Name: 病变资源管理器:一个视频引导，标准化为老年痴呆症准确，可靠的MRI衍生Volumetrics和正常老年人协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-14T16:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 了解Lesion Explorer半自动化图像处理流程，用于分析阿尔茨海默病和正常衰老中的脑组织与高信号病变。该标准化方案通过MRI体积测量提高神经影像生物标志物定量准确性，助力诊断与疗效评估。

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作者们衷心感谢以下来源提供的资金支持。各项神经影像分析的开发与测试工作得到了多项资助，尤其来自加拿大卫生研究院（MOP#13129）、加拿大阿尔茨海默病协会和美国阿尔茨海默病协会、加拿大心脏与中风基金会中风康复合作伙伴关系（HSFCPSR）以及LC坎贝尔基金会的支持。JR获得加拿大阿尔茨海默病协会的薪金资助；SEB获得桑尼布鲁克研究所及桑尼布鲁克和多伦多大学医学系（包括布里尔神经病学讲席）的薪金资助。作者们还获得了加拿大心脏与中风基金会中风康复合作伙伴关系（HSFCPSR）的薪金支持。

<ol><li>Ramirez, J., Gibson, E., Quddus, A., Lobaugh, N. J., Feinstein, A., Levine, B., Scott, C. J., Levy-Cooperman, N., Gao, F. Q., Black, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesion+Explorer%3A+A+comprehensive+segmentation+and+parcellation+package+to+obtain+regional+volumetrics+for+subcortical+hyperintensities+and+intracranial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Lesion Explorer: A comprehensive segmentation and parcellation package to obtain regional volumetrics for subcortical hyperintensities and intracranial tissue.</a> Neuroimage. 54 (2), 963-973 (2011).</li>
<li>Ramirez, J., Scott, C. J., Black, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+scan-rescan+reliability+test+measuring+brain+tissue+and+subcortical+hyperintensity+volumetrics+obtained+using+the+lesion+explorer+structural+MRI+processing+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Topogr%22%5BJournal%5D)">A short-term scan-rescan reliability test measuring brain tissue and subcortical hyperintensity volumetrics obtained using the lesion explorer structural MRI processing pipeline.</a> Brain Topogr. 26 (1), 35-38 (2013).</li>
<li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. 17 (1), 87-97 (1998).</li>
<li>Wahlund, L. O., Barkhof, F., Fazekas, F., Bronge, L., Augustin, M., Sjogren, M., Wallin, A., Ader, H., Leys, D., Pantoni, L., Pasquier, F., Erkinjuntti, T., Scheltens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rating+scale+for+age-related+white+matter+changes+applicable+to+MRI+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new rating scale for age-related white matter changes applicable to MRI and.</a> 32 (6), 1318-1322 (2001).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurol. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Black, S. E., Gao, F. Q., Bilbao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+white+matter+disease%3A+Imaging-pathological+correlations+in+vascular+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Understanding white matter disease: Imaging-pathological correlations in vascular cognitive impairment.</a> Stroke. 40, (2009).</li>
<li>Arch Neurol, 44, 21-23 (1987).</li>
<li>Carmichael, O., Schwarz, C., Drucker, D., Fletcher, E., Harvey, D., Beckett, L., Jack, C. R., Weiner, M., Decarli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+changes+in+white+matter+disease+and+cognition+in+the+first+year+of+the+Alzheimer+disease+neuroimaging+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal changes in white matter disease and cognition in the first year of the Alzheimer disease neuroimaging initiative.</a> Arch. Neurol. 67 (11), 1370-1378 (2010).</li>
<li>Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+lacune%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">What is a lacune.</a> Stroke. 39 (11), 2921-2922 (2008).</li>
<li>Potter, G. M., Doubal, F. N., Jackson, C. A., Chappell, F. M., Sudlow, C. L., Dennis, M. S., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cavitating+lacunes+underestimates+the+burden+of+lacunar+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Counting cavitating lacunes underestimates the burden of lacunar infarction.</a> Stroke. 41 (2), 267-272 (2010).</li>
<li>Barkhof, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+Virchow-Robin+spaces%3A+do+they+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Neurosurg.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Enlarged Virchow-Robin spaces: do they matter.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 75 (11), 1516-1517 (2004).</li>
<li>Zhu, Y. C., Dufouil, C., Soumare, A., Mazoyer, B., Chabriat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tzourio+C.+High+degree+of+dilated+Virchow-Robin+spaces+on+MRI+is+associated+with+increased+risk+of+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Tzourio C. High degree of dilated Virchow-Robin spaces on MRI is associated with increased risk of dementia.</a> J. Alzheimers Dis. 22 (2), 663-672 (2010).</li>
<li>Levy-Cooperman, N., Ramirez, J., Lobaugh, N. J., Black, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misclassified+tissue+volumes+in+Alzheimer+disease+patients+with+white+matter+hyperintensities%3A+importance+of+lesion+segmentation+procedures+for+volumetric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Misclassified tissue volumes in Alzheimer disease patients with white matter hyperintensities: importance of lesion segmentation procedures for volumetric analysis.</a> Stroke. 39 (4), 1134-1141 (2008).</li>
