同时脑电图，实时测量的啮齿动物的大脑皮质中的神经元活动的乳酸浓度与Optogenetic的操作

该程序的总体目标是在精确的立体定位坐标下测量光遗传学刺激期间 EEG 定义的睡眠和乳酸浓度。通过手术植入乳酸传感器和光纤电缆所需的脑电图导线和套管。然后将光纤电缆和预先校准的乳酸传感器插入动物头骨的导向套管中。

接下来，调整蓝光刺激强度以达到所需的电生理反应。然后继续收集脑电图、肌电图和乳酸浓度数据，同时允许动物自发行为和/或睡眠。与脑电图药理学研究等其他方法相比，这种实验方法具有监测大脑生物化学和电生理学的优势，同时在亚秒级时间尺度上实时纵神经元的活动。

因此，为睡眠研究领域产生新见解的潜力很高。例如，人们可以识别慢波睡眠的代谢和电生理伴随物。这种类型的实验也可以应用于神经科学的其他领域，例如学习和记忆、突触可塑性或癫痫症。

手术技术在技术上具有挑战性。它需要大量的灵巧性，但这可以通过练习来实现。在这个视觉演示中，我将迭代一些复杂外科手术的关键步骤，这些步骤将与书面描述相辅

一旦动物从手术中恢复过来，面临的挑战是正确插入乳酸传感器和光纤电缆。乔纳森和我将演示如何在约束动物时用一只结实的手插入这两个精致的设备。最后，我们将展示如何通过实时调整刺激的强度来优化 EEG 响应。

在本实验中，使用表达蓝光敏感阳离子通道的转基因小鼠。通道在大脑皮层神经元中采用两个。首先使用 5% isof 氟、95% 氧气麻醉小鼠进行诱导，同时用 3%isof 氟、97% 氧气维持麻醉。

在颅骨顶部从眼睛之间到颅骨后部做一个内侧切口。用过氧化氢和无菌盐水清洁颅骨。定位并标记 B 和 Lambda，用于确定电极光遗传学刺激配置的立体定位坐标，使用带有 0.5 毫米球头钻头和 0.7 毫米球头钻头的高速牙钻打底螺丝孔。

用一字手拧刀将电极 kelo gram 螺钉插入孔中。以大约 4 到 5 圈的速度驱动它们以获得所需的深度。用立体定位套管将导向套管固定到位，然后用丙烯酸水泥将它们固定在颅骨和锚上为了保持通畅，从手术到实验时，每个导向套管都应包含一个虚拟套管或管心针。

将脑电图和引导套管放置在颅骨中后，用一层薄薄的牙科丙烯酸水泥将它们粘合在一起。水泥组后，将塑料连接器放置在干燥的水泥堆上方，该水泥堆位于从 EEG 导线发出的电线末端出售，以防电线进入水泥。然后通过将肌电图线滑入 21 号针头的枪管中，将它们穿过核肌。

穿过肌肉，在这些电线周围打一个双外科医生结，一个 5 零尼龙缝合线，就在它们离开肌合线的远端，将缩回以进入肌肉组织的皮肤重新合在一起，使用反向切割 P 三针和五零尼龙缝合线。对 mc 激励单元进行编程后，将其作为独立信号发生器作为 5 伏二进制开关信号运行。将 mc 刺激装置连接到带有 BNC 连接器的激光器的启用 TTL 的功率装置。

通过带状电缆将激光功率单元连接到激光器。此外，将激光器连接到原始光纤跳线上的公 FC 连接器。将原始光纤电缆连接到旋转接头。

换向器 光纤旋转接头用作换向器。当动物在笼子里移动时，旋转接头会旋转，以防止光纤电缆因旋转扭矩而断裂。用塑料电缆扎带将换向器固定在放置在容纳动物的圆柱形笼子上方的金属支架上。

用一只手将鼠标固定在杯状手掌下，以约束鼠标。将头部定位在实验者的中指和食指之间。现在使用无菌 25 号针头清除导管上的碎屑、碎屑。

然后用手插入光缆，并用螺纹螺帽将其固定到光纤导管套管上。通过在距平坦劈裂端固定距离的光缆上打一个缝合结来控制光缆在大脑中的插入深度。该传感器等同于磷酸盐缓冲盐水，并以逐步方式暴露于三种浓度的乳酸 L 中。

根据制造商协议，以与光缆插入程序相同的方式将预先校准的传感器插入安装在颅骨上的乳酸导向套管中。将乳酸传感器连接到带有双极插头连接器的 pinnacle 8， 400 生物传感器的前置放大器。然后将此前置放大器连接到手术植入的头戴式支架上的 8 针连接器。

在收集数据之前，使用激光强度控制旋钮调整光遗传学刺激的强度。由于尚未系统研究的因素，脑电图反应的幅度会因动物而异。因此，有必要调整光遗传学刺激的强度，并在达到所需响应时验证脑电图反应是否足够。

使用 Pinnacle 8， 400 系统收集数据，并进行神经评分。SEIA 接口通过目视检查脑电图和肌电图数据处理来对睡眠状态进行分类。根据 EEG 和 EMG 的 10 秒 epoch 中的数据，如觉醒非快速眼动、睡眠或快速眼动睡眠。

这种生物传感器光遗传学刺激配置显示了手术植入的 EEG 电极、乳酸传感器和用于光遗传学刺激的套管。在没有光遗传学刺激的情况下，这只小鼠经历了自发睡眠。觉醒状态转换，同时连续监测 E-E-G-E-M-G 和脑乳酸浓度，觉醒和两种睡眠亚型。

快速眼动和非快速眼动是根据 EEG 和 EMG 定义的。有趣的是，乳酸生物传感器电流随低振幅 EEG 的函数而上升，而随着高振幅 EEG 的函数而下降。脑电图的两个通道都对额叶皮层中传递的光遗传学刺激有反应。

看完这个视频，你应该对如何通过手术植入小鼠进行同步光遗传学作和测量大脑中的脑电图、肌电图和乳酸浓度有一个很好的了解。一旦掌握，这种手术技术可以在 90 到 120 分钟内正确进行。请记住持续监测动物的呼吸作为麻醉深度的衡量标准。

如果动物的呼吸频率低于每 4 到 5 秒一次，则麻醉可能太深。如果动物的呼吸频率超过每两秒一次，则麻醉可能太轻。请记住在使用氟的气体麻醉剂时采取适当的安全预防措施。

确保手术室内有足够的通风，以保护您的视网膜免受用于光遗传学刺激的激光的伤害。要么戴上护目镜，要么将动物关在避光柜中。您需要练习将乳酸生物传感器和光纤电缆植入完全清醒的鼠标中。

小鼠不遵守这些程序，必须固定。但是，约束装置不能用力到伤害动物或阻止呼吸。