们将展示如何通过实时调整刺激强度来优化脑电图（EEG）反应。本实验使用表达对蓝光敏感的阳离子通道的转基因小鼠。该通道在大脑皮层神经元中表达。首先使用5%异氟烷和95%氧气进行诱导麻醉，随后以3%异氟烷和97%氧气维持麻醉状态。从两眼之间沿颅骨顶部向后做一正中切口。用过氧化氢和无菌生理盐水清洁颅骨。定位并标记B点和Lambda点，以确定立体定位坐标，用于电极光遗传刺激装置的定位。先用高速牙科钻配合0.5毫米球形钻头预钻固定螺钉孔，再用0.7毫米球形钻头扩大钻孔。使用带槽口的手动螺丝刀将电极螺钉旋入孔中，旋转约四到五圈，以达到所需的深度。用立体定位套管固定引导套管的位置，然后使用丙烯酸树脂水泥将其固定在颅骨和锚点上。为保持通畅，每个引导套管从手术时至实验开始前均应内置留置套管或金属芯。将脑电图电极（EEGs）和引导套管定位在颅骨中后，用一层薄薄的牙科丙烯酸水泥将它们固定在一起。待水泥凝固后，将塑料连接器置于干燥的水泥堆上方，将来自脑电图导线末端的导线连接至塑料连接器上的触点，以防导线被水泥覆盖。然后，将肌电图导线穿过核肌，方法是将其滑入一支21号针头的针管内进行引导。穿过肌肉，在导线穿出肌肉处的远端，用5-0尼龙缝线围绕这些导线打一个双外科结。使用反向切割P-3针和5-0尼龙缝线，以间断单个外科结的方式将为暴露肌肉组织而牵开的皮肤重新缝合。待MC刺激仪程序设置完成后，将其作为独立信号发生器运行，输出5伏特的二进制开关信号。使用BNC连接器将MC刺激仪连接至激光器的TTL使能电源单元。通过带状电缆将激光电源单元连接至激光器。同时将激光器连接到起始光纤跳线的公头FC接头。将起始光纤连接至旋转接头。换向光纤旋转接头起到换向作用。当动物在笼内活动时，旋转接头随之转动，以防止光纤电缆因旋转扭矩而断裂。使用塑料扎带将换向器固定在动物所处圆柱形笼子上方的金属支架上。用一只手将小鼠固定在手掌下，以限制其活动。将小鼠头部置于实验者中指与食指之间。随后使用无菌的25号针头清除导管套管内的碎屑。然后用手插入光纤，并用带螺纹的螺帽将其固定在光纤导向套管上。通过在光纤上距离平整切割末端固定距离处打结的缝合线结来控制光纤插入脑内的深度。传感器在磷酸盐缓冲液中进行平衡，并依次暴露于三种不同浓度的L-乳酸溶液中。根据制造商的操作规程，将预先校准的传感器以与插入光纤电缆相同的方式插入颅骨固定的乳酸引导套管中。使用双极插头连接器将乳酸传感器连接到Pinnacle 8,400生物传感器的前置放大器。然后将该前置放大器连接到手术植入的头帽上的八针连接器。在采集数据之前，使用激光强度控制旋钮调节光遗传学刺激的强度。由于尚未系统研究的因素，不同动物的脑电图（EEG）反应幅度会有所差异。因此，有必要调节光遗传学刺激的强度，并在达到理想反应时确认脑电图反应是否充分。使用 Pinnacle 8, 400 系统结合神经评分采集数据。通过 SEIA 接口对脑电图（EEG）和肌电图（EMG）数据进行目视检查，以分类睡眠状态。根据 EEG 和 EMG 数据，将每十秒时间段内的数据分为清醒、非快速眼动睡眠或快速眼动睡眠。该生物传感器光遗传学刺激配置显示了手术植入的脑电图电极、乳酸传感器以及用于光遗传学刺激的套管。在无光遗传学刺激的情况下，该小鼠经历了自发性睡眠。在持续监测脑电图-肌电图（E-E-G-E-M-G）和脑内乳酸浓度的同时，记录了清醒状态与两种睡眠亚型之间的状态转换。根据脑电图（EEG）和肌电图（EMG）来定义快速眼动睡眠和非快速眼动睡眠。有趣的是，乳酸生物传感器电流随低幅值脑电图信号升高而上升，随高幅值脑电图信号升高而下降。脑电图的两个通道均对前额叶皮层施加的光遗传学刺激有响应。观看本视频后，您应充分掌握如何对小鼠进行手术，以实现光遗传学操控与脑电图、肌电图及脑内乳酸浓度的同步测量。一旦熟练掌握，该手术技术可在90至120分钟内规范完成。请务必持续监测动物的呼吸情况，以此作为评估麻醉深度的指标。如果动物呼吸频率低于每四到五秒一次，麻醉可能过深；如果呼吸频率高于每两秒一次，麻醉可能过浅。使用气体麻醉剂异氟烷时，请务必采取适当的安全防护措施。确保手术室具有足够的通风，以保护您的视网膜免受光遗传刺激所用激光的伤害。应佩戴防护护目镜，或将动物置于避光柜中。您需要在完全清醒的小鼠身上练习乳酸生物传感器和光纤电缆的植入。小鼠无法主动配合这些操作，必须进行固定。然而，固定方式不可过于用力，以免损伤动物或妨碍其呼吸。

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