<li>Kovacevic, N., Lobaugh, N. J., Bronskill, M. J., Levine, B., Feinstein, A., Black, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+extraction+and+automatic+segmentation+of+brain+images%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">A robust method for extraction and automatic segmentation of brain images.</a> Neuroimage. 17 (3), 1087-1100 (2002).</li>
<li>Nestor, S. M., Rupsingh, R., Borrie, M., Smith, M., Accomazzi, V., Wells, J. L., Fogarty, J., Bartha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+enlargement+as+a+possible+measure+of+Alzheimer%27s+disease+progression+validated+using+the+Alzheimer%27s+disease+neuroimaging+initiative+database%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Ventricular enlargement as a possible measure of Alzheimer's disease progression validated using the Alzheimer's disease neuroimaging initiative database.</a> Brain. 131, 2443-2454 (2008).</li>
<li>Moody, D. M., Brown, W. R., Challa, V. R., Anderson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+venous+collagenosis%3A+association+with+leukoaraiosis.+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Periventricular venous collagenosis: association with leukoaraiosis. Radiology.</a> (2), 469-476 Forthcoming.</li>
<li>Brown, W. R., Moody, D. M., Challa, V. R., Thore, C. R., Anstrom, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+collagenosis+and+arteriolar+tortuosity+in+leukoaraiosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Venous collagenosis and arteriolar tortuosity in leukoaraiosis.</a> J. Neurol. Sci. 15, 203-204 (2002).</li>
<li>Talairach, J., Tournoux, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalairach%2C+J+%22Co-planar+Stereotaxic+Atlas+of+the+Human+Brain%22">Co-planar Stereotaxic Atlas of the Human Brain</a>. , Thieme Medical Publishers. Stuttgart. (1988).</li>
<li>Dade, L. A., Gao, F. Q., Kovacevic, N., Roy, P., Rockel, C., O'Toole, C. M., Lobaugh, N. J., Feinstein, A., Levine, B., Black, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiautomatic+brain+region+extraction%3A+a+method+of+parcellating+brain+regions+from+structural+magnetic+resonance+images%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Semiautomatic brain region extraction: a method of parcellating brain regions from structural magnetic resonance images.</a> Neuroimage. 22 (4), 1492-1502 (2004).</li>
<li>Shrout, P. E., Fleiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclass+correlations%3A+uses+in+assessing+rater+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Intraclass correlations: uses in assessing rater reliability.</a> Psychol. Bull. 86, 420-428 (2008).</li>
<li>Zijdenbos, A. P., Dawant, B. M., Margolin, R. A., Palmer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+white+matter+lesions+in+MR+images%3A+method+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of white matter lesions in MR images: method and validation.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. 13 (4), 716-724 (1994).</li>
<li>Chow, T. W., Takeshita, S., Honjo, K., Pataky, C. E. of manual and semi-automated delineation of regions of interest for radioligand PET imaging analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+TW+%22BMC+Nucl.+Med%22">BMC Nucl. Med</a>. Comparison, S. tJ. acques,P. .L. .,K. usano,M. .L. .,C. aldwell,C. .B. .,R. amirez,J. .,B. lack,S. .,V. erhoeff,N. .P. . 7, (2007).</li>
<li>Gilboa, A., Ramirez, J., Kohler, S., Westmacott, R., Black, S. E., Moscovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+autobiographical+memory+in+Alzheimer%27s+disease%3A+relation+to+volumes+of+medial+temporal+lobe+and+other+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Retrieval of autobiographical memory in Alzheimer's disease: relation to volumes of medial temporal lobe and other structures.</a> Hippocampus. 15 (4), 535-550 (2005).</li>
<li>Black, S., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cognitive+impairment%3A+small+vessels%2C+big+toll%3A+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke.+40%283+Suppl%29%2C+S38-S39%22%5BJournal%5D)">Vascular cognitive impairment: small vessels, big toll: introduction.</a> Stroke. 40(3 Suppl), S38-S39. , (2009).</li>
<li>Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Challa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+pathology+in+Alzheimer%27s+disease+and+leukoaraiosis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular pathology in Alzheimer's disease and leukoaraiosis.</a> , 903-939 (2000).</li>
<li>Moody, D. M., Brown, W. R., Challa, V. R., Anderson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periventricular+venous+collagenosis%3A+association+with+leukoaraiosis.+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Periventricular venous collagenosis: association with leukoaraiosis. Radiology.</a> (2), 469-476 Forthcoming.</li>
<li>Hernandez, M. D., Piper, R. J., Wang, X., Deary, I. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+automatic+computational+assessment+of+enlarged+perivascular+spaces+on+brain+magnetic+resonance+images%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Towards the automatic computational assessment of enlarged perivascular spaces on brain magnetic resonance images: A systematic review.</a> J. Magn. Reson. Imaging. , (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

