使用穆林精密切肺片对肺动脉内下氧肺血管收缩进行视频形态分析

该程序的总体目标是分析内径为 20 至 100 微米的镜像肺内动脉的缺氧性肺血管收缩。这是通过首先用低熔点 aros 填充肺部气道来实现的。第二步是使用振动器将分离的肺部切成 200 微米厚的切片。

接下来，通过在 37 摄氏度的温暖培养基中孵育，用常氧气体鼓泡，从肺切片中取出 aros。因此，这些部分在流体中缓慢移动。然后将单个肺切片转移到流经超输室的流中，然后对横截面动脉的血管反应性进行视频形态学分析。

最终，评估血管管腔区域对不同治疗的反应变化。与现有方法（如胸膜下微血管的活体显微镜检查）相比，该技术的主要优点是可以测量离体近端肺动脉的血管张力，因为它可以定量分析直径在 20 到 100 微米之间的肺内动脉的 VA 反应性。演示该程序的是 Anna Goldenberg 和该实验室的两名技术人员。

通过颈椎脱臼杀死小鼠后，立即打开腹腔，将肠袢移到一边，切断腹大血管出血。接下来，使用细剪刀穿透隔膜。这会导致空气进入胸膜腔，导致肺部塌陷。

继续切割以将隔膜从下胸孔中分离。现在横向切开肋骨和锁骨。要去除胸腔的腹侧部分，请取出胸腺。

用温热的灌注缓冲液填充注射器。接下来，在心脏的左心室切一个小孔。调整灌注缓冲液的流出量，并通过右心室缓慢灌注肺血管系统，直到肺部呈白色。

接下来，从气管中取出唾液腺、小肌肉和结缔组织。断开气管与周围结缔组织的连接，并在食道和气管之间插入一块缝纫棉，以便稍后结扎。然后用微型剪刀在两个相邻气管软骨之间的气管上部切一个小孔。

在注射器中注入 37 摄氏度、温暖、低熔点的 agros 后，将其连接到柔性塑料套管上并缓慢推入柱塞，直到空气从套管中排出。将套管插入气管的小孔中，并用缝纫棉小心地将其固定到位。接下来，慢慢地用 aros 填充气道并观察肺部。

起初，右肺开始扩张，然后是左肺。30 到 40 秒后，填充完成，双肺充气至与体内情况相当的体积，约为 1.2 至 2.0 毫升。根据性别、年龄和体重，重要的是要足够快地注射鸡蛋玫瑰，这样它在手术过程中就不会如此凝固，但也不能太快以至于损害肺部。

同时充盈肺部后，拉出塑料套管并用缝纫棉结扎气管，以防止 aros 泄漏。随后切开结扎线上方的气管，将肺和心脏从胸部分离，将器官转移到冰冷的堆 ringer 缓冲液中以凝固 agros，这在等待期间在几分钟内发生。使用强力胶将一块香槟软木塞连接到振动器的标本架上，以作为肺组织的歪斜。果冻凝固后，分离各个肺叶。

接下来是强力胶，一个叶子贴在标本架上。为了获得小 asner 内动脉的横截面，取右肺的颅叶并将其与肺门表面强力粘合到支架上，使用配备从外围切下的新鲜剃须刀片的振动器，将肺叶切成 200 微米厚的切片。为了获得较大的前动脉的横截面，将左肺的肺门与香槟软木塞对齐，并将叶沿这个方向粘在支架上，然后从外围切开以去除 aros。

将器官切片转移到装满约 200 毫升 37 摄氏度的玻璃烧杯中。MEM 将烧杯放入加热箱中，用常氧气体鼓泡，使肺部分在培养基中缓慢移动。大约两个小时后，充满空气的 aros 斑块将从肺组织中去除，切片将沉降到烧杯底部。

对于肺内动脉的视频形态学分析，将一个肺切片转移到流经超输室的流中，该流经室安装在显微镜上并充满 1.2 毫升常氧气体。内存。用连接到铂环的尼龙绳将肺部分固定在腔室底部。开始用常氧气体培养基灌注腔室。

