利用小鼠精密切割肺片进行肺内动脉缺氧性肺血管收缩的视频形态计量分析

本实验的总体目标是分析内径为20至100微米的肺内动脉的低氧性肺血管收缩。首先，通过将低熔点琼脂糖填充至肺部气道，实现对肺组织的支撑；第二步，使用振动切片机将分离的肺组织切成200微米厚的切片。

接着，将肺组织切片放入37摄氏度的预温培养基中孵育，培养基用常氧气体鼓泡，使组织切片在液体中缓慢移动。然后将单个肺组织切片转移至流通式灌流 chamber 中，进行横断动脉血管反应性的视频形态测量分析。

最终，将评估血管管腔面积在不同处理条件下的变化。与现有的方法（如胸膜下微血管的活体显微镜观察）相比，该技术的主要优势在于能够对离体近端肺动脉的血管张力进行测量，从而实现对直径在20至100微米之间的肺内动脉血管反应性的定量分析。本次实验操作将由Anna Goldenberg及本实验室的两位技术员进行演示。

小鼠经颈椎脱位处死后，立即打开腹腔，移开肠袢并切断腹腔内主要血管以放血。随后，使用精细剪刀刺穿膈肌，空气进入胸膜腔导致肺脏塌陷。

继续切割，将膈肌从下胸口分离。随后在侧方剪断肋骨和锁骨。为移除肋笼的腹侧部分，需取出胸腺。

用温热的灌注缓冲液填充注射器。接着，在心脏左心室上剪开一个小孔。调节灌注缓冲液的流出速度，通过右心室缓慢灌注肺血管系统，直至肺组织呈现白色。

接着，从气管上剥离唾液腺、小块肌肉及结缔组织。将气管与周围结缔组织分离，并在食管与气哽之间插入一段缝合棉线，以备后续结扎使用。然后用显微剪刀在相邻的两个气管软骨之间的气管上段剪开一个小孔。

用37摄氏度的温热低熔点琼脂糖充满注射器后，将其连接到一根柔性的塑料套管上，缓慢推动活塞，直至排出套管中的空气。将套管插入气管上的小孔，并用缝合棉线小心固定。接着，缓慢将琼脂糖注入气道，并观察肺部情况。

首先，右肺开始扩张，随后左肺也开始扩张。经过30至40秒后，灌注完成，双肺膨胀至与体内状态相当的体积，约为1.2至2.0毫升。根据性别、年龄和体重的不同，注射蛋清玫瑰液的速度需足够快，以防止其在操作过程中过度凝固，但又不能过快，以免损伤肺组织。

双肺同时灌注完成后，拔出塑料插管，并用缝合棉线结扎气管，以防止灌注液泄漏。随后，在结扎线的上方剪断气管，将肺和心脏整体从胸腔中取出，并立即转移至冰冻的赫克斯林格缓冲液中，使灌注液在数分钟内凝固。等待过程中，使用速干胶将一块香槟软木塞粘附在振动切片仪的样品架上，作为肺组织的支撑背板。灌注液完全凝固后，分离各个肺叶。

接下来，将一个肺叶用万能胶粘附到标本夹持器上。为了获得小的肺内动脉的横切面，取右肺的颅侧肺叶，将其肺门面朝下，用万能胶固定在夹持器上，使用装有新剃须刀片的振动切片机，从外周开始切片，将肺叶切成200微米厚的切片。为了获得较大的肺前动脉的横切面，将左肺的肺门与软木塞对齐，并将肺叶以此方向用胶固定在夹持器上，然后从外周切片以去除肺实质。

将器官切片转移至一个盛有约200毫升37摄氏度MEM培养基的玻璃烧杯中，将烧杯放入加热培养箱，并用常氧气体进行鼓泡，使肺组织切片在培养基中缓慢移动。约两小时后，填充在气道中的气道阻塞物（aros plaques）将从肺组织中被清除，切片会沉降至烧杯底部。

为进行肺内动脉的视频形态测量分析，将一片肺组织切片转移至安装在显微镜上并盛有1.2毫升经含氧气体饱和MEM培养基的灌流式灌注腔室中。使用连接在铂金环上的尼龙丝将肺组织切片固定在腔室底部。开始以含氧气体饱和的培养基对腔室进行灌注。