LE分割与分区流程专门用于从阿尔茨海默病（AD）及正常老年人的磁共振成像（MRI）中获取区域性体积测量数据。尽管目前存在大量采用复杂计算算法的全自动分析流程来执行此类操作，但这些工具往往缺乏LE半自动流程所能提供的个体化准确性和精确性。半自动流程的权衡之处在于需要投入资源对操作人员进行充分培训，使其具备应用这一综合性流程所需的解剖学知识和计算技能。然而，个体化成像流程的主要优势之一在于，当全自动流程失效时，仍能够从中度至重度神经退行性病变病例中获得定量的体积测量数据。
由于LE流程此前已在多种老年人群和痴呆人群中得到评估和应用1,2,13,14,19,22,23，受过培训的操作人员通常会遇到的主要问题已有充分记录，总结如下。
手动检查和编辑 Brain-Sizer 组件所需的操作包括全脑体积提取掩模、脑室脑脊液（vCSF）重新分配，以及手动去除脑干、小脑和其他幕下结构。在脑提取过程中，只要原始的质子密度加权（PD）/T2 加权图像质量良好，自动生成的全脑体积（TIV）输出通常可提供较为理想的掩模。然而，由于靠近颈动脉区域的下颞极内侧血管和神经组织具有相对较高的信号强度，该区域通常需要进行一定的手动修正。此外，鼻腔内的黏液往往会影响局部强度直方图，导致前额叶区域的强度阈值发生偏移，因此通常需要对自动生成的 TIVauto 掩模进行额外的手动编辑。最后，在最上部的脑区通常也需要进一步的手动编辑，因为全局性脑萎缩往往会导致硬脑膜下方的蛛网膜下腔脑脊液（CSF）体积增加。相反，与脑室扩大相关的萎缩则倾向于减少在 vCSF 重新分配过程中所需的人工干预。采用三特征共配准方法的另一优势在于能够识别邻近脑室的囊性液化梗死灶，其成因可能与脑室周围静脉性血管病变有关。5,24-26，这些结构在PD和T1序列上因相对信号强度不同而可被识别（PD上呈高信号，T1上呈低信号）。在进行洪水填充操作之前，可借助ITK-SNAP_sb中手动绘制的边界将这些低信号区域与脑室脑脊液（vCSF）区分开来。由于vCSF的重新分配是在T1成像空间中进行的，因此在图像配准严重偏离ACPC平面的情况下，可能需要对3rd 脑室和四叠体池，如果小脑幕下结构显示不完全。尽管小脑幕是一个相对容易辨别的结构，但若干基于解剖学的规则有助于指导脑干及小脑幕下结构的手动分离，特别是在定位大脑脚与内侧颞叶的分界时。
SABRE 标记法是一种基于立体定位的方法，需在标准 ACPC 对齐的图像上进行，可实现对特定解剖标志位相对可预测的定位。但存在极端萎缩或因个体神经解剖差异导致正常变异的情况时例外。脑萎缩会导致实质组织整体丢失，使大脑镰周围中线处的脑脊液增多，从而增加选择合适点位放置标志的难度。因此需要制定基于规则的操作流程，以识别需偏离通用规则的特殊情况。解剖结构的正常变异，特别是中央沟和顶枕沟相对位置的差异，也会增加这些结构手动勾画的难度。然而，SABRE 所采用的图形用户界面支持对表面渲染图像进行实时旋转，显著有助于观察和判断这些特定标志位。最后，部分基于规则的操作流程已通过程序集成至软件中，以防止操作者违反规定操作 例如 中央沟的描记被强制向后移动（线条描记无法折返至自身）。
病灶分割（Lesion-Seg）组件的手动核查过程需要操作者具备识别相关高信号病灶的视觉判读专业知识，这种视觉感知能力只有在接触不同程度脑白质高信号（SH）的影像扫描后才能获得。假阳性最小化算法有助于清除初始分割中的大部分错误。然而，在壳核区域扩大的血管周围间隙（Virchow-Robin腔：VRS）与外囊、屏状核、最外囊及岛下区域的相关SH之间进行区分仍可能存在困难，尤其在基底节区存在VRS的情况下更为棘手。近期一篇关于神经影像中血管改变报告标准（STandards for ReportIng Vascular changes on nEuroimaging, STRIVE）的论文建议采用大小标准来区分VRS与腔隙灶，并指出VRS在MRI上通常呈更线性的形态且信号强度与脑脊液（CSF）相似。为解决VRS识别中的这些问题，LE采用了以下策略：a）基于解剖结构的规则，禁止操作者选择位于壳核内的任何高信号病灶；b）设定大小标准，排除直径小于5 mm的高信号病灶；c）相对信号强度规则，依据PD、T2和T1加权像上与脑脊液相对应的信号强度进行进一步排除27。此外，在中线及大脑镰旁可观察到正常的高信号，尤其是在FLAIR成像上，此类信号可能难以与胼胝体周围的相关SH相区分。在出现此类重叠的情况下，将采用基于解剖结构的规则，仅接受延伸至脑室周围区域的SH病灶。
总之，需要明确的是，本文内容旨在补充 JoVE 上以视频指导形式发布的标准化方案出版物（<a href="http://www.jove.com">http://www.jove.com</a>）。尽管传统的静态图示有助于解释某些概念，但基于视频的教程在传达 Lesion Explorer 等综合性神经影像分析流程中所涉及的复杂方法学过程时更为高效。