使用具有 10 倍物镜的相差显微镜扫描肺切片，寻找内径在 20 到 100 微米之间的横截面动脉。找到合理的候选血管后，使用 20 倍物镜拍摄前阿斯纳血管的照片，或者如图所示，使用 40 倍物镜拍摄阿斯纳内动脉的照片，以测量血管的内径。在开始实验之前，设置软件以在整个实验期间每分钟拍摄横截面动脉的照片。

触发摄影后，继续用常氧气体培养基灌注腔室 10 分钟。然后在 U 466 19 中浸泡肺切片 10 分钟，无流，仅使用管腔面积减少至少 30% 的血管来分析动脉的收缩力 U 466 19。用常氧气体培养基洗去药物 10 分钟。

然后通过应用 res 扩张动脉 10 分钟，没有低流量。同样，用常氧气体培养基以每分钟 6 毫升的流速洗涤 10 分钟，然后以每分钟 0.7 毫升的流速洗涤 10 分钟，以去除药物。接下来，将肺切片与高低氧气体培养基孵育 40 分钟。

此外，通过一组额外的管路将低氧气体混合物流入灌注室的空腔。用常氧气体介质洗涤 20 分钟，去除低氧介质，并从低氧气流切换到常氧气流进入腔室的空域，以检查容器的活力。实验结束时，将 U 466 19 注入灌注室，无流孵育 20 分钟以诱导血管收缩。

对新鲜的肺切片重复这些步骤，以测量另一条血管的血管反应性。通过将横截面动脉的图像加载到图像分析程序中来开始分析。然后使用光标勾勒出血管的管腔区域。

手干是必要的，因为它可以避免由于血细胞附着在血管壁上等原因造成的伪影。继续以类似的方式分析横截面图像。当流经培养室中的一种条件更改为另一种条件时，应分析每张图像，但当条件没有变化时，分析所有其他图像就足够了。

在这些横截面 ASIN 前动脉的相差图像中可以观察到缺氧性肺血管收缩，该动脉靠近横截面支气管。照片是在测量开始时用图表中圆圈表示的时间点拍摄的，测量结束时用 U 466 19 暴露于 RAs 30 或 40 分钟后，在用常氧气体介质洗涤后，在最后一次应用 U 466 19 血管反应性记录为横截面管腔面积的相对变化动脉对抗时间。实验开始时的面积定义为 100%，血管收缩作为相对于初始面积的值给出。

在这种情况下，暴露于缺氧会导致管腔面积减少 60%，从而更清楚地显示低氧反应。此处未显示测试输精管反应性的实验的初始阶段，并且在暴露于还原氧之前获得的值设置为 100%这些研究中检查的另一种类型的血管是位于肺泡隔膜角撑层的 ASIN 内动脉。在这组实验中，为此分析了线粒体 A TP 敏感钾通道的非选择性开放剂 sidal 对小 asner 内动脉缺氧肺血管收缩的影响。

将切片在低氧培养基中孵育。在不存在或存在 50 微摩尔 sidal 的情况下，在常氧气体培养基中进行对照孵育，以更清楚地显示对常氧或缺氧或缺氧加 sidal 的反应。在暴露于常氧或低氧气体培养基之前获得的值设置为 100%暴露于松果体的动脉不显示面积减少，在无添加剂的低氧培养基中孵育的动脉也是如此。

在常氧介质中，无法检测到管腔区域的变化。暴露于低氧气体培养基（有或没有 50 微摩尔 sidal）的小 ASIN 内动脉的记录以平均值加或减 SEM 表示。在此图中，显示了与低氧孵育开始时的值相关的相对数据。

未检测到血管反应性。在暴露于低氧气体的肺切片中，含有U 466 19诱导的松果体血管收缩的培养基不受该药物的影响。看完这个视频后，您应该对如何准备镜面精度、切割肺切片以及如何使用它们来定量测量直径在 20 到 40 微米之间的小 asina 内动脉的 VA 反应性有了很好的了解，这些动脉位于肺泡隔膜的气体处，以及直径在 40 到 100 微米之间的较大的雅典娜前动脉， 它们与 Bronchi 和 Bronchioli 相邻。