使用10倍物镜的相差显微镜扫描肺组织切片，寻找内径在20至100微米之间的横截动脉。找到合适的候选血管后，使用20倍物镜拍摄前小动脉的图像，或如本图所示，使用40倍物镜拍摄肺内小动脉的图像，用于测量血管的内径。在实验开始前，预先设置软件，使其在整个实验过程中每隔一分钟自动拍摄一次横截动脉的图像。

触发摄影后，继续用常氧气体介质灌注腔室10分钟。然后在无流动条件下用U 466 19孵育肺组织切片10分钟，以分析动脉的收缩性，仅使用管腔面积在U 466 19作用下减少至少30%的血管。随后用常氧气体介质冲洗药物10分钟。

然后，在无流动条件下加入血管扩张剂作用10分钟以扩张动脉。再次用常氧气体饱和的培养基以每分钟6毫升的流速冲洗10分钟，去除药物，随后以每分钟0.7毫升的流速继续灌注10分钟。接下来，将肺组织切片与高浓度低氧气体饱和的培养基共同孵育40分钟。

同时通过另一组管路将低氧气体混合物通入灌流室的气相空间。用常氧气体饱和的培养基洗涤20分钟，以去除低氧培养基，并将灌流室气相空间的气体由低氧切换为常氧，以检测血管的活性。实验结束时，向灌流室中加入U 466 19，在无流动条件下孵育20分钟，以诱导血管收缩。

使用新的肺组织切片重复这些步骤，以测量另一血管的血管反应性。首先将动脉横切面图像导入图像分析软件，开始分析。然后使用光标勾画出血管管腔区域的轮廓。

手部干燥是必要的，因为它可以避免因血细胞附着在血管壁等造成的伪影。以类似方式继续分析横截面图像。当流经孵育室的条件从一种变为另一种时，应分析每一张图像；但在条件不变的情况下，每隔一张图像分析一次即可。

低氧性肺血管收缩可在横切的前ASIN动脉的相差显微图像中观察到，该动脉与横切的支气管相邻。图像采集的时间点对应于图表中标记的圆圈所示时刻：测量开始时、使用U 466 19结束时、在低氧气体环境介质中暴露30或40分钟后的RAs处理结束时、用常氧气体环境介质洗涤后，以及最后再次应用U 466 19后的时刻。血管反应性以横切动脉管腔面积随时间的相对变化来记录。实验开始时的管腔面积定义为100%，血管收缩程度以相对于初始面积的比值表示。

在此情况下，为更清晰地展示低氧反应，低氧暴露可使管腔面积减少60%。本实验最初检测血管反应性的阶段未在此显示，将暴露于低氧环境前立即测得的数值设定为100%。本研究中检测的另一类血管是位于肺泡隔交界处的肺泡内小动脉。在本组实验中，为实现该目的，分析了非选择性线粒体ATP敏感性钾通道开放剂sidal对小肺泡内动脉低氧性肺血管收缩的影响。

将组织切片置于低氧培养基中孵育。在无或含有50微摩尔西达尔（sidal）的情况下，对照孵育在常氧气体培养基中进行，以便更清晰地展示对常氧、低氧或低氧加西达尔的反应。在暴露于常氧或低氧气体培养基前立即获得的数值设定为100%。暴露于松果体（pineal）的动脉未显示面积减小，而置于无添加物的低氧培养基中孵育的动脉则出现面积减小。

在常氧培养基中，管腔面积未见明显变化。本图展示了暴露于缺氧胃灌流液（无论是否添加50微摩尔的sida）的小型ASIN动脉的记录结果，数据以均值±标准误表示。图中数据为相对于缺氧孵育开始时数值的相对变化值。

未检测到血管反应性。在暴露于低氧气体的肺组织切片中，含有松果体的介质中由U 466 19诱导的血管收缩不受该药物影响。观看本视频后，您应充分了解如何制备镜面精度的肺组织切片，以及如何利用这些切片对位于肺泡隔膜处、直径在20至40微米之间的小肺内动脉，以及毗邻支气管和细支气管、直径在40至100微米之间的较大前肺动脉，进行血管反应性的定量测量。