脑影像分析是一个新兴的神经科学领域，需要具备高水平计算能力和神经解剖学知识的熟练操作人员。为了从磁共振成像（MRI）中获取定量信息，通常需要经过培训的操作人员来实施、监控和编辑由原始MRI数据生成的计算机成像结果。尽管许多“全自动”成像工具可通过互联网免费获取，但当缺乏相关知识、培训经历以及对所下载工具不熟悉的初学者使用时，其准确性和可靠性值得怀疑。虽然现场培训是最理想的授课方式，但提供视频指导的标准化操作流程是一种可行的替代方案，特别是当配有配套的训练图像集时。此外，该训练图像集还可用于质量控制，例如进行异地的评估者间信度测试。
在开发图像处理流程时面临的挑战，尤其是在研究衰老和阿尔茨海默病（AD）时，涉及广泛的技术和生物学问题。尽管部分技术问题可通过后处理校正算法加以解决3，但个体差异和病理过程所导致的变异性仍带来更为复杂的障碍。脑萎缩和脑室扩大可能降低图像配准形变和模板匹配方法的可行性。与年龄相关的白质改变4和小血管病5,6在影像上表现为皮层下高信号（SH）7,8、囊性液性填充的腔隙样梗死9,10以及扩大的血管周围间隙11,12，这些均进一步增加了分割算法的复杂性。在白质病变较显著的情况下，仅基于T1加权图像的单一分割可能导致灰质（GM）体积的高估13，唯有通过质子密度（PD）、T2加权（T2）或液体衰减反转恢复（FLAIR）成像进行额外分割才能予以校正。鉴于上述挑战，病灶探查者（Lesion Explorer, LE）图像处理流程采用了一种半自动的三模态特征（T1、PD、T2）分析方法，并在某些特定阶段引入经培训的操作人员进行人工干预，以提高准确性1,2。
脑提取（或称颅骨剥离）通常是神经影像学中首先执行的操作之一。因此，全脑颅腔容积（TIV）提取过程的准确性会显著影响后续分析流程中的各项操作。若出现明显的过度侵蚀，导致脑组织丢失，可能引起脑萎缩程度的高估；反之，若出现明显的侵蚀不足，导致硬脑膜及其他非脑组织被保留在内，则可能导致脑体积的膨胀。LE 的 Brain-Sizer 模块通过采用三模态（T1、T2 和 PD）方法生成 TIV 掩膜，有效解决了上述诸多问题，其效果优于单模态方法1。此外，自动生成的 TIV 掩膜会依据标准化协议进行人工核查与编辑，以识别易发生颅骨剥离错误的区域。在完成脑提取后，对去颅骨的 T1 图像进行分割处理，将每个脑体素分配至以下三类标签之一：灰质（GM）、白质（WM）或脑脊液（CSF）。该分割过程通过应用一种鲁棒的曲线拟合算法于全局与局部强度直方图上自动实现；该技术旨在应对强度不均匀伪影，以及阿尔茨海默病（AD）病例中灰质与白质强度幅值差异减小的问题14。
Brain-Sizer 组件还包括手动标注脑室和去除幕下结构的操作步骤。脑室脑脊液（vCSF）的分割尤为重要，因为脑室大小是阿尔茨海默病痴呆常用的生物标志物15此外，准确勾画脑室和脉络丛对于正确识别脑室周围高信号（pvSH）至关重要，后者被认为反映了一种以静脉胶原病为特征的小血管病。5,16,17. 以T1为参考，在分割图像上通过手动泛洪填充操作将脑脊液（CSF）体素手动重标记为脑室脑脊液（vCSF）。通常，侧脑室较易与脑沟内的脑脊液区分开来。因此，建议在轴向切面上进行泛洪填充，从上方切片开始，逐步向下进行。脑室系统的内侧部分，尤其是第3rd 脑室更难以界定，需遵循基于解剖结构的特殊规则，这些规则在手册中有详细说明。Brain-Sizer 的最后一步包括使用另一套基于解剖结构的标准化方案中所述的手动追踪方法，去除脑干、小脑及其他幕下结构。
半自动脑区提取（SABRE）组件是该流程的分区处理步骤。此阶段需要经过培训的操作人员识别以下解剖标志：前连合和后连合（AC，PC）；脑后缘；中央管；正中矢状面；枕前切迹；顶枕沟；中央沟；以及外侧裂。基于这些标志点的坐标，系统将自动生成类似Talairach18的网格，并完成区域分割19。这些标志点在AC-PC对齐的图像上易于识别，此类图像由系统自动生成，并在SABRE标志点标注流程开始前进行人工核查。
病灶分割（Lesion-Seg）组件是流程的最后阶段，用于实现微出血（SH）的识别与定量。初始的自动SH分割采用一种复杂算法，包括基于PD/T2的SH分割、模糊c均值掩模以及脑室扩张分析。这些操作生成一个自动的病灶分割掩模，随后需人工检查并修正假阳性结果及其他错误。由于MRI上的高信号可能来源于非病理因素（例如 运动伪影、正常生物学变异），因此需要经过适当培训，才能准确识别相关的微出血（SH）。
LE 流程的最终结果是一个包含 8 种不同组织和病灶体积测量值的综合性容积图谱，这些测量值被分割至 26 个 SABRE 脑区。为获得个体操作者在异地的评分者间可靠性检验结果，建议在软件提供的训练数据集上运行完整的 LE 流程（http://sabre.brainlab.ca）。基于容积测量结果，采用组内相关系数（ICC）20 可针对每个SABRE区域内的每种组织类别（GM/WM/CSF）计算统计量。利用分割图像，计算相似性指数（SI）21 可以计算统计量以评估空间一致性的程度。此外，在操作者完成第一次操作后经过一段短暂时间，可对其结果进行组内相关性分析，以评估同一操作者的重复测量信度。st 和 2nd 分割编辑。只要远程操作人员遵循LE手册中规定的文件命名规范，即可使用大多数基础统计软件包在远程进行可靠性统计计算。鉴于这些质量控制措施和视频引导的标准化流程，远程操作人员可以更有信心地确保LE流程被准确且可靠地执行。

<table><tbody><tr><td>磁共振成像仪（1.5 特斯拉）</td><td>通用电气</td><td></td><td>参见&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;获取参数</td></tr><tr><td>磁共振成像仪（3 特斯拉）</td><td>通用电气</td><td></td><td>参见&lt;strong&gt;表2&lt;/strong&gt;获取参数</td></tr></tbody></table>

病灶探查者：一种基于视频指导的标准化方案，用于阿尔茨海默病及正常老年人群中准确可靠的磁共振成像衍生体积测量

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

获取 体内 由MRI获取的人脑组织体积测量数据常因多种技术和生物学因素而变得复杂。当存在显著的脑萎缩和年龄相关的白质改变时，这些挑战尤为突出。例如 白质疏松症）存在。病变探查器（Lesion Explorer，LE）是一种准确且可靠的神经影像学分析流程，专门用于解决在阿尔茨海默病及正常老年人群的MRI中常见的一系列问题。该流程由一系列经过半自动化的操作步骤组成，此前已在多项内部与外部的信度测试中得到验证。1,2然而，LE 的准确性和可靠性在很大程度上依赖于经过适当培训的手动操作人员来执行指令、识别明确的解剖标志，并手动编辑和验证各种计算机生成的分割结果。
LE 可分为三个主要组成部分，每个部分都需要一组命令和手动操作：1）Brain-Sizer，2）SABRE，以及 3）Lesion-Seg。Brain-Sizer 的手动操作包括对自动去颅骨的全颅腔（TIV）提取掩膜进行编辑、脑室脑脊液（vCSF）的标定，以及后颅窝结构的去除。SABRE 部分需要检查图像在前连合-后连合（ACPC）平面上的对齐情况，并识别区域分割所需的多个解剖标志点。最后，Lesion-Seg 部分涉及对皮层下高信号（SH）自动病灶分割结果进行人工核查，以发现假阳性错误。
尽管现场培训LE流程更为理想，但使用现成的、配有交互式培训图像的可视化教学工具也是一种可行的替代方案。为确保高度的准确性和可靠性，以下是LE手动操作的逐步标准化视频指导方案。

可采用多种指标评估评分者间信度。使用在线提供的训练集（<a href="http://sabre.brainlab.ca">http://sabre.brainlab.ca</a>），建议在完成LE后，按以下步骤评估每个处理阶段的评分者间信度。
Brain-Sizer： 
为评估脑提取操作的评分者间可靠性，对每个TIV-E掩膜生成体积测量数据， &lt;名称&gt;TIVedit，使用 &lt;图像计数&gt; 命令。将这些体积数据输入统计软件包（例如 SPSS），并结合为每个训练集提供的TIVedit容积数据（参见在线提供的Excel/csv文件），计算评分者间相关系数（ICC）。内部培训评分者获得的全脑容积测量结果报告ICC=0.99，p&lt;0.0001 1,2此外，可使用SI评估TIV掩模的空间一致性。21. 提供了在线 MATLAB 代码，用于计算两名评分者之间的 SI 值。
为评估心室重新分配，使用以下方法生成vCSF容积： &lt;图像数量&gt; 针对每个重新分配了vCSF体素的分割文件的命令， 即. &lt;名称&gt;_ seg_vcsf。vCSF体积为标题为“volume”的列中第“7”行旁边的数值。采用相同的程序评估TIV的评分者间信度，计算vCSF的ICC和SI。 
可通过在 &lt;name&gt;_seg_vcsf_st 上运行 &lt;img_count&gt; 命令，以类似方式评估脑干、小脑及幕下结构的去除情况。用于此分割掩模的体积显示在标题为“非零体素总数：”的倒数第二行“volume”（最右侧一列）下。使用与评估 TIV 和 vCSF 相同的步骤，根据提供的 Excel 文件中的体积数据以及 &lt;name&gt;_seg_vcsf_st 文件，计算此掩模处理的组内相关系数（ICC）和相似性指数（SI）。
SABRE： 
尽管 Brain-Sizer 的手动操作可通过标准指标轻松评估，但 ACPC 对齐的评估稍显困难。因此，提供了矩阵文件，供异地操作人员通过视觉比对进行培训。完成 ACPC 对齐后，打开一个新的 ITK-SNAP_sb 窗口，加载 T1 图像，然后加载在线提供的训练案例矩阵文件 &lt;name&gt;_T1_IHCpre_toACPC.mat，并在两幅图像之间直观比较俯仰角（pitch）、滚动角（roll）、偏航角（yaw）以及 ACPC 切片。
为评估 SABRE 标记流程，对每个训练样本的分割掩膜 &lt;name&gt;_SABREparcel_inACPC 运行 &lt;img_count&gt;，并输入各区域（3-28）的体积测量值。SABRE 区域编码可在线获取。采用相同流程评估 TIV 和 vCSF，并计算每个 SABRE 脑区的组内相关系数（ICC）。本机构培训的评分者对 SABRE 分割后各脑区体积测量所得的平均 ICC 报告为 0.98，p&lt;0.01，ICC 值范围为 0.91–0.991,2。
病灶分割（Lesion-Seg）： 
由于该组件是LE流程的最后阶段，其可靠性和准确性将依赖于前面的步骤。
采用区域ICC（组内相关系数）和SH掩模的空间一致性来评估SH分割的评分者间可靠性。为评估区域SH体积，运行&lt;SH_volumetrics&gt;程序，输入T1成像空间中的lobmask文件&lt;name&gt;_SABREparcel以及最终经过编辑的病灶分割文件&lt;name&gt;_LEedit。参照SABRE体积评估的相同流程，计算每个SABRE脑区内的病灶体积ICC值。参照TIV掩模处理的空间一致性评估流程，计算最终编辑后的病灶掩模（&lt;name&gt;_LEedit或FLEXedit）的SI（相似性指数）。上述可靠性检验可同时应用于基于PD/T2的分割和基于FLAIR的分割结果。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3D T1</td>
			<td>PD/T2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成像参数</td>
			<td>Axial Volume SAT (S1) SPGR</td>
			<td>Axial Spin Echo FC VEMP VB (interleave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脉冲时序</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE (msec)</td>
			<td>5</td>
			<td>30/80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TR (msec)</td>
			<td>35</td>
			<td>3,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>翻转角 (°)</td>
			<td>35</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TI (msec)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扫描范围</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOV (cm)</td>
			<td>22</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>层厚 (mm)</td>
			<td>1.2/0</td>
			<td>3/0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>层数</td>
			<td>124</td>
			<td>62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>采集</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>矩阵大小</td>
			<td>256 x 192</td>
			<td>256 x 192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体素大小 (mm)</td>
			<td>0.86 x 0.86 x 1.4</td>
			<td>0.78 x 0.78 x 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEX</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总时间 (min)</td>
			<td>11:00</td>
			<td>12:00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 通用电气1.5T结构磁共振成像采集参数。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3D T1</td>
			<td>PD/T2</td>
			<td>FLAIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成像参数</td>
			<td>Axial 3D FSPGR EDR IR Prep</td>
			<td>Axial 2D FSE-XL, EDR, FAST, fat sat</td>
			<td>Axial T2Flair, EDR, FAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脉冲时序</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			<h2>TE (ms)</h2>
			</td>
			<td>3.2</td>
			<td>11.1 / 90</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TR (msec)</td>
			<td>8.1</td>
			<td>2,500</td>
			<td>9,700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>翻转角 (°)</td>
			<td>8°</td>
			<td>90°</td>
			<td>90°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TI (msec)</td>
			<td>650</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2,200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扫描范围</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>视野 (FOV, cm)</td>
			<td>22</td>
			<td>22</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>层厚 (mm)</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>层数</td>
			<td>186</td>
			<td>48</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>采集</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>矩阵大小</td>
			<td>256 x 192</td>
			<td>256 x 192</td>
			<td>256 x 192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体素大小 (mm)</td>
			<td>0.86 x 0.86 x 1</td>
			<td>0.86 x 0.86 x 3</td>
			<td>0.86 x 0.86 x 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEX</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总时间 (分钟)</td>
			<td>7:20</td>
			<td>6:10</td>
			<td>7:20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 通用电气3T结构磁共振成像采集参数。
<img alt="脑部MRI分割，分析解剖结构。医学影像，诊断分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 轴向T1图像叠加未经编辑的全颅腔容积（TIV）掩膜（绿色）。 本图示例展示了在Brain-Sizer的TIV提取过程中，使用ITK-SNAP_sb中的闭合多边形工具手动去除非脑组织的操作步骤。
<img alt="脑部 MRI 分割结果；示意图；显示组织区分；神经科学教育。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 带有组织分割叠加的轴向 T1 图像。请注意，标签颜色是任意的，可使用标签工具进行修改。左侧图像显示默认颜色。中间图像显示脑脊液（5=紫色）如何被重新分配至脑室脑脊液（vCSF，7=洋红色）。右侧图像显示可在不更改组织类别标签的情况下修改白质（WM）的颜色，i.e. 标签 3=WM 保持不变，但颜色可修改为蓝色。
<img alt="Brain MRI segmentation; diagram showing tissue classification for medical analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 轴向T1加权像与组织分割叠加图（左图，GM=黄色，WM=橙色，CSF=紫色）。图中显示的是使用闭合多边形手动去除后颅窝结构的示例。n 工具在 ITK-SNAP_sb 中的使用（中），以及去除后的最终组织分割结果（右）。如 图2，右图显示了如何在不改变组织类别标签的情况下修改白质（WM）的颜色， 即标记3=WM仍然保留，但颜色可修改为蓝色。
<img alt="脑部 MRI，解剖学比较，轴向切片；神经影像学，结构分析，医学诊断。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 在执行AC-PC校正前（左）和校正后（右）采集空间中的轴向T1图像。
<img alt="大脑解剖分析；MRI扫描和三维脑模型展示神经通路，医学影像。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 显示SABRE标记程序的两个示例。 轴向AC-PC对齐的T1图像，显示前连合（黄色）、后连合（蓝色）和后缘（粉色）的标记位置（左图）。右侧为三维表面渲染的T1图像，标注了外侧裂（紫色）和中央沟（粉色）。
<img alt="显示高亮区域、病灶进展分析的脑部轴向 MRI 扫描图像，医学研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 轴向质子密度加权成像（左），自动生成的病灶叠加图像（中），以及手动编辑的病灶（红色）叠加图像（右）。
<img alt="突出显示脑区的脑部MRI扫描图像、示意图、数据分析、神经影像学、认知功能研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50887/50887fig7highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 轴向FLAIR图像（左），自动生成的病灶叠加图像（中），以及手动编辑的病灶（红色）叠加图像（右）。

病灶探查器（Lesion Explorer，LE）是一种半自动化的图像处理流程，旨在从阿尔茨海默病患者及正常老年人的结构磁共振成像（MRI）中获取区域性脑组织和皮层下高信号病灶的体积测量数据。为确保高度的准确性和可靠性，以下提供一套配有视频指导的标准化操作流程，用于指导LE的手动操作步骤。

从MRI获取体内人脑组织体积测量数据常因多种技术和生物学问题而变得复杂。这些挑战包括……

以下流程的总体目标是加深对衰老和痴呆的理解，方法是获取基于 MRI 的区域性脑萎缩测量指标以及小血管病变的神经影像生物标志物。首先生成去除颅骨的脑掩膜和基本的脑组织分割结果，以精确量化全颅内体积。第二步，完成TRIFE病灶分割，以量化并分类病灶亚型，从而对小血管病进行准确的影像学生物标志物测量。随后，在每个个体上进行解剖标志点定位，将大脑划分为26个标准化的兴趣区域。通过结构磁共振成像获得的脑组织萎缩程度、测量指标及病灶体积数据，结果显示不同疾病组之间存在区域特异性的神经退行性变和血管病变模式差异。我们的分析方法有助于解决脑成像在衰老与痴呆研究中的关键问题。我们开发的个性化流程使研究人员和临床医生能够更好地理解个体患者以及不同患者群体的诊断、疾病进展和治疗反应情况。该方法对于同时患有脑小血管病和神经退行性疾病的人群尤为适用。这在老年人中非常常见，尤其是在阿尔茨海默病患者中。该流程也可应用于其他神经系统疾病患者，如血管性痴呆和脑卒中、额颞叶痴呆、创伤性脑损伤以及多发性硬化症患者。由于手动干预步骤可能较为复杂，因此该方法的可视化演示至关重要。这需要具备扎实的神经解剖学知识基础，以及较强的计算机操作能力和技能。其中许多步骤通过视频格式进行讲解效果最佳。本视频将帮助使用者准确地观察相关解剖结构，并展示所需的计算处理过程。为我们演示该操作的是实验室管理员 Christopher Scott，以及 RIN 影像分析师 Alicia McNeely 和 Courtney Beek。首先打开软件，加载一幅 T1 加权图像和自动去颅骨的全颅内体积掩模叠加图像（TIV auto）。然后使用画笔工具开始编辑 TIV auto，以添加或重新勾画 TIV auto 未包含的脑组织部分。选择活动的绘图标签作为标签一，并将其绘制为所有标签，以重新捕获颜色、DIV自动区域，或仔细重新捕获未着色区域。使用画笔工具重新绘制TIV自动掩膜。仔细检查每一层切片，确保仅有脑组织被涂成绿色并标记为标签一，所有非脑组织均使用其他标签标记。如果绘图困难，可使用闭合多边形工具，根据需要重新捕获或删除TIV自动标记。对TIV的修改满意后，将图像保存为TIV edit，以开始心室重新分配。将seg图像加载至T one IHC图像之上，然后将绘图标签调整为相应的颜色。接下来使用洪水填充工具重新分配脑脊液（CSF）体素，通过按空格键在洪水填充和绘制限制范围之间来回切换。使用条形限制以防止洪水填充扩展到脑室中某些特定区域，这些区域被认为是脑室周围黑洞或白质高信号的一部分。以T1加权图像作为指导，判断颞叶区域应填充或不应填充的部分。按 S 键可切换侧脑室分割的显示与隐藏。完成操作后，保存分割结果，以用于去除脑干、小脑及幕下结构。选择多边形工具，在关闭分割显示的状态下，滚动至小脑开始出现的第一张切片。然后单击鼠标左键，在小脑周围的硬脑膜以及脑干基底部跨越胼胝体的区域上绘制一个多边形。接着单击鼠标右键闭合该多边形，然后点击“接受”以删除该部分的分割区域。此时该区域将显示其下方的 T1 信号，表明其已不再包含在分割范围内。当大脑脚分离后，开始同时去除脑干和脊髓。现在逐层向上滚动图像切片，以确认剩余的分割部分仅为大脑组织。完成后，保存分割结果。首先，加载用于 CPC 对齐的 ISO 图像和 mat 文件。首先，使用导航工具紧密放大。然后使用俯仰向上、向下以及抬高向上、向下工具调整轴向视图，使前连合达到最厚，后连合呈水平直线。最终应形成一个清晰的钥匙孔形状。调整视图，使眼球进入视野。现在通过在轴向视图中平衡眼球来调节旋转角度。在滚动图像时，轴向切片应呈现均匀对称的外观。一次调整一个切片，通过确保垂直十字线穿过正中矢状面来调整 ya。在轴向视图中，由于大脑在极点处存在自然曲率，有时可能难以使平面完全对齐，此时应尽可能创建最佳拟合。开始时，加载用于标记点识别的图像。首先，点击左侧的 AC 单选按钮以选择要定义的解剖标志点。然后在轴向图像上点击 AC。接着，点击左侧的 PC 单选按钮，再在轴向图像上点击 PC。现在点击“PE”单选按钮，以定义该切片上脑部的后缘，然后点击脑部最靠后的部分，位置可在左侧或右侧。这将填充一个冠状切片的数值，该数值将立即被使用。点击“ca”单选按钮以定义中央管。然后从当前的轴向视图向下滚动 10 个层面，并点击中央管的中心。这将填充矢状层面的数值，该数值将用作查找正中矢状面的起始点。接下来，点击 M 单选按钮以定义正中矢状面。然后点击 LPR 单选按钮以定义左侧枕前切迹，点击 RPR 单选按钮以定义右侧半球枕前切迹。创建对象图时，点击 LSC 单选按钮以定义左侧中央上沟，单击鼠标左键在该沟上方的硬脑膜处放置标记。点击 LOP 单选按钮以定义左侧枕顶沟。该沟的描记从硬脑膜延伸至小脑幕，适用于表面渲染的描记。从后向前开始描记外侧裂及其分支，起始于其分叉为细小的上升支和下降支的位置。现在点击 lc 单选按钮以描记左侧中央沟。从外侧裂下方中央沟末端的下端开始，直接从该点起始。向上端描记中央沟，直至脑沟曲度难以追踪时为止。最后，单击 3D 视角下的右侧按钮，重复上述步骤，对右侧 Sylvie 裂和右侧中央沟进行处理，以使用 PD 或 T2 扫描完成病灶分割。首先，回顾所有可用的影像资料，包括 T1、PD 和 T2 图像，以确定应将哪些区域标记为脑部病灶。然后使用画笔工具在标签一之上绘制标签二，以标示出存在病灶的区域。可使用 S 键切换分割的开启与关闭状态。此外，将标签一绘制在标签二之上，以标示荧光成像扫描中的任何假阳性或错误。同样，根据需要使用所有可用的成像信息，以辅助判断哪些区域构成病灶。然后使用画笔工具修改标签，以标示病灶和假阳性区域。对病灶分割的修改结果满意后，保存最终编辑的图像。此处可看到两个示例，展示 SABRE 标记点定位流程。左侧的轴向切片显示了与前连合（ac）、后连合（pc）以及后缘解剖标志对齐的A CPC T1像。该3D表面重建的T1像展示了外侧裂和中央沟的轮廓。此轴向PD像包含自动生成的病灶叠加图像以及手动编辑的病灶叠加图像。这是病灶探查流程中完成的手动重标记操作的一个示例，此处展示的也是柔性流程（flex process）中完成的手动重标记操作的示例。轴向图像包含自动生成的病灶叠加层和经手动编辑的病灶叠加层。有关脑组织提取流程的评估者间可靠性评估方法，请参见本视频所附的论文。在尝试此操作过程中，重要的是要记住，不同受试者之间存在解剖学上的个体差异。尽管本方案提供了需遵循的指导原则，但经验和解剖学知识对于确保成功至关重要。一旦掌握，每位受试者的操作可在一至一个半小时内完成。此外，还可进行其他方法，如对瑞卡·罗宾斯基底前脑胆碱能高信号区进行分割以及脑卒中病灶勾画。这使得研究人员能够回答更多问题，例如特定血管损伤在痴呆研究中的作用。观看本视频后，您应能够准确且可靠地掌握如何使用 Sabre Brain Tools 中的病灶探查（lesion Explorer）MRI 处理流程进行体积分析。该软件可免费获取，可通过 online@sabrebrainlab.ca 在线下载。

lesion-explorer-video-guided-standardized-protocol-for-accurate

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

病变资源管理器：一个视频引导，标准化为老年痴呆症准确，可靠的MRI衍生Volumetrics和正常老年人协议

来源：Arango-Lievano, M. 等，中枢神经系统疾病的脑血管纵向活体成像研究。J. Vis. Exp.

阿尔茨海默病小鼠模型中脑血管与淀粉样斑块的活体成像

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